Способ очистки антител к тиреоидным гормонам

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для аффинной очистки антител к тироксину и трийодтиронину. Способ позволяет упростить получение и повысить аффинность получаемых антитиреоидных антител. Для этого антисыворотку инкубируют с аффинным сорбентом с содержанием тиреоидного гормона, в 5 - 20 раз превышающим максимальную связывающую емкость антител в антисыворотке, и далее промывают раствором NaOH с pH 10,0 - 12,0, а затем осуществляют десорбцию антител 15 - 50% -ным водным раствором ацетонитрила при pH 2,0 - 4,0. 2 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для аффинной очистки антител к тиреиодным гормонам. Цель изобретения - повышение аффинности антител и упрощение способа получения антитиреоидных антител. Способ осуществляется следующим образом. Антисыворотку к тиреоидному гормону (Т₄ или Т₃) однократно инкубируют с аффинным сорбентом, который представляет собой тиреоидный гормон, иммобилизованный на нерастворимой матрице (например, Т₃ - или Т₄-сефароза), в которой содержание тиреоидного гормона в 5-20 раз превышает максимальную связывающую емкость антител в составе сыворотки, посторонние сывороточные белки удаляют промывкой аффинного сорбента щелочным раствором с рН 10-12, а десорбцию антител осуществляют 15-50% -ным раствором ацетонитрила в воде, подкисленным до рН 2,0-4,0. П р и м е р 1. Очистка антител к тироксину. В качестве исходного материала используют 2 мл кроличьей антисыворотки, максимальная связывающая емкость которой составляет 2,64˙10^-8 моль Т₄. Аффинным сорбентом служит Т₄-сефароза, содержащая 5˙10^-7 моль Т₄ на 1 мл уплотненного геля. Таким образом, для насыщения антисыворотки необходимо 0,053 мл геля Т₄-сефарозы, а 10-кратный избыток составляет примерно 0,5 мл. К 20 мл раствора антисыворотки, разбавленной в 10 раз, прибавляют 0,5 мл геля Т₄-сефарозы и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. Затем суспензию переносят в хроматографическую микроколонку и промывают водным раствором щелочи с рН 11,0 (примерно, 0,001 М NaOH) до исчезновения примесных белков в элюате. Адсорбированные антитела элюируют 20% -ным раствором ацетонитрила, подкисленным до рН 2,9. Полученный препарат антител при электрофорезе дает одну белковую полосу, по электрофоретической подвижности соответствующую иммуноглобулину G. Удельная активность препарата составляет 11,6 мкмоль/г или 93% от теоретической. Значения параметров качества приведены в табл. 1. П р и м е р 2. Очистка антител к трийодтиронину. В качестве стартового материала используют 1 мл кроличьей антисыворотки, максимальная связывающая емкость которой составляет 1,08 х 10^-8 моль Т₃. Аффинным сорбентом служит Т₃-сефароза, содержащая 2 х 10^-7 моль Т₃ на 1 мл уплотненного геля. Таким образом, для насыщения антисыворотки необходимо 0,054 мл геля Т₃-сефарозы, а 10-кратный избыток составляет примерно 0,5 мл. Дальнейшие операции проводят, как описано в примере 1, за исключением того, что используют 10 мл раствора антисыворотки, разбавленной в 10 раз, а элюцию адсорбированных антител осуществляют 30% -ным раствором ацетонитрила, подкисленным до рН 2,9. Значения параметров качества очищенных антител к Т₃ приведены в табл. 2. Антитела, очищенные по предлагаемому способу, имеют более высокое качество, чем антитела, полученные по прототипу, так как имеют лучшие параметры качества в момент выделения и сохраняют их при хранении, лиофилизации и замораживании. Эти характеристики антител имеют решающее значение для производства средств иммунохимического микроанализа. Упрощение достигается исключением стадии преципитации сернокислым аммонием (NH₄)₂SO₄ и многократной инкубации с Т₄(Т₃)-сефарозой и за счет использования 5-20-кратного избытка аффинного сорбента по отношению к связывающей способности антител и применению щелочного раствора для удаления посторонних белков, которые в способе-прототипе удаляются (NH₄)₂SO₄-преципитацией. (56) Gembicki M. , Polanska A. , Kosowicz I. , "Radioimmunoassay and related procedure in medicine" - Proc. Sympos. Vienna. 21-25 June, 1982, IAEA. p. 95-104.

Формула изобретения

СПОСОБ ОЧИСТКИ АНТИТЕЛ К ТИРЕОИДНЫМ ГОРМОНАМ, включающий инкубирование антисыворотки с тиреоидным гормоном, иммобилизованным на нерастворимом носителе, промывку аффинного сорбента и десорбцию антител, отличающийся тем, что, с целью повышения аффиности антител и упрощения способа, используют иммобилизованый антиген с содержанием тиреоидного гормона, в 5 - 20 раз превышающим максимальную связывающую емкость антител в антисыворотке, промывку ведут раствором NaOH с рН 10,0 - 12,0, десорбцию осуществляют 15 - 50% -ным водным раствором ацетонитрила при рН 2,0 - 4,0.

РИСУНКИ

Рисунок 1