Способ получения иммобилизованной @ -глюкозидазы
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу иммобилизации В-глюкозидазы. Целью изобретения является повышение выхода активности фермента при иммобилизации и его стабильности при хранении, а также улучшение качества целевого продукта за счет уменьшения содержания примесных ферментов. Способ заключается в адсорбции В-глюкозидазы из частично очищенного осаждением сульфатом аммония и хромотографии препарата, полученного из сока полыни, на конканавалин - А-сефарозе, отмывании носителя от неспецифически связавшихся белков и выдерживании его в растворе 0,3...0,6 М α -Метил-Д-маннозада, содержащем 5-15% этиленгликоля, в течение 8-12 ч при 0-5°. Использование способа позволяет увеличить выход активности фермента при иммобилизации на 18%, увеличить его стабильность при хранении, а также улучшить качество целевого продукта за счет снижения содержания в нем примесных белков. 1 з.п.ф-лы.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (5D 4 С 12 N 11/02
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4247624/31-)3 (22) 22.05.87 (46) 15.04.89. Бюл, Р 14 (71) Институт биохимии им. А.Н.Баха и Институт молекулярной биологи и биохимии АН КазССР (72) h А Магазова, В.М.Лахтин, P.М.Кунаева и В,В.Мосолов (53) 577.15(088.8) (56) Venardos D., Klei Н.Е,, Sundstrom D.W. Conwersion of cellobiose
to hlucose using immobilired Р-glucosidase reactors. Enzyme and !Ысгоbiological Technology, 1980, vol, 2, р. 11 2-116.
Moodward J., Wohlpact D.L. Properties of native and immobilized preparations of P-D-glucosidase and Eiotechnology, 1982, vol. 32, Р 4, р.547-552. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ Р -ГЛЮКОЗИДАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, .а именно к способу иммобиИзобретение относится к биотехно— логии, а именно к способу иммобилизации -глюкозидазы из сока полыни.
Цель изобретения — повышение выхода активности фермента при иммобилиаации и его стабильности при хранении, а также улучшения качества целевого продукта за счет уменьшения ! содержания примесных ферментов.
Способ заключается в том, что в качестве источника Р-глюкоэидазы используют частично очищенный сульфатом аммония и хроматогрофина препа »
„„Я0„„1472504 лизации  — глюкозидазы. Целью изобретения является повышение выхода активности фермента при иммобилизации и его стабильности при хранении, а также улучшение качества целевого продукта за счет уменьшения содержания примесных ферментов. Способ заключается в адсорбции В-глюкозидазы из частично очищенного осаждением с сульфатом аммония и хромотографии препарата, полученного из сока полыни, на конканавалин-А-сефарозе, от— мывании носителя от неспецифически связавшихся белков и выдерживании его в растворе 0,3...0,6 М М.-!lerHnD-маннозада, содержащем 5-15ã. этилена гликоля, в течение 8-12 ч при 0 — 5
Использование способа позволяет увеличить выход активности фермента при иммобилизации на 18Х, увеличить его стабильность при хранении, а также улучшить качество целевого продукта за счет снижения, содержания в нем примесных белков. з.п. ф-лы.
2 рат, выделенный из сока полыни и содержащий примеси P-ãàëàêòoçööàçû и ряда баластных белков, который инкубируют в присутствии конкановалин
А-сефароэы в течение 40-90 мин при о 1
0-5 С. После адсорбции /3-галактози— дазы к сорбенте проводят отмывание неспецифически связавшихся белков, затем удаляют избыток жидкости и вы— держивают препарат 0,3-0,6 М растворе
Ы;метил-D-манозида, содержащем 5-157 зтиленглиноля, в течение 8-12 ч при о
0-5 С. Добавление 06 -метил-D-манно1472504 энда позволяет провести десорбцию -галактозидазы и других белковых примесей, а добавление этиленгликоля способствует отделению белковых примесей. Использование предлагаемого способа позволяет повысить вы-. ход активности фермента при иммобилизации (от 82 до 100X) увеличить
его стабильность при .хранении и улучшить качество целевого продукта эа счет уменьшения содержания примесных ферментов (P-ãàëàêтозидазы).
