Композиция для стимуляции лактации у коров и повышения степени усвояемости кормов

 

Изобретение относится к биологическим активным полипептидным композициям, которые могут быть введены парентерально животным, и которые характеризуются увеличенным периодом выделения, а также к методам применения таких композиций. Предлагаемая композиция содержит %: бычий или свиной соматотропин 10-42 и растительное масло 58-90. 11 табл.

Взамен ранее изданного (iz) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ к патенту Российской Федерации (22) 03.10.84

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 03963358/13 (31) 657.713 (32) 04.10.84 (33) US (72) Джеймс Виллиам Митчел,US (71) Монсанто Компани,US (73) Монсанто Коипани,US (54) КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ

ЛАКТАЦИИ У КОРОВ И ПОВЫШЕНИЯ

СТЕПЕНИ УСВОЯЕМОСТИ КОРМОВ (57) Использование: в области сельского хозяйства для стимуляции лактации у коров и повышения степени усвояемости коров. Сущность изобретения: композиция содержит бычий или свиной соматотропин и растительное масло при следующем соотношении, мас.,; бычий или свиной соматотропин 10 — 42, растительное масло 5890. Целесообразно в композицию дополни<19) SU <1ц 1595330 <1з> С (51) 5 А 61 К 37/02 тельно ввести агент противогидратации, выбранный из группы, включающей моностеарат, диспергатор и тристеарат алюминия, монопальмитат, дипальмитат и трипальмитат алюминия, монолаурат алюминия, дистеарат магния, монолаурат магния, монопальмитат магния, моностеарат и дистеарат кальция, монолаурат кальция, м оно пальмитат кальция, при этом агент противогидратации следует вводить в композицию в количестве 0,6 — 4,5 мас. .

Композиция обеспечивает требуемый биологический эффект в организме животного за счет того, что она содержит такое количество соматотропина, которое поддерживает необходимую скорость выделения его в организме животного в течение увеличенного периода времени. 1 з.п. ф-лы, 11 табл., 32 пр.

1595330

Изобретение относится к биологически активным полипептидным композициям, которые могут быть введены парентерально животным, и которые характеризуются увеличенным периодом выделения, а также к методам применения таких композиций.

Целью изобретения является создание композиций, которые являются пригодными для обеспечения увеличенного периода выделения биологически активного полипептида в организме животных и которые состоят из компонентов, которые являются биологическими совместимыми с данным животным.

Другой целью изобретения является создание таких композиций, которые обладают достаточно быстрым выделением для того, чтобы обеспечить требуемый биологический эффект в организме животного.

Целью изобретения является также создание таких композиций, которые обладают достаточно медленным выделением, для того, чтобы поддерживать требуемый биологический эффект в организме животного в течение достаточного продолжительного периода времени, Кроме того, целью изобретения является создание таких композиций, которые содержат высокоэффективное количество полипептида (эффективную дозу) для того, чтобы поддерживать необходимую скорость выделения препарата в организме животного в течение такого увеличенного периода времени.

Целью изобретения также является создание таких композиций, которые характеризуются достаточно низким объемом для того чтобы, обеспечить удобство парентерального ввода в организм. Это является в особенности важным фактором в тех случаях, когда доза полипептида, который должен быть введен в организм животного, является действительно большой.

В большинстве случае соматотропин (бычий соматотропин) может быть растворен во множестве буферных растворов.

Представляется предпочтительным производить растворение соматотропина в водном растворе мочевины, забуференном с помощью трис-(оксиметил) аминометана (TRIS) или другого пригодного буферирующего агента. Необходимым верхним пределом концентрации мочевины обычно является концентрация, равная примерно бМ, но в некоторых случаях предпочтительной является концентрация мочевины, примерно равная 4,5 М. Нижние пределы концентрации мочевины, равные ЗМ, а также такие низкие, как 2М и даже 1М, могут быть использованы, но с меньшей растворимостью при этом соматотропина.

Величина водородного показателя буферного раствора мочевины предпочтительно находится в диапазоне от 7 до примерно 10,5 ед. рН. В этих пределах величин водородного показателя извлечение соматотропина в виде осадка из раствора в общем случае составляет по меньшей мере примерно 60%, однако более высокое извлечение может быть обеспечено, например, по меньшей мере равное 90/, в тех случаях, когда величина водородного показателя находится в диапазоне примерно от 9 до 9,5 ед. рН.

Температура раствора во время проведения операции осаждения должна быть достаточно низкой для того, чтобы избежать олигомеризации самототропина. В общем случае такие температуры должны быть менее 10 и более 5 С.

Для получения полипептида, связанного с одновалентным металлом, раствор, подвергнутый депирогенизации и стерилизации. как было указано выше, подвергают обработке путем диафильтрации (или диализа) с тем, чтобы заменить мочевину раствором бикарбоната металла (например, 25 мМ ХаНСОз раствором, величина водородного показателя равна 9,5 ед. рН) или другой пригодной солью. Многократный обмен с помощью раствора бикарбоната металла предпочтительно осуществлять для обеспечения полного обмена мочевины. Полученный раствор далее подвергают обработке с помощью дополнительной фильтрации с водой с целью удаления избыточных количества Na НСОз, на что указывает начало выпадения в осадок связанного с металлом биологически активного соматотропина. Извлечение натрий-соматотропина с помощью процесса лиофилизации приводит к получению порошка, представляющего собой натриевую соль соматотропина.

