Рекомбинантная плазмидная днк pbs 2 - днк - зонд для идентификации штаммов чумного микроба, несущих плазмиду pfra, способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli продуцент днк - зонда для идентификации штаммов чумного микроба, несущих плазмиду pfra
. Изобретение относится х биотехнологии , в частности к генетт ческой инженерии. Целью изобретения является создание штамма E.coli, содержащего рекомбинантную плазмидную ДНК, несущую фрагмент плазмиды pFra и обеспечивающую получение, видоспецифичного зонда для идентификации итаммов чут-шого ми ;роба, имеющих плазьпаду pFra, Для,этого сконструирована рекомбинантная плазмида pBS2, содержащая ДНК фрагмент плазмиды pFra (размером около v 0,4 т.к.п.) и репликон векто1)ной плазмнды pBR322. Этой плазмидой трансформирован гатамм E.coli К-802, обеспечивающий синтез зонда для идептификащш штаммов чумного микроба. Синтез осутцествляется в процессе репликации рекомбинантной плазмиды, ДНК-зонд FI фрагмент, являющийся частью плазмиды pFra, позволяет - ццентифи1Шровать штаммы чумного микроба, содержащие плазмнду, которая детерминирует пр одукцию антигена фракции I и мышиного токсина . FT-зонд видоспеднфичен,- он не гибридизуется с ДНК близкородственных пидов иерсиний, а также других представителей семейства Enterobacteria- сеае (кишечная палочка, пгигеллы, сальмонеллы ) , се fSasfSt %ВВВ1 ;я9пД д,
СО03 ОО 1етс11их с01,1иАлистичесних
РЕСПУЬЛИН
„„SQ„„f 586193 (51) 5 С 2 t÷ 15/00
Ь О (! 6 <1 2
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
H АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГС1СУДАРСТНЕННЫЙ КОМИТЕТ по изот етениям и отнРытиям.
ПРИ ГННТ ССО (21) 4652242/13 (23) 20.02.89 (46) 28.02.92. Бюл. 1(7 (7.1) Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" (72) О.Г.Шиш1<ина и 10.A.Ïîïîâ (53) 575.224.2:577.2(048)(088.8) (5á) I,Clinic. Microbiol, 1985, v.227, р.бООбО.
Annu. Meet, A1ner, $ос. Microbiol.
1987, 87th, Annu Meet Atlanta, 1987 ° (54) РЕКОМБИНА11ТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК
pBS2 — PHI(-ЗОНД ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ
ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА, НЕСУЩИХ ПЛАЗМИДУ pFra, СПОСОБ EE КОНСТРУИРОВАНИЯ
И ШТАММ БАКТЕРИИ 1сСНЕКТСНТА СОТ
ПРОДУЦЕНТ ДН1(-ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ
111ТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА, НЕСУЩИХ ПЛАЗМИДУ рРга (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Целью изобретения является создание штамма E.coli, содержащего рекомбинантную плаэмидную ДНК, несущую фрагмент плазмиды рРга и обесИзобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент ДНК-ДНК-г1!бридизац1п! штаммов чумного микроба, несу!!!Пх пла"-.èèäó рГra, детерминирующую синтез аптигена фракции I и мыпи1н11ого токсина, и штамм бактерии Езс1!ег1сЬ! .а со11 содержащий рекомбинантную плазмиду
pBS2, продуцент зонда, Плазмида рЕта 1умного микроб!1 прпсутствует только в щтам11ах одного печивающую получение видоспецифичного зонда для идентификации штаммов чумного микроба, имеющих плаэмиду pl га.
Дпя, этого ско11стр ирована рекомбинантная плазмида рВ82, содержащая ДНН(фраг мент плазмиды рГга (размером около
0,4 т.н,п.) и репликон векто1)ной плаэмицы рБЕ322, Этой плазмидой трансформирован штамм Е.cali I(-802, обеспечивающий синтез зонда для идептификац1П1 штаммов чумного микроба. Си11теэ зонда осуществляется в процессе реплика !111 рекомбинантной плазмиды ° ДНК-зонд F» фрагмент, являющийся частью плазмицы рГга, поэволяе " идентифицировать штамMb! чумного микроба, содержащие плазмиду, которая детерминирует продукцию антигена фракции i и мышиного токсина. FI-зонд видоспецифичен,. oí не гибридизуется с ДНI(близкородствегн1ых видов иерсиний, а также других представителей семейстna Enternbacteriaceae (кишечная палочка, шигеллы, сальМОНЕЛЛЪ1). микроорганизма и дает возможнocòü полу пить на ее основе видоспецифическшт зонд. Известны зонда! цля обнаруч<ения различных видов бактерии: патогепньгх мигеля, энторовазивных птаммов к111vp÷íoÉ па11очки сальмонел, Однако с„e ди них нет зонда специфи !ески гибридизирующегося только со штам 1амц чумного микроба, несущего плазмиду.
