Штамм бактерий bacillus тнuringiеnsis, используемый для получения энтомопатогенных препаратов

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения энтомопатогенных бактериальных препаратов, а именно нового штамма бактерий BACILLUS THURINGIENSIS для их производства. Цель изобретения - создание нового штамма бактерий BACILLUS THURINGIENSIS VAR. KURSTAKI, обладающего устойчивостью к фагам, наиболее часто поражающим культуру в производственных условиях и сохраняющего продуктивность на уровне известных штаммов. Штамм бактерий BACILLUS THURINGIENSIS подвида KURSTAKI получен из штамма B. THURINGIENSIS подвида KURSTAKI Z-52 в результате мутагенной обработки нитрозогуанидином. Ему присвоен N Z-86. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов под коллекционным номером ВКПМ В-3827. Штамм не отличается от известного по продуктивности, токсичности для насекомых, и фагоустойчив к фагам К, Э, Т<SB POS="POST">Д</SB>18, Т<SB POS="POST">Д</SB> 81, Т<SB POS="POST">Д</SB> 20 Т<SB POS="POST">Д</SB> 101. 1 табл.

СОЮЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 А 01 N 63/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4334678/30-13 (22) 30.11.87 (4b) 23.12.89. Вюл. М- 47 (71) Всесоюзный научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии (72) 3.Р. Зурабова, Р.Р. Азйзбекян, Е.M. Нетыкса, Т.II. Круглякова, М.К. Дергллюк, А.И. Пахтуев и P.Ï. Комарских (53) 576.8:632.937(088.8) (56) А«торское свпдетельст«о СССР

11 - 769787, кл. A 01 N 63/00, 1979. (54) ШТАИ1 HAKTLÐÈ1I BACILLUS THURINGIENSIS, ИСП011ЪВУЕЖЙ 11ЛЯ ПОЛУЧЕНИ51

ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается получения эHToMQ патогенных блктериальных препарл ro«, а именно нового штамма бактерий Bacillus rhuringiensis для их производстИзобретение относится к области биотехнологии и касается получения знтомопатогенных бактериальных препаратов, а именно нового штамма бактерий для их получения Вас.rhuringien$1$

Цель изобретения — создание нового штамма бактерий Bacillus rhuringiensis var. kurstaki, обладающего устойчивостью к фагам, наиболее часто поражающим культуру в производственных условиях, и сохраняющего продуктивность на уровне известных штаммов.

Штамм 6aKreprrA Bacillus rhuringiensis var. kursraki получен обратной

„„SU„„1 30159 А1 ва. Цель изобретения — создание нового штамма бактерий Bacillus rhuringiensis var kursraki обладающего устойчивостью к Алгам, наиболее часто поражающим культуру в произ«одственных условиях, и сохраняющего продуктивность на уровне известных штаммов.

Штамм бактерий Bacillus rhuringiensis подвига kursraki получен из штамма В.r.huringiensis подвида kuzsсaki

4-52 в результате мутлгенной обработки нитрозогуанидином. Ему присвоен

11- 4-86. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно †исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов под коллекционным номером ВК1П1

В-3827. Штамм не отличается от из«естного по продуктивности, токсичности для насекомых и Аагоустойчив к д>лглм

T*20 Т> 101 . 1 r«6rr .

N-метил-3-нитро-1-нитрозогулнидином в концентрации 50 мкг/мл при 37"С и ,,последующей селекции на Аагоустойчивость, в результате чего был выделен штамм Bacillus rhuringiensis var. kursr.aki 4-86.

Штамм депонирован «о Всесоюзнс и коллекции промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследо«лтс«r ского института генетики и селекци и промышленных микроорганизмов под коллекционным номером ВКПМ-В-3827.

Полученный штамм характеризуется следующими свойст«лмн.

Морфолого-культурлльные с«л .ст«,i.

1530159

Аэроб. Грамположителен. Вегетативные клетки — крупные палочки с закругленными концами, расположенные одиночно, парами или цепочками. Цепочки короткие. Размер клеток составляет (1,7-1,9)х(3,5-6,9) мкм. Морфологической особенностью является наличие в одном спорангии двух белковых патогенных для насекомых параспоральных 10 включений — кристалл-токсинов ромбовидной и квадратной формы с четкими гранями.