Для получения полипептида, связанного с поливалентным металлом, раствор подвергнутый депирогенизации и стерилизации, как было указано выше, подвергают контактированию с солью поливалентного металла, такого как, например, цинк. Применение раствора хлорида цинка, имеющего концентрацию 1М, как было установлено, обеспечивает получение в виде осадка соматотропина цинка из раствора мочевины соматотро пина, имеющего концентрацию

4,5М мочевины, хотя более высокие или более низкие концентрации хлорида цинка могут быть использованы. Представляется предпочтительным осуществлять медленное

1595330 добавление раствора хлорида цинка, например, путем титрования при одновременном перемешивании раствора соматотропина.

По мере добавления раствора хлорида цинка раствор самототропина вначале имеет беловатый цвет, а затем жемчужно-белый цвет после того, как было добавлено все стехиометрическое количество цинка. Так например, путем добавления 4 мл раствора хлорида цинка, имеющего концентрацию 1М, к 400 мл раствора, имеющего величину водородного показателя, равную 9,5 ед,pH, и содержащую примерно 20 мг соматотропина в 1 мл и 0,09 M трис-(оксиметил)аминометана в мочевине, имеющего концентрацию 4,5 М, будет получена однородная жемчужно-белая суспензия цинка-соматотропина. Дополнительное количество хлорида цинка (например, вплоть до примерно 10 мл раствора хлорида цинка, имеющего концентрацию 1 М) может быть добавлено с тем, чтобы обеспечить полное высаживание в осадок.

Суспензия затем часто, что является необходимым, подвергается разбавлению с тем, чтобы уменьшить тенденцию к увеличению размера частиц осадка. Разбавление с помощью примерно 3,5 объемов воды до концентрации мочевины, равной примерно 1

М, как было установлено, удовлетворительно предохранение частицы цинка-соматотропина от агломерации, Извлечение путем диафильтрации (или многократного центрифугирования и промывания) с целью удаления мочевины, трис- (оксиметил) аминометана и ионов цинка и хлора с последующей лиофилизацией обеспечивает получение порошка, имеющего размер частиц в общем случае меньше чем 10 — до мкм.

В тех случаях, когда применяют бычий соматотропин, частицы, как правило, содержат примерно 0,3 — 1 / цинка (в диапазоне примерно 1 — 4 молекулы цинка на 1 молекулу соматотропина) . Если скорость добавления цинка увеличивается, большие количества выпадают в осадок, вплоть до 4 — 5/. Такие высокие количества могут быть обусловлены тем, что имеет место дополнительное присоединение цинка к активным кислотным центрам на соматотропине, т.е.

Н3, дополнительных Осколках аспарагиновои и/или глутаминовой кислот или, возможно, гистидиновых осколках, или на концевых карбокси- группах полипептида. Автор изобретения не считает, что эта теория присоединения цинка должна рассматриваться как ограничивающая объем притязаний по настоящему изобретению. В общем случае осаждение, использующее действительно минимальное количество цинка, должно рассматриваться как предпочтительное, Пример 1. Получение бычьего соматотропина, связанного с цинком.

Бычий соматотропин N-терминированного метионина (MBS) получают по известному методу путем лизина клеток бактерий и последующего отделения соматотропина от остатков бактериальных клеток.

Бактерии уничтожают путем обработки

50 / -ной серной кислотой, что оказывается достаточным для того, чтобы снизить величину водородного показателя ферментационного бульона до 1,7 ед.рН. Бульон нейтрализуют путем добавления гидроокиси натрия и затем подвергают центрифугированию с получением в результате пасты из клеток, которую затем суспендируют в мочевине, подвергают гомогенизации, охлаждению до примерно 4 С (эта температура поддерживалась до тех пор, пока не осуществлялся процесс лиофилизации бычьего соматотропина N-терминированного метионина, как будет указано далее), а затем производят центрифугирование и 3-кратное промывание, растворение в растворе гидрохлорида гуанидина, имеющего концентрацию, равную 7М. Центрифугирование производят для того, чтобы удалить нерастворимые примеси, затем проводят фильтрацию и полученную субстанцию пропускают через колонку, заполненную G 25, в которой гуанидин заменен на моч евину, затем производят фильтрацию и полученную субстанцию далее пропускают через ионообменную колонку типа Е 52. Объем выходящего из колонки потока уменьшают примерно в

30 раз с помощью ультрафильтрации через пустотелые волокна. Концентрированный раствор далее пропускают через хроматографическую колонку, заполненную Sephadex

G 75, а затем производят другую стадию уменьшения объема путем пропускания через пустотелое волокно и далее полученную субстанцию подвергают обмену, в соответствии с которым мочевина вначале заменяется на раствор ХаНСОз, а затем на дистиллированную воду с тем, чтобы обеспечить выпадение в осадок бычьего соматотропина

N-терминированного метионина.

