Штамм бактерий bacillus тнuringiеnsis var.теnевriоnsis для производства инсектицидного препарата против насекомых соlеортеrа spp.

 

Изобретение относится к сельско- Хоэяйственндй микробиологии, в уастности к производству инсектицидных Препаратов, и касается штамма бактерий , с помощью которого получают инсектицидный препарат. Цель изрбретения - получение нового штамма бактерий патотипа С, позволяющего получить инсектицидный пр-епарат против Col.eoptera. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. tenebrionis депонирован в коллекции ФРГ под № DSM 2803. Инсектицидный препарат, полученный на основе указанного штамма, предназначен для уничтожения ольхового листоеда и картофельного жука. Титр спор в препарате составляет 3 « -«Ю спор/МП, LC JP составляет 5 спор/мл при опрыскивании Lj-личинок Leptinotarsa deumlimata, 1 табл. СУ)

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3875505/28-13 (22) 19. 12. 84 (31) P 3346138.4 (32) 21,12.83 (33) DE (46) 30.12.88. Бюл. II 48 (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (DE) (72) Алоисиус Криг, Алоис Михаэль

Xyrep и Вол=фганг Шнеттер (DE} (53} 576.8.632.9(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

В 1081207, кл. С. 12 и 1/20, 1982 °

Патент CIIIA В 3285748, кл. 424-93, 1966.

Патент США В 3150062, кл. 424-93, 1964. (54) I!ITANM .БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS VAR, TENEBRI0NIS ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ИНСЕКТИЦЙДНОГО ПРЕПАРАТА

ПРОТИВ НАСЕКОМЫХ COLEOPTERA SPP.

„,SU „„1448995 А З (SD 4 А 01 N 63/00, С 12 N 1/20

//С 12 N 1/20, С 12 R 1:07) (57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к производству инсектицидных препаратов,.и касается штамма бактерий, с помощью которого получают инсектицидный препарат. Цель изобретения — получение нового штамма бактерий патотипа С, позволяющего полу- чить инсектицидный препарат против

Coleoptera. Штамм бактерий Bacillus

thuringiensis var. tenebrionis депонирован в коллекции ФРГ под II DSM

2803. Инсектицидный препарат, полученный на основе указанного штамма, предназначен для уничтожения ольхового листоеда и картофельного жука. 3

Титр спор в препарате составляет 3 « . «10 спор/мп, I.Ñ, составляет 5 х

«10 спор/мл при опрыскивании Ь,-ли4 чинок Leptinotarsa deumlimata, 1 табл.

1448995

Изобр е гение относится к сельс ко-, хозяйственной микробиологии, в частности K производству инсектицидных препаратов, и касается штамма бактерий, с помощью которого получают инсектицидный препарат.

Цель изобретения — получение нового штамма патотипа С„ позволяющего получить инсектицидный препарат про- 10 тив Coleo >tera spy.

Штамм Вас 11us thuringiensis var, сепеЬг1оп1s патотип С выделен из больных личинок мучного хрущака (Tenebrio molitor L), депонирован в кол- 15 лекции ФР:, под номером РЯМ 2803.

Штамм имеет следующие культурально-морфологические признаки.

Вегетативная клетка имеет жгутики. 20

Палочки размером около 1,0х4 — 8 мм.

Граммноложительные. Клетка споры содержит наряду с субтерминальными зллипсоидальными спорами (0„8x1 4

1,6 мм) параспоровый кристалл плоской "-5 пластинчатой формы и с очертаниями параллелограмма, ромба или квадрата (ок. 0,8-1,5 мкм длины кромок).

При выращивании штамма в течение

24 ч при 30 С на стерильной среде ЗО (OXOIg CN- 3), содержащей. г/л

Мясной экстракт "Lab Lemco" 1,0

Дрожжевой экстракт 2,0

Пелтон 5,0

NaC1i 5,0

Агар 15,0 рН 7,4 образуются круглые беловатые колонии . диаметром около 5 мм, шероховатые с неровными краями. Спорообразование р0 и образование парасноровых кристаллов .происходит приблизительно через 48 ч.

