Способ получения рекомбинантной плазмидной днк pit337, экспрессирующей изопенициллин-n-синтетазу

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения изопенициллин-М-синтетазы. Сконструирована новая плаэмидная ДНК , обеспечивающая экспрессию гена изопенициллин-М-синтетазы в клетках E.coll. Плазмиды pCZ106 и обрабатывают эндонуклеазами рестрикции с получением NCOI-NCO и NCOI-BamHi фрагментов плазмиды pCZ106 размером 7,8 kb и 1,5 kb, а также NCOI-BamHI фрагмента плазмидь plT33S размером 1,5 kb: полученные фрагменты лигируют с помощью ДНК-лигазы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s С 12 N 15/52

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4356444/13

62) 4027382/13

2) 19.09,88

23) 21.04.86 (31) 725870 (32) 22,04.85 (33) US (46) 23.01.91, Бюл. М 3 (71) Эли Лилли энд Компани (US) (72) Томас Доминик Инголиа, Стефен Виатт

Квинер, Сьюллен Мэри Сзмсон и Пол Л ютем

Скзтруд (US) (53) 577.224,2/.577.2 (048) (088,8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК р!ТЭ37, ЭКСИзобретение относится к био ехнологии и может быть использовано для получения изопенициллин-N-синтетазы.

Сконструирована новая плазмидная

ДНК plT337, обеспечиващая экспрессию гена изопенициллин-N-синтетазы в клетках

Escherlchla coll.

Пример, А. Выделение плазмиды.

Лиофильную Е.coll К12 JA221-plT335 получают из Northern Regional Research

Laboratories, Peoria, l6inols под регистрационным номером NRRL  — 15960. Этот лиофил можно непосредственно использовать как "культуру" в предлагаемом способе.

Штамм Е.соИ К12 JA221/plT335 инкубируют в 1 л 1 -бульона (10 r триптона, 10 г NaCI и 5 г дрожжевого экстракта на 1 л), содержащего 50 мкг/мл ампициллина при 37 С до достижения оптической плотности при 590 нм (О.ДБяа) — единицы поглощения, добавляют

150 мг хлорамфеникола. инкубируют еще около 16 ч.

„„5U „„1623567 АЗ

ПРЕССИРУЮЩЕЙ ИЗОПЕНИЦИЛЛИН-йСИНТЕТАЗУ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения иэопенициллин-N-синтетаэы.

Сконструирована новая плазмидная ДНК

plT337, обеспечивающая экспрессию гена иэопенициллин-N-синтетазы в клетках Е.coll, Плазмиды pCZ106 и plT335 обрабатывают эндонуклеаэами рестрикции с получением

NCOI-МСО и NCOI BamIII фрагментов nnasмиды pCZ106 размером 7,8 kb и 1,5 kb, а также

NCOI — 8amHI фрагмента плазмь дь р!Т33 размером 1,5 kb; полученные фра м нты лигируют с помощью ДНК-лигазы.

Клетки центрифугируют са коростью

6000 об мин а течение 5 мин при 4 C. Полученную надосадочную жидкость сливают, а остаток промывают в 40мл TE буфе :а(10MM трис-kCI, рН 7,5; 10 мМ йаС! и 1 мМ ЕДТА), затем снова осаждают. После повтоьного слиаания надосадочной жидкости «леточный остаток эамораживают в бане со смесью сухой лед — этанол, отгаивают и повторно суспендируют в 10 мл раствора

25 -ной сахарозы и 50 мМ ЭДНА. Затем добавляют 1 мл раствора, содержащего

5 мг/мл лиэоцима, 3 мл 0,25 М ЕДТА, рН 8,0 и 100 мкл 10 мг/мл ЯМАзы А, раствор инкубируют на льду в течение 15 мин, Затем добавляют 3 мл лиэирующего раствора, полученного при смешивании 3 мл 10 -нога тритон-Х 100; 75 мл 0,25М ЭД I А, р Н 8; 15 мл

1М трис-НО, рН 8,0 и 7 мл воды перемешивают и инкубируют на льду в течение 15 мин.