Полученный осадок подвергают лиофилизации с получением в результате белого твердого вещества, слабо растворимого в воде и содержащего полипептид, представляющий собой бычий соматотропин N-терминироанного метионина, содержащий NHz-мет-фе(1)про(2) „. Леи(126) ..фе(190)-СООН аминокислотную последовательность. Такой полипептид — бычий соматотропин N-терми1595330 нированного метионина — подвергают растворению в 4,5 М растворе мочевины, 0,09 М растворе трис- (оксиметил) аминометана при концентрации 21,5 мг указанного полипептида на 1 мл, 4 С, величина водородного показателя равна 9,5 е. рН. Полученный раствор полипептида бычьего соматотропина

N-терминированного метионина подвергают депирогенизации путем смешения с 0,2 г гранул перемешанной анионообменной /катионообменной смолы типа Biorac/Ag-501Õ8 на каждый миллилитр стерильного раствора полипептида. Полученную таким образом смесь подвергают перемешиванию примерно в течение 10 мин при температуре 4 С, а затем подвергают фильтрации с помощью нейлонового фильтра, имеющего отверстия, равные 1 мкм, с целью удаления гранул ионообменной смолы, содержащих адсорбированные пирогены.

Полученный депи роге ни ров анный полипептид — бычий соматотропин N-терминированного метионина (MBS) — подвергают стерилизации путем пр опускания раствора через стерилизованный радиацией (облучением) гофрированный капсульный фильтр, имеющий отверстия диаметром 0,2 мкм, с целью удаления нестерильных инородных тел, таких как бактерии или загрязнения со стадий предшествующей переработки.

Полипептид MBS подвергают превращению в цинковую соль полипептида (ZnMBS) путем добавления 1 М хлорида цинка при одновременном перемешивании депирогенированного раствора полипептида MBS. Выпавший в осадок ZnMBS содержит примерно

1 / цинка. Раствор, содержащий твердый материал (ZnMBS) далее подвергают разбавлению с помощью стерильной депирогенированной воды до концентрации мочевины в нем, равной 1 М.

Полипептид ZnMBS подвергают извлечению путем центрифугирования с ускорением

10000 g в течение 30 мин, при этом температура поддерживается равной 4 С.

Указанный полипептид далее подвергают суспендированию в стерильной депирогенированной воде при концентрации 50 мг

ZnMBS/ìë, используя при смешении высокие усилия сдвига. Полипептид ZnMBS далее снова извлекают центрифугированием при ускорении 10000 g в течение 30 мин, затем повторно суспендируют в стерильной депирогенированной воде при концентрации 50 мг ZnMBS /мл с использованием высоких усилий сдвига при смешении и затем полученную субстанцию подвергают лиофилизации с получением в результате белого рыхлого порошка стерильного ZnMBS.

Пример 1А. Иллюстрируется альтернативный способ получения ZnMBS.

Депирогенированный и стерилизованный раствор, содержащий 21 мг MBS на 1 мл, в растворе мочевины с концентрацией 4,5 М, содержащем 0,05 М трис-(оксиметил)аминометана, имеющем температуру, равную 10 С, и характеризуемом величиной водородного показателя, равной 8,8 ед. рН, подвергают рециркуляции через емкость с помощью плунжерного насоса. На линию всаса насоса вводят раствор хлорида цинка с концентрацией 1М до тех пор, пока концентрация хлорида цинка в растворе не становится равной 0,01 М, что приводит к выпадению в осадок ZnMBS. Далее добавляют воду для разбавления с тем, чтобы обеспечить концентрацию, равную 10 мг MBS на 1 мл, приводящую к дальнейшему выпадению в осадок ZnMBS. Полученную таким образом суспензию ZnMBS далее подвергают циркулированию при температуре 25 С через диафильтрационную мембрану, состоящую из полого волокна, которая имеет отверстия, пропускающие молекулы, характеризу емые молекулярной массой до 10000. Эта операция проводится до тех пор, пока концентрация не достигает величины, равной 40 мг MBS на 1 мл; далее добавляют воду для того, чтобы подогнать скорость фильтрации через мембрану таким образом, чтобы удалить из суспензии практически все количество цинка, мочевины и трис-(оксиметил) аминометил. Добавление воды прекращают с тем, чтобы обеспечить концентрацию, примерно равную 80 мг MBS/ìë. Полученную таким образом концентрированную суспензию далее подвергают лиофилизации с получением сухого белого порошка ZnMBS, имеющего размер частиц 0,5 - 11 мкм.

Пример 1В. Иллюстрируется способ получения бычьего соматотронина, связанного с натрием.

Депирогенированный и стерилизованный раствор, содержащий 21,5 мг/ MBS на 1 мл, в растворе мочевины с концентрацией 4,5

М, содержащем 0,05 М трис-(оксиметил)аминометана, имеющем температуру, равную

4 С, характеризуемом величиной водородного показателя, равной 9,5 ед. рН, подвергают диализу с целью замены мочевины вначале на раствор МаНСОз, а затем на дистиллированную воду. Водный обмен останавливают в тот момент времени, когда начинает происходить выпадение в осадок MBS.

Полученный таким образом раствор далее подвергают фильтрации с помощью фильтра, имеющего размер отверстия, равный 0,2 мкм, с целью удаления выпавшего в осадок МВ$

1595330

10 и затем подвергают лиофилизации с получением в результате натриевой соли (NaMBS), которая может быть использована в композициях, являющихся предметом настоящего изобретения.