При культивировании штамма на кальций-казеинатном агаре (NKRCK 5409) состава, г/л

Мясной экстракт "Nerck" 3,0

Пептон 5 00

Казеин по Hammarsten 2,50

NaC1 5 00

«(OH) 0,15

Агар 13,50

Вода Остальное с добавлением сухого обезжиренного молока 5,0 г на 1 л среды, имеющей рН 7,0, при указанных условиях образуются круглые беловатые бактериальные колонии, вокруг которых имеются прозрачные ореолы (протеиназа-положи тельная). образование спор и параспоровых кристаллов происходит примерно через 48 ч.

На селективном агаре для Bacillus .

cereus (ОХ01Д б17), содержащем, г/л:

Пелтон 1,00

Маннитол 10,00

NaC1 2,00

М880+ 0,10

"агНРО 0,25

Na-пировиноградная кислота 10,00

Бромтимоловый голубой 0912

Агар 14,00

Вopa До 1 л при рН 7,2, с добавлением яичного желтка, (стерильно) 25,00 мл/л, через

24 ч инкубации при 30 С образуются колонии, окрашенные в голубоватый цвет (-маннитол-отрицательный), что характерно для бактерий Bacillus cereus/Â. thuringiensis. Однако в противоположность В." сегежка.и также другим многим бактериям Bacillus thurin

giensis — вокруг бактериальных колоний штамм В. hhuringiensis var.

tenebr Lons DSM 2803 не наблюдается никакого осажденного ореола (-лецитиназа-отрицательная) . Спорообразование и образование параспоровых кристаллов происходят приблизительно через 48 ч.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб, но спору-.. ляция осуществляется строго в аэроб-ных условиях. Оптимальная температура роста вегетативных клеток составляет 25-30 С. Автоклавирование в б течение 15 мин при 121 С (соответственно 1 бар избыточного давлений) полностью инактивирует споры и кристаллический токсин. Ультрафиолетовое облучение при 254 нм инактивирует споры при соответствующей дозе, но: не кристаллический токсин.

Отношение к источнику углерода. из глюкозы, маннозы и сахарозы образует кислоты и аустил метилкарбанал, но не„ газ; не усваивает лактоэу, целлобиозу, салицин, арабинозу, ксилозу и маннит. Гидролизует эскулин и крахмал.

Отношение к источнику азота. как единственный источник азота не испо-. льзует сернокислый аммоний. Для роста требует аминокислоты такие, как глутаминовую кислоту, 0,3Е"ную). Од40

3 14489 нако особые факторы роста не требует.

Образует каталазу, нитратредуктазу и протеиназу. Не образует лизин 5 декарбонксилазу,. фенилаланин, уреазу и лецитиназу.

Серологическая характеристика штамма DSM 2803 (соответственно схема серотипизирования для В. thuringiensiq0 по de BARIAC8BONNEP0I для Н-антиге.-. нов или SEKIJINA & ONO для О-антиге нов):

Н-серотип Яа8Ъ

О-серотип IX. 15

Маркерным признаком штамма является DSN 2803 (антибиограмма), задержка роста следующими антибиотиками: эритромицином, налидиксиновой кислотой нитрофурантоином и тетрациклином.

Рост штамма не подавляется ампициллином, колистином MS Ко-тримоксалом, пенициллином G метициллином и сульфадиазином.

Пример . . Инсектицидный пре- 25 парат получают следующим образом.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var tenebrions DSN 2803 культивируют в колбах Эрлейнмейера объемом 250 мл, содержащей 50 мп сре- 10 ды, включающей, Ж: дрожжевой экстракт

0,5, триптон 0,5, гликоза 0,1, КН РО

0,08, имеющей рН 7,0, при 25-30 С до образования спор. Затем биомассу отделяют центрифугированием и промы-.. 35 вают водой или буферным раствором.

