Способ определения количества и консистенции сырой биомассы

 

Изобретение относится к биотехнологии и направлено на повышение точности определения количества и консистенции сырой биомассы. В ампулу для ЯМР-анализа заранее вводят 5-50 мкл концентрированного раствора парамагнетика, не проникающего через клеточные мембраны. Затем в ампулу отбирают образец клеточной суспензии и тщательно перемешивают. Ампулу помещают в датчик ЯМР релаксометра и регистрируют релаксационное изменение амплитуды сигнала ЯМР. Полученную кривую разлагают на сумму двух экспонент быструю и медленную, связанных с релаксацией протонов внеи внутриклеточной воды, и находят начальные амплитуды этих компонент P<SB POS="POST">в1</SB> и P<SB POS="POST">а1</SB>. Затем исходный образец разбавляют в N раз (N=2÷5) питательной средой или физраствором, содержащим парамагнитное вещество в той же концентрации и вновь измеряют амплитуды сигналов P<SB POS="POST">а2</SB> и P<SB POS="POST">в2</SB> внутрии внеклеточной воды. По полученным величинам рассчитывают содержание C сухого вещества биомассы и количество внутриклеточной J и внеклеточной E воды в образце C=P<SB POS="POST">а1</SB>-NP<SB POS="POST">а2</SB>)/(P<SB POS="POST">а1</SB><SP POS="POST">.</SP>P<SB POS="POST">в2</SB>-NP<SB POS="POST">б1</SB><SP POS="POST">.</SP>P<SB POS="POST">а2</SB>)

J=P<SB POS="POST">а1</SB>/(1+C)

E=P<SB POS="POST">в1</SB>/(1+C)

количество B сырой биомассы и ее консистенцию K находят по формулам B=C+J)/C+J+E)

K=B/E. 2 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (g1)g G 01 N 24/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Fa i 1 1Рс

Pb

1+С

1+С 1

Количество В консистенцию

С +

С+ I+ сырой биомассы и ее

К находят по формулам

В

F F.

К=- — 2ил

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21 ) 4461 385/30-1 3 (22) 29.07. 88 (46) 23.05,90. Бюл. У 19 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) В.Я.Волков и Б.В.Сахаров (53) 663.1 (088.8) (56) Плевако F..А. Сушеные хлебопекарные дрожжи. М.: Пищепромиздат, 1953. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА

И КОНСИСТЕНЦИИ СЫРОЙ БИОМАССЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии и направлено на повышение точности определения количества и консистенции сырой биомассы, В ампулу для ЯМР-анализа заранее вводят

5-50 мкл концентрированного раствора парамагнетика, не проникающего через клеточные мембраны, Затем в ампулу отбирают образец клеточной сус—, пензии и тщательно перемешивают. Аь пулу помещают в датчик ЯМР-релаксометра и регистрируют релаксационное изменение амплитуды сигнала ЯМР.ПолуИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, микробиологической и пищевой промьппленности при производстве бактериальных препаратов.

Цель изобретения — повьппение точности определения количества и консистенции сырой биомассы, Сущность изобретения заключается в том, что сокращаются времена т, и Тп ЯМР-релаксации протонов вне„„SU„„1566274 А 1 ченную кривую разлагают на сумму двух экспонент быструю и медленную, связанных с релаксацией протонов вне- и внутриклеточной воды, и находят начальные амплитуды этих компонент

Р> и Ра . Затем исходный образец разбавляют в N раз (N = 2-5) питательной средой или физраствором,содержащим парамагнитное вещество в той же концентрации, и вновь измеряMT амплитуды сигналов Ра H Р внутая ри- и внеклеточной воды. По полученным величинам рассчитывают содержание С сухого вещества биомассы и количество внутриклеточного i и внеклеточной F. воды в образце клеточной воды при добавлении в суспензию клеток парамагнитного вещества,не проникающего в клетки.Это дает возможность разделить сигналы протонов внутри- и внеклеточной воды.Высокая проницаемость клеточных мембран приводит к быстрому обмену молекулами воды между внутри- и внеклеточным объемами, что изменяет амплитуды быстрой (внекпеточной) и медленной (внутриклеточной) компонент

15бб274

25 следующим

Способ осуществляют образом.