Лизированные клетки эамораживают в бане со смесью сухой лед — этанол, а затем оттаивают, 1623567

Клеточные осколки удаляют из раствора центрифугированием при 25000 об/мин в течение 40 мин в SW 27 роторе (Бекман) и экстрагированием забуферированным феиолом, После добавления 30,44 г CSCI и 1 мл (5 мг/мл) раствора этидиумбромида объем раствора устанавливают 40 мл, декантируют в кювете VTI50 ультрацентрифуги (Бекман); центрифугируют в VTI50 роторе при

42000 об/мин в течение 16 ч. Полученную плазмидную полосу визуализируют, облучая ультрафиолетовым светом, выделяют, а затем центрифугируют при 50000 об/мин в течение 16 ч. Все необходимые изменения в объеме осуществляют добавляя TES-буфер, содержащий 0,761 г/мл CSCI, Плазмидную полосу снова выделяют, экстрагируют насыщенным соленым изопропанолом для удаления этидиумбромида, разбавляют 1:3 TES-буфером, добавляют два объема этанола, а затем инкубируют в течение ночи при -20 C. Плазмидную

ДНК таблетируют, центрифугированием раствора в SS 34 роторе (Сорвал) в течение 15 мин при 10000 об/мин, 1 мг плазмидной р!Т335 ДНК, полученной таки л способом суспендируют в 1 мл

ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCI, рН 8,0 и 1 мМ

ЭДТА) и хранят и р и -20 С, В, Конструирование плазмиды р!Т337.

Лиофильную культуру клеток Е.со!! К12

RV308/pCZ106 используют для инокулирования 1 л !=бульона, содержащего 50 мкг/мл канамицина, а затем инокулированный бульон инкубируют при 25 С в воздушном шейкере до О.Дщо между 0,5 и 1.0 ед, поглощения. Когда эти значения достигают интервала 0,5 — 1,0 ед, поглощения в оптической плотности, температуру повышают до 37 С и продолжают инкубирование в течение 2 — 6 ч для неконтролируемой реплика ции.

После инкубирования при 37 С в течение 2 — 6 ч клетки собирают, плазмидную

ДНК pCZ106 выделяют по примеру 1А. 5 мг плаэмидной ДНК pCZ106 суспендиру>от в

5 мл ТЕ-буфера.

K 25 мкг полученной плазмидной ДНК

pCZ106 добавляют 10 мкг десятикратно>о

BamHI-реакционного буфера, содержащего

1,5 M NaCI; 60 MM трис-HCI, рН 7,9, 60 мМ

MgCiz и 1 мг/мл бычьей сыворотки альбумина (BSA), 50 ед. рестриктазы BamHI и 50 ед рестриктазы N col в обьеме 5 мкл и 55 мкл

HzO. Полученный реакционный раствор инкубируют при 37 С в течение 4 ч, после чего реакция практически завершается.

N col — BamHI реакционную смесь подвергают электрофорезу в 17-ном агарозном геле до четкого отделен>ля целевых

10 !

45 фрагментов - 1,6 kb N col — BamH! и 8,7 kb

N col-N со! от других продуктов расщепления, 0.3 kb рестрикционного фрагмента.

Визуализацию обработанной электрофорезом ДНК осуществляют подкрашиванием геля в разбавленном растворе (0,5 мкг/мл) этидиумбромида и экспонированием подкрашенного геля длинноволновым ультрафиолетом, После определения положения целевых фрагментов в геле дела>от небольшую щель перед каждым из целевых фрагментов и в каждую щель помещают небольшие кусочки мембраны Schteicher апО Schueil (Кеепе, NH 03431) Л!А-45 ДЕАЕ, При продолжении электрофорезэ ДЧ К дековалент»о связывается с ДЕАЕ мембрзной.