Пример 2. Получение композиций, содержащих соматотропин, связанный с цинком, Определенный объем кунжутного масла (сорт FISHER NF) добавляют в трехгорлую колбу с круглым основанием. В качестве агента противогидратации добавляют моностеарат алюминия в количестве, равном 5;/, от общего веса моностеарата алюминия и кунжутного масла. Эту колбу далее помещают в масляную баню, имеющую температуру

155 C и подвергают перемешиванию с целью диспергирования моностеарата алюминия так быстро, как только возможно. Процесс перемешивания продолжают в течение 20 мин, и в этот период времени происходит полное растворение моностеарата алюминия в масле. Колбу затем извлекают из масляной бани, выдерживают под вакуумом, подвергают охлаждению до 25 С. После охлаждения полученный раствор превращается в густой гель. Охлажденный гель затем выгружают в шаровую мельницу, имеющую мешалку, обеспечивающую высокие усилия сдвига в слое, состоящем из шариков из нержавеющей стали, имеющих диаметры 1/8 дюйма, 3/18 дюйма и 1/4 дюйма (0,32 0,48 и О,б4 см соответственно) . В рабочем пространстве мельницы создается вакуум, и порошок

ZnMBS, полученный„как было описано в примере 1, медленно подается в рабочее пространство мельницы с использованием шнекового питателя до тех пор, пока количество ZnMBS не достигает 40;, (весовое соотношение между ZnMBS т моностеаратом алюминия равно 13,3), Процесс перемешивания продолжается в течение б ч и за этот период средний по объему диаметр частиц ZnMBS уменьшают с 20 до 5 мкм.

Полученную в результате практически безводную желеобразную масляную суспензию

ZnMBS отделяют от шариков из нержавеющей стали путем фильтрации.

Пример 3. Эффективность использования композиции.

Практически безводную композицию получают так, как указано в примере 2, путем растворения 5;г, моностеарата алюминия в кунжутном масле, нагретом до 155 C. Это масло затем охлаждают с получением в результате желеобразного масла УпМВБ, подвергают диспергированию и размолу в масле до тех пор, пока количество ХпМВЯ в композиции не достигает 32 в непрерывной фазе масла (9,4 — весовое соотношение между ZnMBS и моностеаратном алюминия).

Шприцы, оснащенные иглой 18 калибра и имеющие длину 1,5 дюйма (3,8 см), заполняют 2,54 г (2,5 мл) композицией с образованием дозы, содержащей 805 мг

ZnMBS. Эта композиция характеризуется способностью к шприцеванию, равной 0,36 мл/с. Чистые композиции кунжутного масла с 5/ моностеарата алюминия, но без полипептида, получают так же и заполняют аналогичные шприцы 2,4 r этих композиций.

Указанные композиции вводят инъекцией

23 молочным коровам породы Holstein на втором или третьем трехмесячном сроке их второй или последующей лактации. Коровы случайным образом сгруппировывают в четыре группы, содержащие 5 или б животных. Двум группам коров инъекции вводят внутримышечно (1 М) в область желудка, причем одной группе вводят композицию, содержащую ZnMBS, а другой, контрольной группе животных, вводят композицию, не содержащую полипептида.

Аналогично двум группам животных вводят как композицию, содержащую полипептид

ZnMBS, так и композицию, не содержащую полипептида, подкожно в супраскапулярную область. Кумулятивные значения, полученные методом наименьших квадратов для средней удойности IIQ молоку (ковариантно рассчитанные через разности входных значений при предварительной обработке значений производительности по молоку), показаны в табл. 1, где удойность по молоку выражена в килограммах молока в день. Как показано в табл. 1, единичная инъекций, внутримышечная или подкожная, композиции является предметом настоящего и изобретения, приводит к быстрому и продолжительному улучшению производства молока при очень высоких значениях статистической значимости.

Образцы крови подвергают анализу с целью определения бычьего соматотропина, который без ввода в соответствии с настоящим изобретением обычно присутствует в циркуляционной системе крупного рогатого скота. Результаты анализов. проведенных с помощью радиоиммунологических опытов, представлены в табл. 2, где концентрации бычьего соматотропина выражены в нанограммах на миллилитр (нг/мл,) ..

Пример 4. Эффективность композиции для увеличенного периода выделения полипептида (MBS) у животных. Эти композиции содержат ряд различных материалов.

ZnMBC композиции готовят так, как указано в примере 3, с использованием комбинаций следующих компонентов: биологически со1595330 вместимое масло (масло из семян кунжута или земляного ореха); агент противогидратиции (моностеарат алюминия) при концентрации 3 или 5 / от масла плюс моностеарата алюминия; Полипептид (ZnMBS) при концентрациях 20, 30 или 40/ от общей композиции.

Моностеарат алюминия диспергируют в масле. Дисперсию после нагревания и выдерживания при температуре 155 С в течение 15 мин. подвергают охлаждению до

25 С с получением гелеобразного масла.

Далее добавляют ZnMBS и полученную смесь подвергают диспергированию в смесителе, обеспечивающим высокое усилие сдвига, в результате получают суспензию ZnMBS в гелеобразном масле. Этой суспензией заполняют туберкулиновые шприцы, оснащенные гиподермическими иглами 18 калибра.

