Способ получения l-лизин- альфа -оксидазы

 

Изобретение относится к микробиологии и касается получения оксидаз аминокислот, а именно L-лизин-α-оксидазы. Цель изобретения - сокращение сроков культивирования продуцента и повышение удельной активности фермента. Способ заключается в том, что продуцент Trichoderma harzianum Rifai F-180 выращивают на среде следующего состава, мас.%: пшеничные отруби 4 - 6; источник неорганического азота 0,7 - 0,9; вода остальное. pH среды 5,5 - 6,0. Продуцент культивируют глубинным способом при аэрации 100 - 130 об/мин. Способ позволяет получать L-лизин-a-оксидазу с удельной активностью до 1,2 Е/мг белка. 7 табл.

Изобретение относится к микробиологическому производству L-лизин-α-оксидазы фермента, катализирующего реакцию окислительного дезаминирования L-аминокислот с образованием a-кетокислоты, и может быть использовано в химии, микробиологии, медицинской и ферментной промышленности. Цель изобретения повышение удельной активности фермента и сокращение сроков культивирования. Способ осуществляют следующим образом. В качестве продуцента используют штамм Trichoderma harzianum Rifai F-180. Для получения культуральной жидкости посевной материал (косяки с культурой) выращивают на среде сусло-агаре в течение 14 сут в термостате при 28^oC. С целью получения инокулята для глубинного культивирования используют среду с пшеничными отрубями, имеющую следующий состав: пшеничные отруби 20 г; NaNO₃ 11,4%-ный раствор 1,4 мл; H₂O 10 мл. Инокулят выращивают в термостате при 28^oC в течение 12 14 сут и используют для посева на ферментационную среду. Ферментацию триходермы проводят в колбах на 250 мл на термостатированном встряхивателе типа 357 (ПНР) при 28^oC в течение 5 сут, амплитуда N 6, 120 об/мин. Ферментационная среда имеет следующий состав: пшеничные отруби 5 г; NaNO₃ 0,9 г; H₂O до 100 мл. Начальный pH среды 5,5 6. Количество инокулята, выросшего на твердой среде с пшеничными отрубями, составляет 0,5 1 г от всего количества. Trichoderma sp. выращивается глубинным способом в течение 4 5 сут при 28^oC. Полученную недостаточную жидкость используют в качестве источника фермента. Активность оксида L-аминокислот определяют спектрофотометрически по количеству образующейся в процессе ферментативной реакции H₂O₂. За единицу активности фермента принимают количество фермента, катализирующего образование 1 нмоль H₂O₂ за минуту в стандартных условиях на 1 мл жидкости или 1 мг белка. Влияние количества пшеничных отрубей на L-лизин-a-оксидазную активность гриба приведено в табл. 1. Влияние количества источника азота на L-лизин-a-оксидазную активность гриба приведено в табл. 2. При уменьшении количества NANO₃ уменьшает синтез фермента, а повышенное содержание его способствует подщелачиванию среды, что снижает рост культуры гриба. Влияние исходного pH среды на биосинтез L-лизин-a-оксидазы Trichoderma sp. (5-е сутки роста) приведено в табл. 3. Влияние различных источников азота на биосинтез L-лизин-a-оксидазы приведено в табл. 4. Как видно из табл. 4, биосинтез фермента глубинным способом осуществляется при использовании различных форм неорганического азота. Влияние аэрации на L-лизин-a-оксидазную активность Trichoderma sp. приведено в табл. 5. Способ поясняется примерами. Пример 1. Выросшую культуру Trichoderma harzianum Rifai F-180 на сусло-агаре в течение 14 сут в термостате при 28^oC переносят на среду с пшеничными отрубями, имеющую следующий состав: пшеничные отруби 10 г; NaNO₃ 0,85 г; H₂O 10 мл, и выращивали в тех же условиях 14 сут. Инокулят (гриб с пшеничными отрубями) в количестве 0,5 г переносят в колбу на 250 мл со средой, имеющей следующий состав: пшеничные отруби 4 г; NaNO₃ 0,7 г; вода до 100 мл. Начальный pH среды составляет 5,5. Культивирование продуцента ведут в условиях аэрации на встряхивателе типа 357 (ПНР) при 28^oC при 