После того, как целевые фрагменты связываю>е. с ДЕАЕ мембраной, эти мебраны извлекают и промывают буфером, содержащигл 100 мМ КС!, 0,1М ЭДТА и 20 мМ трисHCl. рН 8. Затсм каждую мембрану помещают в небольшую ампулу и погружают в буфер, содержащий 1M NaCI, 0,1 мМ

ЕДТА и 20 MM трио-НС!, рН 8, инкубируют при 65"C в течение 1 ч для удаления ДНК с мембраны, После инкубирования при 65 С н >кубационный буфер собирают, мембрану промыв >ют.

Раствор ДН К устанавливают таким, чтобы концентрация NaCI была 0,25М, и добавляют три объема холодного абсолютного этанола. Затем полученные растворы смешиают и оставляют при (-70)ОС íà 10 — 20 мин.

После охлаждения растворы центрифугируloT при 15000 об/мин в т ..ние 15 мин.

> н>сле еще одного осаждения для удаления остаточной соли ДНК промывают этанолом, с, лат, псвторно суспендируют в 20 мкл буфера ТЕ, Полученные очищенные фрагмены I,6 ku N со!-Вап>Н! и 8,7 kb N col — N col ,." !>икционных фрагментов плазмиды рСЛ 06 отдельно растворяют в 25 мкл ТЕ буфера и лранят при (-20) С.

25 мкг ДНК-плазмиды р!Т335 расщепляют рестрикционными ферментами N col u

Вал1Н!, как описано выше. N col-BamHIрасщепленную ДНК помеща>:т íà 1 -ный агарозный гель и целевой 1.5 kb N со!BamHI рестрикционный фрагмент выделяют, как описа о выше. Получают приблизительнс бмкг целевого фрагмента, »успендг „>уют его в 25 мкл ТЕ-буфера и хра. при -20 С.

5 . лкл - i,á kb Л!со!-,amHI и2,5мкл8,7!сЬ

Л! col N со! рестрикционных фрагментов п>лазмидь р С2106, лигируют с 5мкл 1,5kb

N со>-BamHI рестрикционного фрагмента ппазмиды pl t335 до получения плазмиды !!7337, Реакционный объем составляет

О мгл и включает указанные фрагменты

1623567

ДНК, 1,1 мкл (100 ед,) Т4 ДНК лигазы, 3 мкл 10-кратного лигирующего буфера (0,5 М трис-HCI, рН 7,8; 100 мМ М9С!г, 200 мМ дитиотреитола ЭДТТ); 100 мМ АТР; и 1 мг/мл

ВЯА/ и 13,4 мкл НгО. Реакционную смесь инкубируют при 15 С в течение 2 ч, после чего реакция практически завершается. Лигированная ДНК составляет целевую плаэмидную ДНК plT337.

С, Конструирование Е.coll К12

RV308/ðÒ337.

А, Конструирование Е.coll К12

RV308/plT337, 50 мл культуры Е,coll К12 RV308 (NRRL

 — 15624) в L-бульоне выращивают до

О.Д59о - 0,5 единиц поглощения. Культуру охлаждают на льду в течение 10 мин, клетки собирают центрифугированием. Осадок клеток повторно суспендируют в 25 мл холодного 100 мМ СаС1г и инкубируют на льду в течение 25 мин. Клетки еще раз осаждают центрифугированием, осадок повторно суспендируют в 2,5 мл холодного 100 мМ Са С1г и инкубируют на льду в течение ночи. 200 мкл этой клеточной суспензии смешивают с лигированной ДНК, приготовленной, как описано выше, инкубируют на льду в течение

20 мин, а затем клетки собирают центрифугированием, Клеточный осадок повторно суспендируют в 1 мл L-бульона, и эту сус"пензию инкубируют при 25 С в течение! ч.