Композиции, указанные в табл. 3, вводят подкожно в дорсальную (спинную) супраскулярную область крысам породы Sprogue

Dawliy, которые разделяют на 16 групп, по

8 штук в каждой (самки), у крыс подавляют иммунную систему, Образцы крови подвергают анализу с помощью радиоиммунологических опытов на бычей соматотропин. Данные, указанные в табл. 4, выражены в нанограммах на 1 мл плазмы крови. Такие уровни плазмы представлены в табл. 4 для образцов крови, взятых перед инъекцией в день О (в день инъекции) . Некоторые измерения основной линии (точки отсчета) для крыс в примерах

4-7 являются более высокими по сравнению с некоторыми основными линиями и измерениями выделенного полипептида для крови в примере 3. Это обусловлено тем, что имеют место различия в обычных уровнях самототропина и вследствии того, что радиоиммунолигоческие анализы в примере 3 более точные.

Средние значения концентраций для контрольных групп 1, 5, 9 и 13 равны в диапазоне 5-12 нг/мл на каждый из дней, указанных выше.

Пример 5. В примере иллюстрируются эффективность композиции, являющихся предметом наносящего изобретения и обеспечивающих увеличенный период выделения полипептида (MBS), использующих в качество агентов противогидратации другие соли алюминия на основе кислот жирного ряда.

В этих композициях монопальмитат алюминия и монолаурат алюминия используют в качестве агентов противогидратации вместе с кунжутным маслом и арахисовым маслом.

В этом примере гелеобразные масла, содержащие 3 / монолау рата а чюминия и монопальмитата алюминия, получают практически так, как показано в промере 4.

ZnMBS подвергают суспендированию в гелеобразных маслах при концентрации, равной

30 / от веса всей композиции (весовое соотношение между ZnMBS и монолауратом алюминия или монопальмитатом алюминия было равно 14,3) . Каждая композиция вводится инъекцией группам крыс пород

IFS-D, причем каждая группа состоит из 8 животных. Дозы указаны далее в табл. 5.

В результате анализа образцов крови, взятых у крыс в указанные дни после инъекции, устанавливают, что концентрации бычьего соматотропина являются таковыми, как показано далее в табл. 6, где значения, относящиеся к дню "0" являлись точкой отсчета при анализах.

Пример 6, Эффективность композиции, являющихся предметом настоящего изобретения и характеризуемых увеличенным периодом выделения полипептида (MBS), в которых используется оливковое или кукурузное масло.

В этом примере гелеобразные масла получают практически так, как указано в примере 4, с использованием 3 / моностеарата алюминия из расчета на вес моностеарата алюминия и масла. Суспензии, содержащие 30 или 40/ MBS вводят инъекции двум группам крыс пород IFS-D, в каждой из групп находится по 8 животных.

Концентрации вводимых доз указаны далее в табл. 7.

В результате анализа образцов крови, взятых у крыс концентрации бычьего соматотропина являются таковыми, как показано далее в табл. 8, где значения, относящиеся к дню "0", являются точкой отсчета при анализах.

Пример 7. В примере иллюстрируются композиции, содержащие примерно 10/ полипептидов типа MBS и ZnMBS, находящихся в арахисовом масле. В примере дополнительно иллюстрируется тот факт, что увеличенный период выделения полипептида может быть еще более увеличен в результате применения агента противогидратации. Композиции, как указано далее в табл. 9, предназначенные для инъекций, получают практически так, как было указано в примере 4.

Каждую композицию вводят путем подкожной инъекции группам крыс породы

IFS-D, каждая из которых состоит из 8 животных, доза равна 300 мкл. В результате анализа образцов крови, взятых у крыс в указанные дни после инъекции, устанавливают, что концентрации бычьего соматотро1595330

13

14 пина в плазме являются таковыми, как показано далее в табл. 10, где значения, относящиеся к дню "0", являлись точкой отсчета при анализах.

Сравнение результатов, полученных для групп 30 и 31, иллюстрирует улучшение способности к увеличению периода выделения MBS по меньшей мере на 7 дней за счет использования связанного поливалентного металла.

Сравнение результатов, полученных для групп 32 и 33, иллюстрирует улучшение способности к увеличению периода выделения MBS за счет использования агента противогидратации в тех случаях, когда MBS является связанным с таким поливалентным металлом, Пример 8. В примере иллюстрируются композиции, являющиеся предметом настоящего изобретения содержащие 10/ бычьего соматотропина, без применения агента противогидратации в каждом из таких масел, как кунжутное, арахисовое, маисовое, оливковое, саффлоровое, хлопковое, пальмовое, рапсовое и соевое масло. Раздельные объемы каждого из этих масел хранят при следующих температурах: 4, 25, 50, 75, 100 и

125 C. ZnMBS подвергают диспергированию и размалыванию в каждом из масел, как было указано в примере 2, до тех пор, пока концентрация не становится равной 10 / .

Процесс размельчения продолжается до тех пор, пока средний диаметр частиц соматотропина становится не более 15 мкм. Каждая из композиций характеризуется способностью к шприцеванию, превышающей 0,1 мл/с.

Пример 9. В примере иллюстрируются композиции, являющиеся предметом настоящего изобретения, и полученные, как было указано в примере 8, за исключением того, что перед добавлением соматотропина моностеарат алюминия подвергают диспергированию в каждом из масел до концентрации, равной 5/ по отношению к весу масла плюс моностеарат алюминия. Эти композиции характеризуются способностью к шприцеванию, превышающей 0,1 мл/с.

