Способ выделения и культивирования протопластов из растительных тканей сои

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к клеточной и генетической инженерии растений. Целью изобретения является повышение выхода протопластов и упрощение процесса культивирования. В качестве источника протопластов используют незрелые зародыши сои, последующее культивирование осуществляют в жидкой питательной среде. Способ позволяет обойтись без ряда трудоемких процессов и операций культивирования, существенно повышает выход протопластов и частоту деления, а также является более дешевым по сравнению с ранее известными.

СВОЗ ССВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51) 5 С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н A BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4286959/31-13 (22) 20.07.87 (46) 15.03.90. Бюл. 1Ф 10 (71) Институт ботаники им. Н.Г. Холодного АН УССР (72) Н.В. Кучук и IO.IO. Глеба (53) 578. 085. 23 (088. 8) (56) Tricoli D.M. et. al. Culture

of soybean mesophyll protoplasts

in a1ginate beads. .-Рlant Сеll Rep., 1986, 5,5, 334-337, (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ ИЗ PACTHTEJIbHbIX

ТКАНЕЙ СОИ (57) Изобретение относится к биотехИзобретение относится к биотехнологии, в частности к клеточной и генетической инженерии растений.

Целью изобретения является повышение выхода протопластов и упрощение процесса культивирования.

Способ состоит в том, что в качестве источника протопластов используют незрелые зародыши сон диаметром

1-10 мм.

Способ осуществляется следующим образом.

Незрелые семена сои извлекают из стручков и поверхностно стерилизуют

1Х-ным раствором диоцида в течение

10 мин. После этого их отмывают дистиллированной водой и снимают верхнюю кожуру. Зародыши мелко нарезают и переносят в ферментативный раствор следующего состава, 7: Onozuka R-10

0,8; Macегоzyme 0,4; Driselase 0,02;

„.SU„, 1549995 А1 нологии, в частности к клеточной и генетической инженерии растений.

Целью изобретения является повышение выхода протопластов и упрощение процесса культивирования. В качестве источника протопластов используют незрелые зародыши сои, последующее культивирование осуществляют в жидкой питательной среде. Способ позволяет обойтись без ряда трудоемких процессов и операций культивирования, существенно повышает выход протопластов и частоту деления, а также является более дешевым по сравнению с ранее известными. ,t

Pectinase 0,4; Cellulysin 0,1; СаС1

"2Н О 15; NaC1 9; KCl 0,4; глюкоза 2

1 г/л.

После 16-часовой инкубации в раст- р иы воре протопласты фильтруют через ка- ф проновый фильтр (диаметр пор

100 нм) и осаждают центрифугировани- е ем при 500g в течение 1 мин. Осадок ® суспендируют в свежей среде W5 и наслаивают на 0,5 M сахарозу.

После центрифугирования в течение ©

4 мин при 500g флотирующие протопласты собирают, суспендируют в питательной среде W5 и осаждают ° Осадок протопластов суспендируют в питательной среде KM 8р при плотности протопластов 10 -10 /мл и переносят в чашку

Петри. Чашки закрывают и переносят в термостат, Инкубирование протопластов происходит в темноте при 28 С. Первое деление протопластов наблюдают на

1549995 тов наблюдают на вторые сутки культивирования, Эффективность высева протопластов достигает 70-80 от числа вь|целенных, На 5-е сутки культивирования протопласты разводят питательной средой МС, содержащей фитогормоны, мг/л: БАП 1; -НУК 0,1. В этих условиях колонии каллуса растут и зеленеют на свету, Пример ы 2 и 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, только используют другие сорта сои и несколько отличающиеся концентрации фитогормонов.

Способ позволяет получить иэ 1 г ь ткани до 1,2 -1О протопластов, которые культивируют в жидкой питательной среде. Протопласты обладают высокой частотой деления (до 80 ).

Способ позволяет избегать сложных вторые сутки после выделения. Эффек- тиВность высева протопластов составляет 60-70 . После 5 сут культивирования протопласты разводят жидкой пи5 тательной средой Мурасиге-Скуга с

0,35 M маннитолом в качестве осмотика и следующими фитогормонами, взятыми в количестве, мг/л: 2,4Д 0,1-0,4;

6-БАП 0,2-1,0 4-НУК вЂ” О, 1 — 1, О; пик- 10 лорам 0,02-0,08. Через две недели об— разов авшиеся микроколонии разводят аналогичной средой с О, 25 M маннитолом. После 5 недель культивирования ! образуются колонии,. интенсивно зеленеощие при переносе их на плотную питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 6-БАП в концентрации 0 51,0 мг/л и Ы-НУК в концентрации 0,01—

0 1 мг/л, в условиях освещения при 20 интенсивности света 4000 лк.

Способ иллюстрируется следующим образом, Незрелые бобы сои (сорт Брестскнй 2) собирают через три недели пос- 25 ле цветения, Извлеченные семена поверхностно стерилизуют в l -ном растворе диоцида в течение 10 мин, затем оТмывают стерильной дистиллированной водой. После этого снимают семенную кожуру, извлекают незрелые зародыши, нарезают их и суспендируют в ферментативном растворе указанного выше состава.

После 16-часовой инкубации в ферМентативном растворе протопласты фильтруют через капроновые фильтры с диаметром пор 100 нм и осаждают центрифугированием при 500g в течение

1 мин, Осадок суспендьруют в среде

М5 и наслаивают на 0,5 М сахарозу.

После центрифугирования при 500g собирают флотирующие протопласты, суспендируют в среде М5 и осаждают.

Осадок суспендируют в жидкой питатель-45 ной среде KN 8р с плотностью

10 пр./мл. Первое деление протоплассхем культивирования протопластов и способствует повышению выхода и эффективности высева., Способ позволяет обойтись без обязательного кондиционирования питательной среды а также ряда сложных процедур, что способствует удешевлению процесса культивирования.

Ф о р и у л а и з о б р е т е н и я

Способ выделения и культивирования протопластов из растительных тканей сои, включающий стерилизацию растительного материала, обработку целлюлолитическими и пектолитическими ферментами и последующее культивирование очищенных протопластов, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода протопластов и упрощения процесса культивирования, в качестве источника прртопластов используют незрелые эа.родыши сои, а культивирование протопластов осуществляют в жидкой питательной среде.

Составитель В, Демкин

Техред М, Дидык Корректор М Кучерявая

Редактор Л. Веселовская

Тираж 483

Подписное

Заказ 248

ВНИИПИ Государственного комитета по иэобретеьиям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушс-.ая наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 101