Титр спор в препарате составляет 3 "

40 спор/мл. LCgp 5 -10 спор/мл для

L -личинок Leptino tarsa deumeimata.

Инсектицидным активным началом предлагаемого штамма является кристаллический токсин. Кристаллическую массу можно выделить, отделяя и очищая кристаллы от остатков клеток и спор после лизиса спорангиев, с по- 45 мощью, например, метода градиента плотности, Определен молекулярный вес с помощью электрофореза SOS-полиакриламида в геле методом Леммли. Найдены две основные полосы ок. 6500000 и 70000D. Меньшие полосы меньшей интенсивности находились в пределах

20000-40000D.

С помощью токсина можно получить антитела, которые в иммунодиффузионном тесте Оучтерлони (0uchterlony) не показывают перекрестной реакции с другими токсинами патотипа А или В.

Токсин коднрован геном, содержащимся в плазмиде. Токсин образуется также в аспорогенных мутантах, получаемых обработкой этилметансульфойатом. Способность к образованию токсина можно перенести путем переноса плазмида или гена на другие разно" видности Bacillus thuringiensis или другие бактериальные системы. Инсектицидное действие основано на присутствии закодированного в плаэмиде токсина.

Лля применения в качестве инсектицида Bacillus thuringiensis var.

tenebrionsis или получаемый из них инсектицидный препарат или токсин смешивают. известным способом с обычными добавками (наполнителями, прилипательныи добавками, смачивающими средствами и т.д.) и переводят в удобную для применения форму. Инсектицид такого состава можно применять в виде порошка, суспензии, гранулята и т.п, Предпочтительно применять очищенную спорулированную культуру в виде сус- пензии с добавкой смачивающего средства, например в виде суспензия с добавкой смачивающего средства, напри" мер, 0,1Е Ci towet (BASF). На гектар обрабатываемого поля разливают 10 10, предпочтительно 10 -10 спор, 1Ъ и эквивалентное количество токсичных кристаллов.

Действие штамма на личинки жесткокрыпых осуществляется IIQ схеме, известной по патотипу А: в .течение нескольких часов происходит прекращение питания и через несколько дней наступает смерть в зависимости от дозы. Токсичное действие основано на том, что ацителий средней кишки повреждается растворенным в кишечном соке кристаллическим токсином. Поврежденные клетки кишок насекомых отделяют одна от другой от базальной мембраны и дрейфуют в просвет кишечника. Вследствие нарушения кишечного барьера бактериальные клетки могут проникать в гемоцоэль и завершить в нем процесс дезинтеграции септицемией.

Новый инсектицид (патотип С) показывает избирательное инсектицидное действие против Coleoptera, например, против ольхового листоеда или картофельного жука. На личинок дей" ствие значительно сильнее, чем на взрослых насекомых. Действие не наб1448995 людалось íà Lepidoptera, например, мучном хрущаке (Ephestia kdhnieila

Zell) капустной моли (Plutella xylostella L.) и на Diptera, например, мошке желтой лихорадки (Aedes aegypbi

L.). В таблице приведены результаты биотестов.

Формула изобретения

Токсичное действие полученного инсектицида на различные насекомые

Исследуемый Примене. — Токсичное вид ная доза действие

Ольховый

10 /с г

10 /CM2

2, 5Х10 /смз

4х10 /см 5xIO /см лихорадки

Составитель Т. Полянская

Техрсд Л.Олийнык КорректорП. Пилипенко

Редактор И. Касарда

Заказ 6857/58

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие,. г. ужгород, ул. Проектная, 4 листоед

Кар тофел ьный жук

Мучной хрущак

Капустная моль

Мошка желтой

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis айаг. tenebrionis DSM Ф 2803 для производства инсектицидного пре" парата против насекомых Coleoptera. зРР