Пример 10. В примере иллюстрируют композиции, полученные, как было указано в примере 8, за исключением того, что процесс добавления соматотропина продолжается до тех пор, пока содержание бычьего соматотропина не достигает 40 / . Процесс диспергирования и размельчения продолжают до тех пор, пока средний диаметр частиц соматотропина становится не превышающим

15 мкм. Эти композиции характеризуются способностью к шпицеванию, превышающей

0,03 мл/с.

Пример 11. Пример иллюстрирует композиции, как было указано в примере 10, за исключением того, что перед добавлением соматотропина моностереат алюминия подвергают диспергированию в каждом из масел в концентрации, равной 5/ по отношению к весу: масло плюс моностеарат алюминия.

Эти композиции имеют способность к шприцеванию, превышающую 0,03 мл/с.

Пример 12, В примере иллюстрируются композиции, содержащие 10/ бычьего соматотропина, который растворяют в каждом из таких масел, как кунжутное, маисовое, оливковое, саффлоровое, хлопковое, пальмовое, рапсовое и соевое. Каждое масло подвергают нагреванию до 160 С и перемешиванию с целью улучшения растворения моностеарата алюминия, После того, как достигают растворения 1 / моностеарата алюминия, каждое из масел подвергают охлаждению до 25 С, ZnMBS подвергают диспергированию и размельчению в охлажденном масле, как было указано в примере

2, и этот процесс продолжают до тех пока концентрация этого полипептида не становится равной 10/, а средний диаметр частиц не становится равным не более 15 мкм.

Каждая из композиций имеет способность к шприцеванию, превышающую 0,1 мл/с.

Пример 13. В примере иллюстрируются композиции, полученные, как было указано в примере 12, за исключением того, что процесс добавления соматотрина продолжают до тех пор, пока содержание соматотропина не достигает 40/. Эти композиции подвергают размельчению, как было указано в примере 2, и процесс размельчения продолжают до тех пор, пока средний диаметр частиц не превышает 15 мкм. Каждая композиция характеризуется способностью к шприцеванию, большей чем 0,03 мл/с.

Пример 14. В примере иллюстрируют композиции, являющиеся предметом настоящего изобретения и содержащие 10 / бычьего соматотропина в маслах, в которых был растворен моностеарат алюминия, его концентрация была равна 5/ по отношению к весу масла плюс моностеарата алюминия.

Этими маслами являются кунжутное, арахисовое, маисовое, саффлоровое, хлопковое, пальмовое, рапсовое и соевое. Каждое масло подвергают нагреванию до 160 С и перемешиванию с целью улучшения растворения моностеарата алюминия. После того, как моностеарат алюминия растворится, каждое из масел охлаждают до 25 С. ZnMBS далее подвергают диспергированию и размалыванию в охлажденном масле, как было указано в примере 2, до тех пор, пока концентрация

16

1595330 этого полипептида в масле не становится равной 10/. Полученную дисперсию далее размалывают до тех пор, пока средний диаметр частиц соматотропина становится не превышающим 15 мкм. Каждая из композиций характеризуется способностью к шприцеванию, превышающей 0,1 мл/с.

Пример 15. В соответствии с этим примером композиции, являющиеся предметом настоящего изобретения и содержащее

42 / бычьего соматотропина, получают путем непрерывного добавления соматотропина к композициям, указанным в примере

14, и это добавление производится до тех пор, пока содержание соматотропина в композиции не достигает 42/. При поддержании масла в форме непрерывной фазы соматотропин подвергают диспергированию и размельчению, как было указано в примере

2, и эта операция проводится до тех пор, пока средний диаметр частиц соматотропина становится не превышающим 15 мкм.

Каждая из полученных композиций, содержащих полипептид и являющихся предметом настоящего изобретения, характеризуется способностью к шприцеванию, превышающей

0,03 мл/с.

Пример 16. В примере иллюстрируются композиции, являющиеся предметом настоящего изобретения и содержащие 20 / бычьего соматотропина в маслах, аналогичных тем маслам, аналогичных тем маслам, которые применяются в примере 9, но в этих композициях в качестве агента противогидратации вместо моностеарата алюминия применяют один из таких агентов, как дистеарат алюминия или тристеарат алюминия, монопальмитат алюминия, дипальмитата алюминия или трипальмитата алюминия, а также моностеарат кальция, дистеарат кальция, лаурат кальция, пальмитат кальция, моностеарата магния, дистеарат магния, лаурат магния и пальмитат магния. Агент противогидратации добавляют к маслу перед добавлением соматотропина. ZnMBS добавляют, как было указано в примере 2, до тех пор, пока его концентрация не становится равной 20 / . Процессы диспергирования и размельчения продолжают до тех пор, пока средний диаметр частиц соматотропина становится не превышающим 15 мкм.

Каждая из композиций характеризуется способностью к шприцеванию, превышающей

0,03 мл/с.

Пример 17. В примере иллюстрируются композиции, содержащие другие концентрации бычьего соматотропина в маслах, аналогичные тем, которые применялись в примере 20, и в которых типы масел соответствуют типам масел, применяющихся в примере 16, но за исключением того, что процесс добавления соматотропина продолжается до тех пор, пока концентрация самототропина не становится равной 25, 30 или 35/. Процессы размельчения и диспергирования продолжают до тех пор, пока средний диаметр частиц самототропина становится не превышающим 15 мкм.

