Способ получения сыворотки крови птиц

 

Изобретение относится к клеточной биологии и может быть использовано в промышленной технологии получения сыворотки крови птиц для культивирования клеток животных. Целью изобретения является повышение производительности способа и улучшение качества целевого продукта. Кровь забирают из сердца птицы асептически двумя иглами последовательно: одной - до заполнения 25-30% объема сосуда, затем выдерживают при 3740°С и другой иголой - до заполнения сосуда на 65-75% объема. Затем отделяют сыворотку центрифугированием, освобождают от гемоглобулинов и стерилизуют путем мембранной фильтрации. Производительность способа увеличивается в 8 раз, выход сыворотки - в 2,5 раза. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУ БЛИН

ÄÄSUÄÄ 1611339 А 1 (gg)g А 61 К 35/14

ОПИСАНИЕ ИЗ06РЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ зажимов в трех местах: на теле в об» ласти грудины, обеих лапках и голов-, ке. Конец шланга, фиксирующий тело, крепится зажимом к боковой пластине столика. Концы шлангов„ фиксирующих .лапки и головку, прижимают зажимами»

Взятие крови у птицы проводят по стериальной закрытой системе во фла» коны емкостью 250 мл» Предварительно подогретый в водяной бане (темпера тура 37-40 С) флакон системы взятия о крови устанавливают под углом 35 в ячейку столика для фиксации птицы.

Пункцию сердца проводят следующим образом, Иглой системы для взятия. крови горизонтально к плоскости сто» ла прокалывают кожу, предварительно обработанную спиртом, и лежащие под. ней ткани у птицы в области углубле»

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЙОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4443852/30»15

{22) 12,04 ° 88 (46) 07,12 ° 90. Бюл. М 45 (71) Научно-исследовательский ве теринарный институт (72):Н,И.Гурьянов,:С.Х Хаертынов и В.А»Гурьянова (53) 612,118(088,8) (56) Болотников:И.А., Соловьев.10.В»

Гематология птиц, -.Л.: Наука, 1980,,с»8-19. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ

КРОВИ ПТИЦ (57) Изобретение относится к клеточной биологии и может быть использова» но в промышленной технологии полуИзобретение относится к клеточной биологии и может быть использовано научно-исследовательскими и произ водственными ветлабораториями для приготовления по промышленной технологии в больших количествах сыворотки крови птиц для культивирования клеток животных тканей.

Целью изобретения является повы шение производительности способа и улучшение качества целевого продук та.

Пример 1 ° Взятие крови проводят у клинически здоровой птицы в условиях промьппленной технологии ее убоя без помощника, Фиксацию птицы осуществляют на специальном столике в спинном положении резиновыми шлан гами с помощью кровоостанавливающих

2 чения сыворотки крови птиц для культивирования клеток животных. Целью изобретения является повышение производительности способа и улучшение ка чества целевого продукта. Кровь забирают из сердца птицы асептически двумя иглами последовательно: оцной до заполнения 25-30% объема сосуда, затем выдерживают при 37-40 С и дру» ь гой иглой - до заполнения сосуда на

65-75% объема. Затем отделяют сыворотку центрифугированием, освобождают от гемоглобулинов и стерилизуют путем мембранной фильтрации. Производительность способа увеличивается в 8 раэ, выход сыворотки в 2,5 раза.

4 табл.

1611339 ния в месте разветвления ключиц, уГирают пружинные зажимы с ватного фильтра и одного селиконового шланга, идущего к флакону, иглу в горизон" тальном положении продвигают в грудобрюшную полость до попадания в полость сердца, при попадании иглы в полость сердца рукой, в которой на*ходится игла, всегда ощущается сердцебиение, и кровь, пульсируя, поступает во флакон. Обескровленную птицу переносят на конвейер, Флакон заполняют кровью до 65-75 его объема в два этапа,: первой иглой.набирают 60-75 мл крови и ставят в теплую воду (температура 37-40 C) о под углом 35О на 30-40 мин. 3а это время образовавшийся сгусток крови отслаивается от поверхности стекла 20 флакона самостоятельно нли путем лег " кого вращательного движения флакона и отделяется незначите;.:ьное количество сыворотки Второй иглой набирают кровь до 160-185 мл и выдерживают в 25 водяной бане при тех же условиях, что и на первом этапе, до отслоения сгустка крови от поверхности стекла флакона. Двухэтапное заполнение флаконов по -описанной технологии обусловливает максимальное отделение сыворотки от сгустка крови. Нац пламенем спиртовой или газовой горелки удаляют пробку системы взятия крови с флакона и заменяют ее другой сте35 рильной пробкой, Отделение сыворотки осуществлян1т методом центрифугирования флаконов, заполненных кровью, при 20002200 об/мин в течение 25-30 мин. Ыы40 ход сыворотки 40-50/. При хранении по производственной необходимости флаконы с кровью выдерживают до центрифугирования в воде с кусочками льда (температура 6-1СО С) не более

1.ч,, Сбор отделившейся сыворотки проводят стерильной системой для сбора сыворотки крови, Перед сбором сыворотки ". орлышки флаконов обрабатывают спиртом. Кровоостанавл33вающим зажимом перекрывают селйко13овыи шланг, идущий E сосуду для сбора сыворотки.