Указанная форма клеток характерна для любой твердой питательной среды: агар Хоттингера; MIIA, пептоно-кукурузный агар. Штамм Вас.rhutingiensis

var. kurst.aki 4-86 хорошо растет при

28-37 (; оптимальная температура

30 С.

Мяоопептонный бульон. Образует сплошную пленку, гладкую, рыхлую, опадающую через 48-72 ч. Росе умеренный.

Желточная среда. Образует колонии 25

К-формы, крупные, плоские с шероховато-матовой поверхностью, маслянистой консистенции, белого цвета. Рост обильный, Лицетин белка не расщепляет.

Ломтики картофеля. Образует колонии К-типа, крупные, плоские с шероховатой матовой поверхностью, маслянистой консистенции, Рост обильный.

Пигмент не образует, Молочный агар ° Образует колонии

К-формы, крупные, с шероховатой ма35 товой поверхностью, маслянистой консистенции. Колонии белого цвета, вокруг которых об разуется, эона просветления до 20 мм. Рост обильный.

Пептоно-кукурузный агар. Образует колонии R-формы, крупные, плоские с шероховатой матовой поверхностью,маслянистой консистенции, с ветвистым краем. Рост обильный.

Кровяной агар. Образует колонии

К-формы, крупные с ветвистым краем.

Поверхность шероховатая, матовая, маслянистой консистенции, белого цвета.

Вокруг колонии образуется светлая прозрачная зона гемолиза до 20 мм.

Рост обильный ° Возраст культуры при описании колоний на твердых средах

24 ч.

Физиолого-биохимические свойства.

Дает положительную реакцию Фельгена, выделяет в культуральную жидкость протеазу, обладающую казеинолиф тической активностью 90х10 протеол. ед./мл, фибринолитической активностью

800 усл ° ед./мл, а гемолитической активностью (гемолиз типа P).

Для определения гемолитической способности применяли мясопептонный агар с добавлением 51 дефибринированной

KpoBlf, Гемолиз (лизис эритроцитов) узнавали по образованию светлой прозрачной эоны вокруг выросшей колонии или штриха. Гемолитическую активность выражали в миллиметрах радиуса зон просветления.

Фибринолитическую активность оценивали по величине зоны лизиса фибрина, образующейся при помещении фибриновой пластинки в термостат при температуре 37 (, на 3 ч, и выражали в условных единицах в пересчете на 1 ил культуральной жидкости. Одна условная единица равна зоне лизиса в 10 мм .

В работе использованы фибриноген, фибринолизин и плазма крови.

Каэеинолитическую активность определяли на молочном arape.

Не способен к образованию лецитиназы.

Отношение к источникам углерода.

Использует глюкозу, цитрат, декстрозу, эскулин, салицин, лобиоэу, мальтозу, кукурузный и картофельный крахмал, соевую и кукурузную муку, кукурузный экстракт, Не использует лактоэу, арабинозу, рамноэу, глицерин, сахарозу, маннозу, маннит, ксилозу.

Отношение к источникам азота, Усваивает нитратные и аммонийные формы азота.

Органические источники азота, используемые данным микроорганизмом: пептоны (продукты псреваривания мяса и каэеина); мясные, рыбные и растительные экстракты (кукурузный, дрожжевой и др.) или настои; мука из семян хлопчатника, соевая, кукурузная, рыбокостная; атолизаты дрожжей и казеина; гидролизаты (из соевых бобов, кукурузной и осевой муки); кормовые дрожжи (ББК); кровь крупного рогатого скота; мясная вода; мочевина. Нитриты восстанавливают молоко. Нептоницирует желатину, н разжижает крахмал, гилролиэует алтигенные свойства.

Относится к III ceротипу. (Н 3а Н

Зв). Не продуцирует гермостабильный

S-экзотоксин. Дат гвввн для многих насекомых отряда :, K pl lrrl IF..

153»159

Не отличаясь по перечисленным свойствам от известнuго, пп амм характеризуется устойчивостью к ряду фагов, наиболее часто поражающих куль5 туру в производственных условиях, которые имеют удлиненный капсид и структуру типа воротничка, расположенную между капсидом и коротким отростком.