Каждая из композиций характеризуется способностью к шприцеванию, превышающей

0,03 мл/с, Пример 18. В соответствии с этим примером получают результаты, аналогичные тем, которые были получены в примерах

8-17 в тех случаях, когда использовавшийся бычий соматотропин представлял собой химически несвязанную форму или являлся химически связанным с катионами калия или натрия.

Пример 19. Результаты, полученные в соответствии с этим примером, аналогичны результатам, полученным в примерах 8-18 для тех случаев, когда были использованы другие бычьи соматотропины, т.е. соматотропины, характеризуемые следующей последовательностью аминокислот:

NHz-мет-фе(1)-про(2) ...вал(126) ...фе(19

О)-СООН

ХН2-ала-фе (1) -про (2) „.вал (126) ...фе (180

)-СООН

NHz-ала-фе (1) -про (2) ...леи (126) „.фе (19

О)-СООН

NH2-фе-(1)-про(2) „.леи(126) ...фе(190)СООН

NHz-фе-(1)-про(2) ...вал(126) ...фе(190)СООН

NHz-мет-асп-глу-фе(1) -про(2) ...леи(126) .„фе(190) -СООН

ХН2-мет-асп-глу-фе(1) -про(2) ...вал (126) ...фе(190) -СООН

ХН -мет-(4) ...леи(126) „.фе(190)-СООН

NH2-мет (4) ...вал (126) ...фе (190) -СООН.

Примеры 20-30. В тех случаях, когда бычий соматотропин заменяют свиным соматотропином в процедурах, указанных в примерах 8-18, получают результаты, практически те же самые, поскольку бычий и свиной соматотропин являются подобными.

Пример 31. Приготавливают свиной соматотропин с N-концевым аланином (APS) путем экспрессии рекомбинантной ДНК.

Светопреломляющие тела, содержащие APS, выделяют и солюбилизуют, складывают и подкисляют в водном растворе мочевины.

Остаток процесса очистки подобен тому, что используют в примере 1 для очистки MBS.

Композицию APS приготавливают в основном, как описано в примере 3, с использо1595330

18

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ ванием смеси кунжутного масла (SO) и A1MS при концентрации ALMS 2,5 или 5 / в расчете на SO/AliVlS. Содержание полипептида (APS) в композиции составляет 10 или

20 / соответственно. Применяют количества каждой полученной композиции с содержанием APS 80 мг для инъекции в жир на дорсальной стороне кроссбредных боровов весом тела 68-77 кг в начале опыта. Две инъекции осуществляют с 2-недел:ьным интервалом, причем наблюдают среднее ежедневное повышение веса в течение 4 недель. Степень утилизации кормов вычисляют путем деления среднего количества ежедневного приема корма на среднее ежедневное повышение веса. При этом пониженное значение степени. утилизации кормовых средств указывает на улучшенный результат. Необработанные боровы служат контролем. Результаты приведены в табл. 11.

1, Композиция для стимуляции лактации у коров и повышения степени усвояемости кормов, содержащая соматотропин и растительное масло, отличающаяся тем, что в качестве соматотропина используют бычий или свиной coMaòoòðoïèí при следу ющем соотношении, мас. /:

Бычий или свиной соматотропин 10 - 42

Растительное масло 58 - 90

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит агент

Пример 32. Приготавливают APS no методу, описанному в примере 31, в носителе, содержащем 95 / кунжутного масла и 5/ A1MS. Прибавляют количество

APS, достаточное для получения концентрации 39/. Эту смесь вводят в жир на дорсальной стороне шеи кроссбредных боровов весом тела примерно 54-63 кг в начале опыта. Одной группе боровов вводят 30 мг

APS каждые 7 дней, а другой — 60 мг APS каждые 14 дней. Опыт продолжают в течение

6 недель. В течение этого времени значение степени утилизации кормовых средств у необработанной группы контрольных боровов составляет 3,61, а у группы, получавшей 60 мг через каждые 14 дней, составляет 3,53, а значение степени утилизации в случае группы, получившей 30 мг через каждые 7 дней, составляет 3,17. противогидратации, выбранный из группы, включающий моностеарат, дистеарат и тристеарат алюминия, монопальмитат, дипальмитат и трипальмитат алюминия, монолаурат алюминия, дистеарат магния, монолаурат магния, монопальмитат и дистеарат кальция, монолаурат кальция, монопальмитат кальция, при этом агент противогидратации содержится в композиции в количестве 0,6 — 4,5 мас./.