Над пламенем удаляют пробку с флакона с отделившейся сывороткой и вво-ъ 5 дят трубку для отсоса сыворотки, не разрушая сгусток крови. Прикрывают горлышко флакона пробкой с отверстием, заполненным ватой, Затем в сосу"= де для сбора сыворотки создается отрицательное давление -0,15-0,2 атм с помощью разряжающего мембранного компрессора (штуцер - трубка из нержавеющей стали). Шланг, идущий от компрессора, надевается на селиконовую трубку ватного фильтра. Флаконы с отделившейся сывороткой ставят в слегка наклонном положении, и трубку с защитным зонтиком на всасывающем конце постепенно опускают по стенке флакона до границы раздела сыворотки и сгустка крови. Защитный зонтик на всасывающем конце трубки профилактирует попадание в сыворотку форменных элементов крови и позволяет проводить наиболее полно ее сбор. Посредством кровоостанавливающего зажима регулируют скорость отсоса сыворотки, Освобождение сыворотки от попавших в нее форменных элементов крови проводят методом центрифугирования флаконов с собранной сывороткой при

1000 об/мин в течение 10-15 мин, Осаждение и удаление из сыворотки криоглобулинов проводят следующим образом. Освобожденную от форменных элементов крови сыворотку подвергают о глубокому замораживанию при -20 С в течение 48 96 ч во флаконах емкостью

250 мл. После оттаивания (при 4-6 С) в сыворотке выпадает осадок криоглобулинов, который удаляют центрифу гированием флаконов с сывороткой при

1500 об/мин в течение 10-15 мин»

Стерилизацию сыворотки после удаления криоглобулинов проводят методом фильтрации ее через набор мемб» раиных фильтров фирмы Миллипор с диаметром пор 1,2111 - 0,22 1 . Сыво» ротку разливают по 50-100 мл и эти кируют„ Расфасованную сыворотку хра» нят при 4 С, После проверки на стео рильность, ростовые свойства и на содержание специфических антител сы воротка.может быть использована для культивирования клеток животных тка

HeH„„

Пример 2. Сравнительное изучение отделения сыворотки методом центрифугирования флаконов„ заполненных кровью кур в один и два этапа (табл.1), где п - число флаконов в опыте, х - среднее арифметическое;, m — средняя ошибка среднего.арифме» тического).

Б опыт взято 12 флаконов емкостью

250 мл, заполненных кровью до 65-75 .

7 1611339 8

Таблица 1

Т

Отношение отсосан-, ной сыворотки к объему кровищ 7

Вариант опыта

Отсосано сыворотки крови из 1 флакона, мл ем крови во конах, мл оличест о флако ов шт, Х m

175,83+1,61 .172,05+2,20

10,84+1 42

41,51 i1,05

19 17+2,60

71,36+1,95

12

22 скота (3, 59) и сыворотки крови эмбрионов коров (4,03).

Культура клеток РУ15 при указан» ной посевной концентрации клеток, выращенная на среде Игла МЕМ с 2-5% сыворотки кур при исследовании под микроскопом через 72-96 ч образует пЛотный, хорошо выраженный монослой, клетки несколько крупнее, чем в npuc Tñòâèè сыворотки эмбрионов коров„ но не теряют четкости границ, про зрачности и конфигурации. При куль тивировании этих клеток на среде, содержащей сыворотку крови крупного ро- 5 гатого скота, клетки образуют тяжи,, теряют четкость границ и прозрачность, П 1 и м е р 6 ° Сравнительное изу- чение ростовых свойств сывороток кро-20 ви кур, крупного рогатого скота и эмбрионов коров при культвировании клеток ПЭК (первично-трипсинизирован ных клеток почек эмбриона коровы).

Трипсинизацию почек эмбриона (до

1,5 кг) коровы проводят по известной методике. Суспензию этих клеток вносят в стеклянные матрасики емкостью

200 мл по 30 мл с концентрацией

500000 клеток/мл. Состав культурапь- 30 ной среды: 957. среды Игла MEM с глу» тамином, 5% сыворотки крови кур, каннамицина сульфата из расчета

0,1 мг/мл. Клетки помещают в термо стат при 37 С. Смену среды проводят о через 24 ч после посева клеток

Контролем служат эти же клетки, выращенные при тех же условиях в культуральной питательной среде с0» става: 907. среды Игла МЕМ с глутами- 40 ном, 107. сыворотки крови крупного рогатого скота или их эмбрионов, каннамицин сульфата из расчета О,1 мг/мл, Клетки ПЭК в присутствии сыворотки крови кур и эмбрионов коров образуют полный монослой через 72 ч, а в присутствии сыворотки .крови крупного рогатого скота через 96 ч после их посева. При световом микроскопиро» вании существенных различий в морфологии клеток ПЭК, выращенных в присутствии сыворотки крови кур и эмб» рионов коров, не обнаружено, а у клеток, выращенных в присутствии сыворотки крови крупного рогатого скота, отмечена незначительная стертость границ.