Подобные фаги выделены иэ фаголиэатов. Эта группа фагов широко распространена и дает высокий относительный урожай (титр фага из одной негативной колонии) — до 9,0х 10 фаговых частиц/мл, а также высокий абсолютный 15 урожай: при размножении на чувствительной культуре титр достигает 1,0х х10 фаговых частиц/мл (bOE/мл). Для » определения устойчивости к фагам на чашку Петри с нижним слоем — средой 70

Хоттингера (2/), выливают 0,3 мл агариэованной (0,7N) солевой среды и

О, 1 мл испытуемой культуральной жидкости (3,5 ч б.Хоттингера). После того, как среда застынет, петлей нано- 25 сят препарат Aara (концентрация фага

Ф не ниже 1 10 ) . Наличие или отсутствие эоны лизиса свидетельствовало о чувствительности или устойчивости испытуемого варианта (штамма) к данно- 30 му фагу.

Сравнительная характеристика шгамма Вас.thuringiensis var. kuzsraki

4-86 и известного штамма Вас. rhuringivnsis var. kursraki 4-52 приведена в следующей таблице .

Таким образом, представленные данные показывают, что штамм Вас. rhuringit=nsis var kursraki Е-86 не отличается от известного по продуктив- 40 ности и биологической активности, но дополнительно фагоустойчив .

Пример. В параллельном опыте в 20 колб емкостью 750 мл было внесено по 30 мл среды, содержащей, г/л: 45 кормовые дрожжи 20,0; кукурузную муку 15,0; воду остальное. До стерилизации рН среды 7,4-7,6. Половина колб засевают штаммом Вас. thuringiensis

uar. kursraki 4-86, а остальные— штаммом )3ac. rhurinpiensis var. kursraki 4-52. Посевная доза составляет

11. к объему. Культивирование ncymeствляют в одинаковых условиях при о температуре 30+1 С и при скорости вращения качалки 300 об/мин.После

22 ч культивирования средний титр спор составляет 3,81+», 19 для штамма

Вас.сангingiensis var, kursr aki 4-86 и 3,74+0,20 для штамма Вас.rhuri»8iensis var. kursraki Z-52 °

Споруляция культуры на производственной дрожжеполисахаридной среде (ЦИС) начинается 16- 18 ч, автолиз

21-22 ч.

Биомасса, выращенная на ферментационной питательной среде, состоит иэ 70Х спор и 30Ы параспоральных кристаллов, Ьиопробы на насекомых (биологическая оценка) определяют на гусеницах второго возраста трех видов чешуекрылых вредителей: непарном шелкопряде, капустной совки и пчелиной огневки.

Культивирование насекомых и постановку опытов проводят на специальных искусственных питательных средах. Инсектицидную активность бацилл определяют по интенсивности гибели опытных гусениц при свободном поглощении зараженного корма. Количество погибших гусениц с пересчетом на контроль подсчитывают на 5-е сут. ЛК О (в процентах и в миллионах спор на миллипитры) рассчитывают по формуле Кербера в модифнкации Ашмарина и Воробьева.

Практическое использование штамма позволяет сократить потери, имеющие место в результате лиэиса культуры наиболее распространенными н производстве фагами.

V о р м у л а и з о б р е т е и и я

Штамм бактерий Bacillus thurinpiensis var. kursraki ВКП11 В-3827, используемый для получения энтомопатогенных препаратов.

1530159 ение к фагам

01

2-86

2-52

Ф вЂ”вЂ”

24 95 3,81 0,19 0,019 0,46 19,8 620 6,3 150

24 97 3,73+0,23 0,017 0,43 18,4 604 5,9 149 + + + + + + +

П р н и е ч а н н е. Знак "+" означает чувствительность к фагу.

Знак "-" овначает устойчивость к фагу.

Состав среды ЦПС следуюаий, мас.I: кормовые дровни 2,0; кукуруэнан мука 1,5; вода остальное .

Ф /

Составитель И. Залунин

Техред Л.Олийнык Корректор Л. Бескид

Редактор J1. Гратилло

Заказ 7791/3 Тираж 421i Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

II tl

Производственно-издательский комбинат Патент, г.ужгород, ул. Гагарина,101