130 об/мин с амплитудой N 6. Культуру в этих условиях выращивают в течение 5 сут. Полученную таким образом культуральную жидкость используют для выделения фермента. Активность L-лизин-a-оксидазы определяют спектрофотометрическим способом по количеству образующейся в процессе ферментативной реакции H₂O₂. За единицу активности фермента принимают количество фермента, катализирующего образование 10 нмоль H₂O₂ за минуту в стандартных условиях на 1 мл жидкости или 1 мг белка. Активность фермента составляет 0,8 Е/мг белка. Пример 2. Выросшую культуру Trichoderma harzianum Rifai F-180 на сусло-агаре в течение 14 сут в термостате при 28^oC переносят на среду с пшеничными отрубями, имеющую следующий состав: пшеничные отруби 10 г; NaNO₃ 0,85 г; H₂O 10 мл, и выращивают в тех же условиях 14 сут. Инокулят (гриб с пшеничными отрубями) в количестве 0,5 г переносят в колбу на 250 мл со средой, имеющей следующий состав: пшеничные отруби 6 г; NaNO₃ 1,5 г; вода до 100 мл. Начальный pH среды составляет 6. Культивирование продуцента проводят в течение 5 сут. Полученную таким образом культуральную жидкость используют для выделения фермента. Активность L-лизин-a-оксидазы гриба определяют указанным в примере 1 способом. Активность составляет 0,6 Е/мг белка. Пример 3. Посевной материал Trichoderma harzianum Rifai F-180 выращивают по примеру 1. Ферментационная среда имеет следующий состав: пшеничные отруби 5 г; NaNO₃ 0,9 г; воды до 100 мл. Начальный pH среды 5,8. Культивирование продуцента проводят в течение 5 сут в условиях аэрации при 120 об/мин при амплитуде N 6. Активность L-лизин-a-оксидазы гриба, выращенного в этих условиях, составляет 1,2 Е/мг. белка. Пример 4. Посевной материал Trichoderma harzianum Rifai F-180 получают по примеру 1. Далее продуцент культивируют глубинным способом на среде, аналогичной среде примера 1, и поверхностным способом на среде: пшеничные отруби 10 г; NaNO₃ 0,79 г; вода 10 мл. Активность L-лизин-a-оксидазы при разном способе выращивания представлена в табл. 6. Как видно из табл. 6, при глубинном культивировании максимум образования фермента приходится на 5 сут роста, в то время как при поверхностном выращивании культуры на 8-е сут роста. Однако при глубинном способе выращивания существенное значение приобретает используемая среда для роста посевного материала, необходимым компонентом которой является пшеничные отруби. Влияние среды посевного материала на активность фермента при использовании разных способов выращивания приведено в табл. 7. Технология получения исходного продукта для выделения и очистки оксидаз a-аминокислот с помощью глубинного культивирования имеет еще одно преимущество: гриб имеет ограниченное распространение (колба, ферментер). При поверхностном выращивании грибом поражается не только оборудование, люди, но и также окружающая среда.

Формула изобретения

Способ получения L-лизин-альфа-оксидазы, предусматривающий приготовление посевной культуры продуцента Trichoderma harzianum Rifai F-180, получение инокулята, внесение его в ферментационную среду, содержащую в качестве источника углерода пшеничные отруби, источник неорганического азота и воду, последующее культивирование в условиях аэрации до максимального накопления целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью сокращения сроков культивирования продуцента и повышения удельной активности фермента, культивирование проводят глубинным способом, а компоненты ферментационной среды берут в следующем соотношении, мас. Пшеничные отруби 4 6 Источник неорганического азота 0,7 0,9 Вода Остальное при этом pH среды устанавливают 5,5 6,0, а культивирование осуществляют в условиях аэрации из расчета 100 130 об./мин.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 03.03.2001

Номер и год публикации бюллетеня: 19-2003

Извещение опубликовано: 10.07.2003        

---