Целью изобретения является соэЛа11и е штамма Г. col i содерж;.!vie rn рексмби1!аHтпwa плазM11дн"10 ДНI(вк 1 чaюmv! 93 шую попу ta HIta видоспецифнч ного зонда для идентификации штамис>в чумного микроба, имеющих плазмиду рГга, детерминирующую синтез внтигена фракции !! !!
? И )К ЗОТОКСИНа МЫШИНс)ГO TORCH}la в
ДНК-зонд, обозначенный как FI-фрагмент., представляет собой участок ДНК плазмиды рРга чумного микроба, размером около 0,4 т,н,п,, репликация котКрого осуществляется в составе реком. бинантной плаэмиды рВБ2, Фрагмент Р1 получают в результате гидролиза ДНК рекоибинантной плазмиды pBS2 ферментом SalGI и последующей элюции его иэе геля, Рекомбинантная плазмида рВБ2, несущая фрагмент FI — участок ДНК плазмиды pFra чумного микробз,- состоит иэ следующих структурных элементов: 20 векторная часть иолекулы pBR322 раэмерои 4,4 т,п,н,;
bla — ген, обеспечивающий синтез р-лактамазы;
tet — ген, обеспечивающий устой- 25 чивость к тетрациклииу, инактивированный встройкой по SalGI уникальные сайты рестрикции PstI, E,coRI, BamHI, Hind III, Fð, фраГИЕНт ПЛазиндЫ рсса ЧУИНОГО щ микроба, размером 0,4 т.п.п.
Для достижения цели сконструирована плаэмида рВ$2.
Способ конструирования рекоибинантной плазмиды рВБ2 заключается в следующем, Была сконструиронана рекомбинантная плазмида рВБ1/I на основе векторной плазмиды pBR327 в которую по SalGI сайту включили последовательность ДНК плазмиды pFra размером около 2 т.н,п., определяющую синтез антигена фракции I. После гидролиза ,ПНК рекомбинантной плаэииды pBSl/1—
БаlГТ - рестриктаэной фрагмент плазинды рГra.эгюнруют из геля и обраба- 45 тынают его рестриктазой BspRI. По окончании эпектрофоретическос о разделения реструктов наименьший (около
0,4 т,н.п.) из трех субфрагмент в элн!ируют из геля. Данный SalGI-Bsp субфрагмент. модифицируют с помощью
SalGI-линкеров, преобразовав сайт / узцанания эндонуклеаэоной ВзрК1 н Ба101-сайт, и лигируют с векторной молекулой pBR322. Смесью лигированньгс молекул трансформируют
55 клетки Е.coli К-802, трансфорианты высевают на среду с. аипициллинои и тетрациклнном и отбирают клоны чувствительные к тетрациклину, Из этих кло los в! спеляют )1НК ила амиды, несущей Ба1Г1-вставку> идентичную по подвижности Sa 1(I-BstRI субфрагменту ДНК плазмиды pFra (проверяется ppстракцией и электрофорезои) и обозначают рВБ2.
Синтез вставки-зонда осущестнляется в процессе репликации рекомбинантной плазииды. Репликация осуществляется эа счет области автономной репликации плаэмиды pBR312. Рекомбинантная плаэмида неконъюгативна и амплифицируется в клетках F. coli при добавлении в среду хлораифеникола.
Штамм — продуцент зонда для идентификации чумного микроба получают трансформацией клеток Е.cali К-802 ДНК рекомбинантной плазмиды рВБ2.
Уровень синтеза ДНК-зонда н составе рекоибинантной плазмиды н сконструированном штамме составляет 1,01,2 мг/л при плотности культуры
x10 клеток/ил (ОЛ о =0,4) °
Штамм Г.coli К-802, содержащий рекомбинантную нллэииду pBS2, характеризуется следующими общими признаками.
Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. Культуральные признаки: клетки хорошо растут На обычно используемых питательных средах. На 1!57 питательном ага-!! !! ре Дифко,колонии гладкие, серые, блестящие, круглые, края колоний ровные. При выращивании в жидких питательных средах YT LB образуют ровную интенсивную муть.
Физиолога-биохимические признаки:
Оптимальная температура культинировао ния 37 Г, оптимум рН 6,8-7,5, В качестве источника углерода используют многие углеводы, органические кислоты, спирты. В качестве источника азота используют минеральные соли (в аммонийной или нитратнои форме), органические соединения (в виде пептона, триптона, аминокислот).
Устойчивость к антибиотикам: проявляет устойчивость к ампициллину (50100 мкг/мл).
Присутствие в штаимах плазиидной
ДНК! СОДЕРжащей зонд, подтверждается проверкой устойчивости клеток к ампициллину, а также путем выделения и анализа плаэмидной ЛНК одним из известных методов
1,Я6! и 3 р: .", II тр<«1 1
1<.t>< )1 ttlt(te <
1:r)}1!1ñ «! па<1)<ю пь«< 1( Клоf(tfp() f)af(t! e Вя 1(:I фраг elt Ta ПГ((1 .\ > alt TI
Г 111;p())it<ýó рсс трик т:1 э пой Sa 10 T C no СЛ (ДУЮ(((И< ЛИ I 11 Pol< r7 ill< Е < О() !".Я Э ОГ! а 1(IIЫХ ре(.трик гов, Сл<есь лигг<рованных молекул .!НК трансформируют в клстки штаммов 1. pest i s PKR 133 и .1яг.а. Te Трациклинчуtfcòâ)t Tåët ffbt<» тра)<сформяиты исследуют ия споcn(floe Tf, экспрессии аитг<гена фракции I в серологических реакциях с ант(гфракцио)11<ым ко.<мерчес— ким и антифрякционным мс ноклональI0 ным диаг ностикуь!г)м, я также в реQK ции t)pe((f<(ttt T3iffitt с анти(()рак:Ifottifot< сывороткой r соотг)етствии с Руководст— н(м по профилактике <(vI pJ3R327 и фрагмс нт плазм)(ды pFãa ряз«еро около 2 т.и,п., отмечается экспрессия антиг.сl(я фрг<кции I, В, Переклогп<рование Sa 1GI-БврРТ субфрягмсит, пла7MI(rlft pJ3SJ / I, определяющей синтез яити гена фракц(ги I > в векторноЙ плазм(<де рБК322. 11НК пляэмидь! p13S I /1 и)<кубируют с SalGI-эндонук teaaîé в буфере (10 мМ трис НС1, рН 7,9, 6 мМ 18013> 150 мМ <> !!аС1, 6 м. "l 2 — меркаптоэтянол) при 37 С 1 ч. Продукты гидро-l fэя разде.iяsют электрофорезоы в 17-ной легкоплавкой arapnSe. С (IOWO(rff ts .(I7t Вырез;)ют соотв(.тc Tftóf< t(óe эс)гу геля, запивают его 5 об),ема.<1! 20 мм Tpllc: liC1 рН 8,0, ."..! !ТА. Прогрег<яюэту сь<есь при 65 (; 5— - О -!и(г. Пробу с расплавле)(1(ьг!11 ге !ем экстр,)гlfpó î-. равннм обт.ямом фенола > хг(()рсфср><ом и ог)рабатывают a(titpc . ЛНI 1<э эгг):)та ос Зжл 3t(tT э та Hолом . Погпученн) !)r 5 11<, Т-фр,<гм )l г г)<дролиэуют рсстриктаэо) ! ."Р:(1 <г:)родукты! 1!таг<м Е,со11 К-807., с< дс р а<я! и pct Il р и м е р . Конструирование рекомбинянтной плазмиды р1382 и получение штамма E.coli К-802 — продуисttTa зонда для идентификации штаммов чумного микроба, содержащих пляэмиду. A. Выделение ЛНК рЕка из штамма I.pestis А 1122 (рЕка+) и Д11К вектор1 ных пляэмид pHR327 и pJ3R322 из tt(Tai<ма Е,cnli С 600. 