В ампулу для ЯМР-анализа заранее вводят каплю (5-50 мкл) концентрированного (0,1- 1М) раствора парамягнетика, как правило МпС1, затем отбирают образец клеточной суспензии (n,5-1,0 мл) помещают в ампулу и тщательно перемешивают для равномерного распределения парамагнетика по объему образца, Далее ампулу помещают в датчик ЯМР-релаксатора и регистрируют релаксационное изменение амплитуды сигнала ЯМР с помощью одной из известных импульсных последовательо ностей, например, 90-180 ., Ä 180 (Т ) или 180-90 (Т ) . Полученную кривую разлагают на сумму двух экспоненциальных компонент и определяют их начальные амплитуды P с,, и Р,Как следует из фиг. 2, при концентрации

МпС1 больше, чем 10 MM Ро, практичесЕ ки постоянна и соответствует доле внутриклеточной воды в образце суспензии, При этом времена ЯМР-релаксации внутри и внеклеточных протонов отличаются более чем в 20 раз (Т д/

/72 20). Таким образом, введение в анализируемый образец парамагнетик а в концентрации, об есп ечив ающей

20-кратное различие времен релаксации быстрой и медленной компонент сигнала ЯМР, обеспечивает точное измерение амплитуд этих компонент, 5Î

55 сигнала HMP-релаксации и не позволяет точно определить количество воды вне и внутри клеток. Повышая концентрацию парамягнитного вещества во внеклеточном объеме, можно значиS тельно сократить время релаксации внеклеточных протонов и выполнить измерение амплитуд сигналов ЯМР за время более короткое, чем время обмена молекулами воды через мембрану, На фиг.1 показаны типичные релаксационные кривые для суспензий клеток микроорганизмов разных концентраций; на фиг. 2 — зависимость вре.мени релаксации внеклеточных протонов Т, отношение Т /Т времени релаксации внутриклеточных протонов к времени релаксации внеклеточных протонов и амплитуды Рц сигнала протонов и внутриклеточной воды клеток дрожжей Sacharomyces cerevi s iae . от концентрации парамягнитных ионов

Мп в суспензии клеток, Затем исходный образец клеточной биомассы разбавляют в N раз (N =

2 — 5) питательной средой или изотоническим физраствором, содержащими парамагнитное вещество в той же концентрации и измеряют амплитуду сигналов P u P > внутри и внеклеточной воды.

Для величин Ро, и P в, можно 3BI1H сать следующие соотношсния:

P = ------- P (1) 1+Е„ >i 1+Е, I E р P (2) I+ F. "2 I+ Е

2 2 где Š— количество внеклеточной во 2 ды в образце, разведенном

И раз питательной средой или физраствором.

С учетом того, что F.< = (Т+С+Е,), N, где С вЂ” количество сухого остатка после высушивания клеточной биомассы, из (1) и (2) следует:

Ра т=- — ——

1+С

Ра 1 1Ра

Ра Pg — NPg P

Рв, Е

1+С

По полученным С, Х и F. находим-" количество сырой биомассы

С + I

В

С+ I+ Е и консистенцию сырой биомассы

С + I

К

В

Пример 1, Определение количества и консистенции сырой биомассы пекарских дрожжей, Пробу клеточной суспензии дрожжей, объемом 0,5 мл с помощью пипетки переносят в ампулу для ЯМР-измерений, в которую предварительно внесено 1О мкл 500 мМ раствора МпС1 ,в воде и перемешивают. Методом Карра-Парселла на приборе "Миниспекирс20" измеряют времена релаксации (Т,а .Т z) и амплитуды компонент где I — количество внутриклеточной воды в исходном образце клеточной биомассы, а F. количество внеклеточной воды в этом образце.

Аналогичные соотношения можно записать для величин Ра и Р>

5 15 (Р P ) сигнала HMP внутри и

tlirt В, внеклет очных пр от онов воды. В данном случае они составили Тдд = 27 мс, Т = 1,8 мс, Р = 0,44, Р>, = 0,56.

Затем в ампулу дополнительно вводят 0,5 мп физраствора с 20 мкл

100 мИ МпС1 так, чтобы объем пробы увеличился вдвое (N = 2) и снова производят ЯМР-измерения. В результате получилось Т ц = 24 мс, Т в = 1,5 мс.