Пример 1. Ферментный препарат, полученный из сока полыни осаждением сульфатом аммония в интервале насыщений 30-807. с последующей хроматографией на KN-целлюлозе и тойоперле-55, содержащий / -глюкозидазу с активностью 1,36 ммоль/ми на мг бел-. ка и Р-галактозидазу с активностью
6, 2 ммоль/мин на мг белка диализуют против 0,02 M Na-ацетатного буфера рН 6,5, содержащего 0,15 M хлористый натрий, 1 мМ хлористый марганец и 25
1 мМ хлористый кальций (буфер А), 2 мл сорбента, содержащего 20 мг конканавалин-А, конъюгированного с сецарозой 4В (конканавалин-А-сефароза
° 4В фирмы Фармация, Швеция), промывают 10-кратным объемом буфера А. Подготовленный таким образом сорбент суспендируют в колонке с 2 мл раствора частично очищенного ферментного препарата, содержащего 10 мг белка, и оставляют в холодильнике. на 90 мин. З5
Затем колонку промывают буфером А для удаления несвязавшегося материала и проводят десорбцию с носителя р-галактозидазы. Для этого гель отжимают от избытка жидкости, суспендируют его в 1,5 мл 0,3 M раствора
aL-метил-D-манноэида в буфере А и помещают колонку в холодильник. Через
l2 ч проводят элюцию тем же раствором оь"метил-D-маннозида до исчезновения в элюате активности Р -галактозидазы. Кроме Р-галактозидазы, элюат содержит неактивные белки. Концентрация неактивности белка в элюате и, следовательно, чистота иммоби-: лизованного препарата увеличиваются на 57 при добавлении в элюент 5% этиленгликоля (относительное увеличение содержания балластных белков определяют методом аффинной хроматографии путем сравнения площадей соответствующих белковых пиков в элюате) .
Иммобилизованный препарат полностью сохраняет исходную активность P-ãëþêîýüùàçû и не проявляет активности -галактозидазы. Активность препарата через 30 дней хранения — 0,58 ммоль/мин на мг белка т.е. 437 от исходной, Препарат, полученный по известному способу, сохраняет 80 исходной активности -глюкозидазы, а через 30 дней хранения — лишь 317. от начальной иммобилизованной активности.
Пример 2. Способ осуществляют согласно примеру 1, но инкубацию носителя с ферментным раство.ром проводят в течение 40 мин, а десорбцию — в течение 8 ч 0,6 M раствором oL-метил-D-маннозида в буфере А.
Результаты аналогичны, полученным в примере 1.
Пример 3. Способ осуществляют согласно примеру 1, но в раствор Ы.-метил-D-маннозида добавляли
151 этиленгликоль. Содержание балластных неактивных белков в элюате на, 10/ выше, чем беэ добавления этиленгликоля. Другие показатели аналогичны полученным в примере 1.
Интервал концентрации раствора е -метил-Р-маннозида и времени выдерживания, указанные в примерах 1-3 являются для десорбции Р-галактозидазы. При меньшей концентрации oL-метилЭ-маннозида и более короткой инкубации не происходит полная десорбция /}-галактоэидазы и других неактивных белковых примесей, а более длительная инкубация не увеличивает десорбции; увеличение концентрации .
oL-метил-D-маннозиды приводит к увеличению вязкости раствора, вызывающему снижение скорости элюции балласт- ных белков.
Для более полного удаления неактивных балластных белков, загрязняю-. щих сорбент, в :.раствор о -метил-Dманнозида целесообразно добавлять
5-15$ этиленгликоль. При меньшей концентрации не происходит достаточной десорбции неактивных белков, а ,концентрации более 15 способны частично инастивировать фермент.
Таким образом, использование данного способа позволяет увеличить выход активности фермента при иммобилизации от 82 до 1007, его стабиЬь10
Составитель В.Иуронец
Редактор И.Сегляник Техред., Л.Сердюкова Корректор В,Романенко
Заказ 1674/28 Тираж 501 Подписное
ВНЙИПИ Государственного комитета о изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, 5-35, Раушская наб., д. 4/5
J»
Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 10!
6 .147250 ности при хранении (эа 30 дней активность полученного препарата снижается до 43Х, а фермента, иммобили- / . зованного известным способом, до
31X) а также улучшить качество целевого продукта за счет уменьшения содержания примесями ферментов, (p-галатозидиэы). формула изобретения
1. Способ получения иммобилизованной Р -глюкоэидазы, включающий инкубацию источника фермента .с конканавалин-А-сефарозой и отмывание полу- 15 ..ченного препарата от несвяэавшихся примесей, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода активности фермента при иммобилиза4 6 ции и его стабильности при хране-.
I нии, а также улучшения качества 4елевого продукта за счет уменьшения содержания -примесных ферментов, в качестве источника фермента используют частично очищенный препарат P --глюкоэидазы иэ сока полыни, а после стадии отмывания удаляют ,избыток жидкости и выдерживают препарат в 0,3-0,6 M растворе Ы -метилD-манноэида, содержащем 5-15% этиленгликоля, в течение 8-12 ч при 0-5 С.
2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что частичную очистг-. ку ведут осаждением сульфатом аммония в интервале -насыщения 30-80 с последующей хроматографией и диализом.