20 Клетки бактерий выращивают в бульоне L (рН 7,2) с аэрацией в течение ночи при 28 С (клетки бактерий J.рез.ь tis, или 37 С Е.coli). Для амплификации ДНК векторных плаэмид клетки . 25 бактерий Е.coli обрабатывают хлорямфениколом 20 л<кгlмл с последующим цодращиванием в течение 12 ч при 37 (,". Выделяют плазмидную ЛНК. Клетки Гак— терий осаждают центрифугированием при 30 4000 в течение 10 мин при 4 С. Ресуспендирувт полученный осадок в растворе I (50 мМ глюкоза, 25 мМ трис НС1, рН 8,0; 10 мМ ЛДТ/<), содержащем лизоцим в концентрации 5 мг/мл. Инкубируют 5-10 мин при ком— натной темперэтуре, Добавляют свежеприготовленн((й раствор II(0,2 N 11аОН> 17. SDS)> осторожно перемешивают и инкубируют во льду 10-20 мин. Зятем добавляют охлажденный до 4 Г 5 М ацетат калия, рН 4,8, и оставляют во льду на 30-60 мин. Дентоиф чгируют на центрифуге Вок уа11 ОТЛ-75 в роторе SS-24 при 20(100 об/мин в течение 30 мии при о 4O r. Надосадочную жидкость переносят в чистые )I,eíòðè(hóæl(ûå пробирки, добавляют 0,6 объема изопрспанопа, Хорошо перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 30 мин. Осаждают ДНК центрифугированием в роторе ISA "Вок а11" при 1200 об/мин в тече— ние 20 мин при комнатной температуре. 1!адосадочную жидкость сливают, оса- 55 док промывают 70 этанолом. Осадок растворяют в буфере TF.> pH 8,0, при комнатной температуре. Дальнейшую очистку пляэмидной JIHK проводят ульт— I >Rr 1 I II;!1>nèttзл рл l„tf!Ллют в 47.— Ilofl ffoпи;»к— PIlII,I, ttlJ»!lot! ГPПЕ. лкр»!ллмпд»(ого г елл в>>деллют губфp,l t !PE! T рл зме ром О, 4 т. и, и. По;! учен>>ый ilIIK сусфрагмепт смецп»влют с (Г Бл1<; I.-пппкерлми и лигиру?<>т. Затем по I@set»!Ioi сыес!.ю лигпруют с вектор-! Iné !If!;I:>мидой pHR322, гидрслизовлнпой Блl(Т- рестрш< тазой. Г, Лилл!»3 рекомбинлнтнь»х пллзмид пслуче»»ие штамма-продуцента F I Bnllдл длл диагностики щтаммов чумного и>?кроба, Полученную лигпрованную смесs трансформ»»руют B клетки Г,cnli К-802, Отбирают клоны, чувствителыгые т"T-p»I»»E»I Пэ клеток отобранного клона с ппазмидой pBS2.пзгзестными методами 30 выделяют ппазмидпую ДНК pHS2, гидролпзуют ресTpl!Kтазой Бл1СТ и разделяют в гельэлектрофорезе. Фрагмент 0,4 т,н.п. элюируют пз легкоплавкой лгарО3bl по стандартным методикам. Попучеш»ый препарат метят 1 Pl,NTP ) мел 3 » тogotf Nicl<.-òpàflcëÿf»E»è ñoãëàñío ðåêoмендацш » фирмы "Amersham", Псследуе»!ые культуры подрап!»»вают пл н»»тро!»ел<гюлоз них ф»гльтрлх > л»»з пру»<>т 40 и обрлбатьц3лют согласно методике ° Гпб>ридиэлш?л также ведетсл по стандартной методике, списанной вь-»»е. Результаты гибридизации г»рипеде?(ы в таблице . Клк DEI JE,EI0 II. TB F> J>I! ILI F I 30!Iii H б:,ратель>»о дс Tc K T! Iðóет к>таммы 1. ре=,t л, ".o;-(ержлпше пллэыиду ранга, д»(<1>ференцtlpул их от предс TëDBTBJ!ått ilpy t Ã>(б ) K те г>?»ллгь?л >х It t!Jf o?l гз тс."1 >I I!