1595330

Таблица I

Кумулятивные приведенные значения удойности молока коров (MP, кг/день) ;Способ 7 дней t I4 дней ; 2I день I 30 дней ; МР,% СЬ-(; МР; СЬ ; ИР;% С ; МР Д Cb-(Еб,2

ЕЭ,7

9,6 24,8 II,7 24,0 9,6 22, I 5,7

Соединение внутримышечного и подкожного ввода (I) контроль 22,9 — 22,2 — 2I,9 (2 ) Ъ МВ 25,9 ЕЗ, I 25,4 I4,4 24,4

20,9

ЕЕ,4 226 8 I

Сравнение Уровни значимости (2) по отношению к (I) .O00I .OOOI .0004 .OI87

1о С характеризует процентное относительное улучшение к среднему контрольному значению

Конт- Внутрироль мышечно 23,3

Ъ МВ5 То же 26,6

Конт- Подкожно 22,5 роль

ZnMBS То же 25,I

22,4 — 22,0

260 I7 I 249

2I, Å вЂ” 2I,8

2Е,I

22,9 9,6

20,6

1595330

22

Таоллца 2 оычь его нгlмл количество 1СРе11нлл конЦентРаЦ1 Я

11ней после (ВЪФ ЮЙ

Т

; контрольный; МВ5 соматотропина в плазме, . одкожно контрольньй ; ЫВ5

I

3

5

7

II

I3

Е5

Е7

Icj

2I

23

27

29

6,7

6,5

7,8

7,I

7,5

8,I

8,I

8,G

7,9

6,8

7,6

7,0

5,6

5,4 б,й

5,7

5,6

5,8

3,5

3,8

5,9

8,4

9,0

9,I

I0, I

I2,0

I8,2

2I,2

2I,3

I8,2

I6,7

I6,2

I2, I3,8

ЕЕ,2

I0,б

9 В

8,4

6,8

5,9

5,I

4,6

4,3

4,0

4,5

З,I

3,9

3,6 б,б

5,2

5,2

5,4

4,I

4,4

4,3

5,3

4,4

4,9

I,Å

2,5

5,7

8,7

II,E

I0, I ,„8

II,2

Ет.,,9

I2,9

I6,5

Еб,б

Е7,5

I5,7

II,7

I2,0

IC,:,0

",5

9,0

8,5

7,4

6,7

1595330

Таблица 3

Композиции, используемьщ для инъекций Моно- ! оно ; - ; Becoaoe соотношение

Масло, стеа- !, лМВ3, - МБ моностеарат ни я о! f Объем;

I"ä (ï- дозы,; па f мкл 1 т

Кунжут

То же

d,3

Е4,3

22,2

5,0

8,6

I3,З

Арахис

То же

8,3

I4,З

22,2

5,0

8,6

I3,З х)

По отношению к весу: масло + моностеарат алюминия.

2

4

5 б

8

IO

ЕЕ

I2

I3

Е4

I5

I30

I00

ЕЗО

IO0

I30

IOG

ЕЗО

IOO

3

3

5

5

3

3

5

Нет

30

Нет

30

Нет

ЗО

Нет

30

26

1595330

Таблица 4

2I 28

Х 3 7 II I4

9 765 440 304 I38 d3 2 Х I8

I0 494 309 237 I4I ХХЗ 60

3I

62 б 38I 245 239 I69 I36 49 35

86 49

ЕХ 255 ьI Е46 ХХ9

40 б 338 I94 IBI 203 I4I d3 б 468 258 I5I I34 I49 I03

94 32 25 б 735 470 255 Х52

I0 б 582 394 22 I Хбб I34 47

ЕХ

II 753 36Х 224 Х7Х

7 383 I78 I43 95

I4á 72

4I

77 4I 34

8 479 246 Х83 I97 2I 5 I 06

Е5

7 4IÇ 28I I46 I42 I35 бб 39

I6 Средние значения концентрации бычьего соматотропина в

Группами плаэме нгlмп

Количество дней после иньекции

1595330

27

Таблица 5

Компоэиции для инъекций! Объем 1 масло 1агент противогидратации

I30

ТЗС

I30

ТЗО

Таблица 6

Средние значения концентраций бычьего соматотропина в плаэме нг/мл

Количество дней после инъекции

0 I 3 5

I43

229

43I

49

I72

632

277

j8

I62

42I

I9 П

I98

28

492

j64

35

2I0

Группа!

Кунжутное

То же

Арахисовое

То же

Монолаурат алюминия

Монопальмитат алюминия

Монолаурат алюминия

Монопальмитат алюминия

3О

1595330

Таблица 7 омпозиции, введенные инъекцией

Масло 1МВ, 5 Becoaoe соотношенце между

<МВ и моностеаратом аламиния

22,2

2I IOG Оливковое

22 I2G Кукурузное

I4,3

Таблица 8 значения концентраций бычьего саматотропина в плазме нг/мл

Количество дней после инъекции

4 II

25

996 3I4

Зс

?74

I3I4 444 I58

22

Таблица 9

Композиции для инъекций

1 !

Группа Чоличептид Содержание

)полипептида,Я Моностеарат алюминия, Я.

14асло

МВ3

30 МВ„"

I0

I0

Я рМВ5

IG х Пс отношени. к весу: масло + моностеарат алсминия.!

Объем — -Д—! Средние

Г руппа

1

Арахисовое

То же

1595330

Таблица ЕО

Средние значения концентраций бычьего соматотропина в плазме, нг/мл

Количество дней после иньекции

0 I 3 5 7

20

I4 Е350 375 I45

20

I5 I800 3I0 240 200

ЗЕ

I25

I75

Таблица П

Степень утилизации кормов

95:5

Носитель (К 0:А МУ ! ! I0

97,5:2, АР, Я

20 l0

Степень утилизации кормовых средств

3 09 3 30 3 37 3 07

3,53

Группа1

1!!

32

I2 Е200

I8 620

250 I23 64

350 330 200 р ! ботанный ! контроль