Способ получения токсинопродуцирующих субкультур холерных вибрионов

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам получения культур холерных вибрионов, продуцирующих холерный токсин. Цель изобретения - упрощение способа. Культуру исследуемого штамма холерного вибриона выращивают в течение 4-5 ч в жидкой щелочной среде с 0,05-0,2% инозина (PH 7,8-8,0). Для получения изолированных колоний выращенную бульонную культуру высевают на 2%-ную агаровую среду того же состава и инкубируют 18-20 ч при 37°С. Токсигенные свойства холерных вибрионов, составляющих отдельную колонию, определяют известным способом. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н A ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

Г1О ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

1 (21) 4304223/28-13 (22) 03.09.87 (46) 15.11.89. Sion. Р 42 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) В.В.Лобанов (53) 576.8.093.33 (088.8} ,(56 ) Bl a chmann U. e t . al . U ibr io

cholerae production of toxin by а nonpathogenic strain. — I.Inf.

Dis, 1970, 122, N б, р.540-543.

Лобанов В.В., Пасюкова Н.И. Выделение субкультур, образующих холерный токсин in vitro из кишечника инфицированных кроликов-сосунков. Ростов-на-Дону, 1985 (рукопись депони рована, Р 3890-85, Деп) .

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается способа активизации токсинопродуцирующих культур холерных вибрионов.

Цель изобретения - упрощение способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Культуру исследуемого штамма хо"

О лерного вибриона выращивают при 37 С в течение 4-5 ч в жидкой среде, состоящей из 3%-ной пептонной воды, 0,5% хлористого натрия и 0,05-0,2% инозина (рН 7,8-8,0). Для получения изолированных колоний выращенную бульонную культуру высевают на 2%-ную агаровую

„.SU„,1521 0 А1 (51)4 С 12 N 1/20, (С 12 N 1/20, С 12 R 1:63) 2

{54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОКСИНОПРОДУЦИРУН)ЩИХ СУБКУЛЬТУР ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам получения культур холерных вибрионов, продуцирующих холерный токсин. Цель изобретения — упрощение способа. Культуру исследуемого штамма холерного вибриона выращивают в течение 4-5 ч в жидкой щелочной среде с 0,05-0,2% инозина (рН 7,88,0). Дпя получения изолированных колоний выращенную бульонную культуру высевают íà 2%-ную агаровую среду того же состава и инкубируют 1820 ч при 37 С. Токсигенные свойства холерных вибрионов, составляющих от- ф дельную колонию, определяют известным способом. t табл. С: среду того же состава и инкубируют ь

18-20 ч при 37 С. Токсигенные свой- ам) ства холерных вибрионов, составляющих отдельную колонию, определяют известным способом.

Пример 1. Культуру Uibri

cholerae 569В в течение 4 ч выращива- о ют при 37 С в 4 мл среды следующего состава, г/100 мп: пелтон (мясной для бектериологических целей) 3; хлористый натрий 0,5; инозин 0,05; вода дистиллированная остальное, рН 8,0.

После окончания выращивания бульонную культуру пересевают на плотную (2%-ную агаровую) среду такого же состава с целью получения иэолирован1521770 ных колоний и инкубируют при 37 С

18-20 ч.

Субкультуры, полученные из изолированных колоний исследуют на споВ

5 собность продуцировать холерный токсин, для чего часть материала каждой из отобранных колоний засевают на З ную пептонную воду с 0,5 . NaC1 (рН

7,8-8,0), разлитую по 2 мл в 100-миллилитровые стерильные флаконы с ватно-марлевой пробкой. Выращивание проводят при 37 С в течение 20 ч. После окончания срока выращивания культуры обеээараживают мертиолатом (1;5000), центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин и надосадочную жидкость исследуют на наличие фактора кожной проницае" мости в цельных и разведенных препа.ратах на модели кролика (внутрикожная проба Крейга) .

Из 20 субкультур штамма 569В все

20 продуцируют в среду культивирования фактор кожной проницаемости, оказывающий действие на кожу кролика при >5 разведении надосадочной жидкости 1:20, При разведении 1:40 такую активность проявляют 6 субкультур, 1:80 — 13, 1: 160 — i .

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1 но в состав среды

30 вводят 0,1 .инозина. Используют 2 штамма — V.cholerae 569В и V ° eltor

Р5879.

В результате исследования 20 субкультур штамма 569В все культуры про-35 дуцируют в среду культивирования фактор кожной проницаемости, оказывающий действие на кожу кролика при разведении надосадочной жидкости 1:

:20. При разведении 1:40 такую ак- 40 тивность проявляют 8 субкультур, 1:80-9, 1:160-3 °

Из 125 субкультур штамма Р5879 фактор кожной проницаемости обнаружен у 17 при введении цельных и раз45 веденных 1:2 препаратов надосадочной жидкости. В более высоких разведениях при постановке кожной пробы он не проявлялся.

Пример 3. Проводят анало- 50 гично примеру 1, В среду вводят 0,2% инозина. В результате среди 20 субкультур штамма 569В все 20 продуцируют фактор кожной проницаемости в титре 1:20, 18 - 1:40, 2 — 1:80 и не 55 продуцнруют токсин при разведении надосадочной жидкости бульонных культур 1:160.

Результат влияния пассажей через кишечник кролика-сосунка и среду с инозином на количество выделяемых клоновых субкультур штамма V.cholerae 569B "Пакистан" приведены в таблице. . токсиноо бразующих из числа

Субкультуры

ИзученТоксинообные (общее число) разующие (титр токсина

: 10) изученных

Исходные 100 20

Пассированные через кишечник 50 36 72 среду с инозином 25 17 68

Таким образом, предлагаемый способ значительно проще способа-прототипа при сохранении его эффективности, так как не требует использования лабораторных животных, создания специальных условий для их вскрытия.

Способ позволяет также в дальнейшем получить количественную характеристику культур по изучаемому признаку. При его использовании можно выделить гиперпродуценты среди субкультур производственных штаммов холерного вибриона, создать коллекцию штаммов холерных и эльтор вибрионов с различной способностью продуцировать холерный токсин, что необходимо для проведения генетических исследований.

Способ дает возможность с помощью изучения токсинпродукции клоновых культур провести анализ популяции в довольно большом объеме (до 100 одно" моментно) с сохранением этого генетического материала для дальнейшего получения необходимых характеристик.

Формула из о бр етения

Способ получения токсинопродуцирующих субк чтьтур холерных вибрионов путем активации исходной культуры с последующим пересевом на плотную щелочную питательную среду и определения токсинообразующей активности изолированных колоний, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью упрощеI

Составитель А.Завадская

Техред Л.Олийнык Корректор Т.Малец

Редактор Н.Киштулинец

Заказ 6892/24 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина, 101

5 1521770 6 ния способа, активацию осуществляют ние на плотной питательной среде вев жидкой питательной среде в присут-. дут в присутствии иноэина в той же ствии 0,05-0,2Х иноэина и выращива- концентрации.