Форму па изобретения

Способ получения сыворотки крови птиц, включающий фиксацию птицы на столике, взятие крови из сердца иглой в сосуд, отделение сыворотки, центрифугирование ее, освобождение от криоглобулинов и стерилизацию, отличающийся тем, что, с целью повышения производительности способа и улучшения качества целевого продукта, фиксация птицы производится наклонно в желобообразном стслике, взятие крови проводят асептически последовательно двумя иглами, вначале одной иглой до заполнения

25«30% объема сосуда, затем выдержи.вают кровь при 37-40 С и второй иглой заполняют сосуд до 65-75% объема, отделение сыворотки осуществляют центрифугированием и отсасыванием, а стерилизацию проводят путем мембранной фильтрации.

1611339

Т а б л и ц а 2 ивая масса ур, кг

Отношение взятой крови к живой массе кур,% ем взятой кров

1 куры, мл

Вариан опыта оличесто кур,ш

Х+ ш

Х+ I|I

178,13+8,54

65,83+6,67

5,50+0,08

1,98+0,ll

3,237+0,141

3,200+0,203

Таблица 3

Количество

Вариант опыта тсосано сыворо рози из 1 флак робирки. мл ем крови s лаконе,про

Ke MJI

«рл ак онов, пробирок,ш

Х + ш

X+ ш

71,36+1,95

2,57>0,14

41,51 1,05

17,12+0 92

172,05+2,20

15,00

22

Таблица 4 оличест» Вид сыво- Число Снято клеток

Время роста клеток

Индекс пролиферации

Количество выросших клеток оличество посеянных клеток) о сыво- ротки отки крови рови в ультуальной реде,% подсчета клематрасика, ыс, клеток час

Х+ш ток

Контроль

° "»

Контроль

Контроль

Контроль и»

Контроль

10

Контроль т »

Контроль !

KOHT p0 JI b

°"

СКК

CKKPC

СКЭК

СКК

CKKPC

СК3К

CKK

CKKPC

СКЭК

СКК

CKKPC

СКЭК

СКК

СККРС

СКЭК

CKK

CKKPC

СКЭК

СКК

CKKPC

СКЗК

CKK

CKKPC

СКЭК

5 1088,89+42,22

5 894,44+26,22

5 1138,89+33,37

5 1783,33+42,89

5 1277,78+4l,ll

S 1888,89+73,10

5 1640,00+65,33

5 1808,33+76,33

5 2258,33+85,36

5 2497,78+!02,67

5 2148,00+53,33

5 3208,89+116,89

5 4361,11+121,11

5 3111,11+93 89

5 3819,44+230,56

5 3027,78+73,89

5 2583,33+72,78

5 3055,56л81,58

5 5262,22+90,62

5 4600,00+98,67

5 4853,33+66,49

5 7755,56+133,33

5 5577,78+98,67

5 6702,22+144,89

0,67

0,55

0,70

1,10

0,79

1,16

1,01

1,11

1,39

1,54

1,32

1,97

2,68

1,91 2, 35

1,86

1 59

1,88

3,24

2,83

2,98

4,77

3,43

4,12

Отношение отсосанной сыворотки к объему крови, %

1611339

Продолжение табл,4

10

П р и м е ч а н и е: СКК - сыворотка крови кур; CKKPC сыворотка крови крупного рогатого скота; СКЭК - сыворотка крови эмбрионов коров

Составитель .И.Марченко

Техред JI.Îëèéíûê . Корректор ММаксимиаинец

Редактор . И, Горная

Заказ 3783 Тираж 546 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Проиэвсдственно-издательский комбинат Патент", r.ужгород, ул. Гагарина,101

СКК

CKKP C

СХЭК

СКК

CKKPC

СКЭК

СКК

CKKPC

СКЭК

СКК

СККРС

СКЭК

5

5

5

5

5

4556,56+146,67

5422э22+114ü67

61ll,1 1+151,11

6257,78+"!,35,11

4977,78+79,11

5120,00+114,67

8000,00+155,56

5844,44+137,78

6560,00+129,78

4071,11+90,67

5688,89+114,67

6533,33+129,78

3, 83 Контроль

3 76 э

3,85

3,06 Контроль

3,15

4,92

3,59 Контроль

4,03

2,50

3 50 Контроль

4,02 «и»