( пе, бли >?.Овод< r ?tuff!II иерс»»ний, е ссдс1>:.<ащих pl га-пллзмпду. ПОЛГ>жп3 епьпля г»»бридизл!»ил, Bpo?!I>— племал г. Oäе I! и IN>I »лтлммлми KEI!Ilp нсй 55 па Jlo (к Il > >! (1< у<>»><> ! p (!I((> !F>Elf!(E!ITE»hlP. >! I з I!It;»bI рВ>2,, рВ. 1/ I (< I — фрл! ме?»том под —. > гчг !»<.! л?<>3 (б>< I рл 3 >! Jf > <.Il(п>((7>»>>! Ifo(т? (1 JIei гтч>>я (1 —. О>(пл, I! >ОГ>p(Г< >Illе и<>:>в<>J!яеT пo ?у littü >11!1(>спд, и(:по»»ьзуем»<»! длл иг»ентид>пклп!»»» щтлммов чумног-о MEIKpoF>ÿ, несущих плл 3 миду рГгл. Полу \pll щтлмм-до?»ор Г,rîli К-802 с гибр!»дпо>! пллэмидой pBS2, удобный лля вылeitetft дан!»О»! пллзмиды и, следо?1лтеUE Ifc! для наработки фраг71e El T;I-зонда, Гиб риднл я пла змидл р ВБ 2 многокоп»»й?!»ал > обллдлет удобным селектнвгг гм маркером устойчивости к ампиш»ллину, амплифицируется в присутствии хлорамфеникспл, Фрлгмент плазмиды рРгл чумного микроба, предложе»п»ый в качестве зснлл, легко выреэлетсл из плаз. п»ди рВБ2 г»ри гидролиэе рестриктлзой БлlГТ, i Ф и р м у л а и э О б р е т е н и я 1 . Рекомби?»л»»тнля плаэмидная ДНК рББ2 — ДРП(-зонд для индентификации щтлммов чумногo микроба, несущих плаз миду рГга, содержащая: векторную часть плазмиды pBR3Q размером 4,4 т.п.н.; SalGI, -HspRT- Г, фрагмент пллэмиди pFra размером О, 4 т.н.п.; Ь1л — ген, обеспечивающий синтез р-лактлмазы; tet — ген, обеспечивающий устойчив ос тB к TP Tpà EIE»K JEèff Ó; уникальные сайты рестрикции: Pstl, FcoRI, Багг>НТ, H i!3:II T Ò. 2, Гпособ конструирования рекомбинант»»ой пллзмидной ДНК рВБ2, эаключающиися в том,.что иэ рекомбинантной пплзмпды рВз1/1> определяющей синтез лнтигенл фракция I, при совместном гидролиse SalGI u HspRI выделяют субфрагмент Bpли (иной 0,4 т,н.п,, участок у-навлния рестриктазой HspRI ре— конструируют с помощью липкеров в участок узнавлнил рестриктазой, SalGI модифицированный субфрагмент встра?»влют в вектор?»ую г»ллзм?»ду рВЕ322 с Бл 1ГТ сл?<ту, после трансформации киет(>к сме(:7 ю лигированных молекул отбирают тетрлпиклпнчувствительние и лмпи1»If JtJI It! tg с той ?!»>ы(3 клОни > и 3 к О то рых вы деллют гекомбинантную плаэмиду рВ" 2 ° 3, 1>1тлм.". Г>л?(терий! Fscherichia сс1i КМ-8 — проду>>ент ДНК-зо?»дл для илен— т!t(I>I!Kл»вп! щтлммсв чумного микроба, не<-. у>лпх пла з! иду р Гга, 1О 1586193 Штамм ! ибридизация с FT-зондом lersinia pestis FV {рРга) 1t .! аида PKRl33 AII22 lava (pFra) РКК133 (pFra) 23 (pFra) PKRI33 (pFra:TnI) PKR133 (pPst) PKR133 (pCad) PKRI 33 (pBS2) PKRI33 (рВК322) lersinia pseudotuberculosi s 847 837 824 807 66 11 67 68 69 11 4!4 414 (pCad) 11 57 Iersinia епсегосо1itica 867 " 885 1367 Хеrsinia fovicidae 7 Salmonella typhimurium 4 Shige1la sonnae 18929 Escherichia coli C600 С600 (pBS2) С600 (pBSI7l) К802 (pBS2) НВ 101 Составитель Е.Кузнецова Редактор В,Трубченко Техред J1.0ëèénüï Корректор О,Кравцова Заказ 1308 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101