Подставляя эти значения Ра ФРв и

N в формулы, получаем

0 44 — 2 0 20

0,44 0,8-2 0,55 0,20

О 313 г/мл

I = — - — =Π34

О 44

1,313

О 56

Е= — — --=043;

1,313

I+ С

В = — — — — --- — = 0 603 г/л

I+C+F.

Ф

К= — -=1414.

В

F 1

Пример 2. Аналогично примеру 1 определяют значения P, P и

Т, Т неразбавленной клеточной суспензии, Получают Р, = 0,44,È

= 0,56, Т д = 27 мг, Т = 1,8 мг.

Затем исходную суспензию разбавляют в 5 раз (N = 5), Для этого к 0 5 мл суспензии клеток добавляют 2 мл физраствора с 40 мкл

500 мМ раствора МпС1<. Отбирают пробу 0,5 мл в ЯИР-ампулу и измеряют

Р0, Рвв, qg H Т в, Они составляют

Р, = 0,075, Рвg = 0,925, Т д = 28 мс, Т ь = 1,6 мс.

Следов ат ель но

0 44-5 0 075

0,44-0,925-5 0,56 0,075

= 0,325, тогда

В = 0,6 и К = 1,41, что практически совпадает с результатами предыдущего измерения (при N = 2) .

Пример 3. Определение гематокрита и консистенции донорской крови человека.

30 Pq 0,31 (— cPв 1-0,29 ° 0,69

0 39

Х Рд 1

Т-с Рв 1-0,29

О 31 х --3 ——

0,69

0,63, 40

Полученные результаты совпадают с известными данными, где используется я метод це нтрифуги ров ания с поправкой на интерстициальную воду. В то же время предлагаемый способ значительно экспресснее (5 мин) и требует меньшего количества крови.

Формул а и з обрет ения

Способ определения количества и

50 консистенции cbIpой биомассы путем иэмер ения объемов внутриклеточной

I и внеклеточной F. воды соответственно, содержания сухого вещества

С в образце и расчета количества В сырой биомассы и ее консистенции К по формулам

С + I

С+ I + F

66274 6

В случае, когда содержание сухого вещества в клетках известно заранее, процедура определения количества и консистенции клеточной суспензии упрощается, Клетки крови человека в среднем содержат 71 воды и

29Х сухого вещества, т.е. C=0,29(4), Для определения гематокрита (количества клеток) предлагаемым методом достаточно измерить Р и Р неразведенной пробы крови, причем для анализа достаточно капли крови объемом

100-200 мкл. В качестве примера

10 мкл MnCI 1ОО мМ концентрации вводят в ампулу для ЯМР-измерении, затем добавляют 200 мкл консервированной крови человека и тщательно пе° ремешивают, затем,с помощью ЯИР-релаксометра определяют P u P>. С учетом 57.-ro разбавления раствором парамагнетика, их значения оказались равны соответственно Р = 0,31,Рв

= 0,69.

Поскольку С выражено в процентах (долях) к сырому весу клеток крови, то определение гематокрита (Г) и консистенции (К) крови сводится к вычислению выражений 1566274

В В/Е, Ра — 1 1Ра а

Ра, < e, Ра

Ра Рв

Т вЂ” ------ ° F === =L= e

1 С 1+С где Ы вЂ” кратность разведения.

)$.Pg с

О 20 40 Ы И l c,;го

< zo а л

Составитель Н, Алкеев

Редактор С, Патрушева Техред М, Дидык

Корректор М,Иароши

Подпи с но е

Заказ 1218

Тираж 488

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101 отличающийся тем,что, с целью повьппения точности, в обра" зец вводят парамагнитное вещество в концентрации, обеспечивающей различие времен ЯМР-релаксации протонов внутри- и внеклеточной воды не менее, чем в двадцать раз, методом ЯМР-релаксации измеряют амплитуды сигналов

Р и Р, внутри- и внеклеточной а воды соответственно, разбавляют образец в 2-5 раз питательной средой или изотоническим физраствором,содержащими парамагнитное вещество в той же концентрации, измеряют амплитуды сигналов Рд и Р> внутри- и внеклеточной воды, а величины I F. u

С определяют по формулам