Аликвотные части смеси клеток помещают на L-агарные (L-бульон с 15 r/ë агара) пластины, содержащие 50 кмг/мл канамицина, и эти пластины инкубируют при 25 С.

Трансформанты Е,coll К12 RV308/plT337 проверяют отбором на устойчивость к канамицину и рестрикционным ферментным анализом их плаэмидной ДНК.

Некоторые изоляты Е.coll К12

RV308/pIT337 трансформантов по отдельности инокулируют в 5 мл аликвотных частей L-бульона, содержащего 50 мкг/мл канамицина, и инкубируют в воздушном шейкере при 25 С до тех пор, пока О.Дюо не составит 0,2 ед, а затем при 37 С в течение приблизительно 6 ч, Спустя 6 ч собирают по 1 мл каждой культуры клеток и центрифугируют. Клеточные осадки по отдельности промывают 1 мл

10 мМ NaCI, а затем суспендируют в 1,0 мл

IPS экстрационного буфера (0.05 Iv1 трисHCI, рН 8,0, 0,01М KCI и 0,01 MgS04). Клетки обрабатывают ультразвуком импульсами по

5,6 с, используя микронаконечники. Время между импульсами облучения ультразвуком составляет 60 с. Полученную смесь выдерживают в бане лед — этанол во время этой процедуры. После обработки ультразвуком клеточную смесь центрифугируют для удаления осколков, а затем используют непосредственно в анализе.

Контроль синтеза изопенициллина-N проводят в объеме 500 мкл. Для начала ре5 акции 1,0 мл раствора 1,4 мМ д — /L — а аминоадипил/- =цистеинил-D-валина и

3,75 мМ ДТТ оставляют при комнатной температуре на 30 — 60 мин для приведения любых димерных трипептидав в мономер10 ную форму. 50 мкл каждого из последующих исходных растворов помещают небольшими частями в контрольные ампулы (стерильные, стеклянные, ампулы 13 х 100 мм): в буфере 500 мМ трис-HCI. рН 7,4; 100 мМ

15 KCI; 100 мМ MgSO4; 1,0 MM FeSO4 и 6,7 мМ аскорбиновой кислоты, Затем добавляют различные количества экстракта, разбавленного водой до объема 150 мкл. Около

100 мкл аликвотных частей раствора три20 пептида добавляют затем в каждую ампулу; добавление трипептида начинает реакцию. Каждую ампулу встряхивают, помещают в гиротропную шейкерную баню при вращении со скоростью 250 об/мин, 25 при температуре 25 С и инкубируют 45 мин.

Затем отбирают два образца по 100 мкл каждый, капают в выемки пластинок для биоанализа и к остальному добавляют 100 ед. пенициллиназы. В каждую реакционную

30 смесь добавля от по 5 мкл (100 ед.) регидратированной пенициллинязы-А и оставляют на 5 мин при комнатной темпера..уре а затем по 100 мкл каждого экстракта, обработанного пенициллиназой-А, помещают в

35 углубление на пластинке для биоанализа.

Такую обработку пенициллинаэ й-А проводят для проверки того, чтобы увери ься, что зоны на пластине для биоанализа связаны с наличием пенициллина, а не цефадос ори40 на или других примесеи

Стандартную кривую пенициллин. -N получают, добавляя 0,5; 2,0; 5,0; 10,0 и 20,0 мкг пеницлллина-N в углубление на пластинках для биоанализа. Активность пеницилли45 назы-А проверяют также, добавляя 5 мкл ферментного препарата к 200 мкл 0,2 мкг/мл пенициллина А.

Пластины для биоаналиэа состоят из

К131 питательного агара, который пслуча50 ют, растворяя 30,5 г ВВ1 Antibiotic Meoium в 1 A деионизированной воды, доводя раствор до кипения, охлаждая до 70" С, а затем выдерживая в автоклаве 35 мин при 121 С и давлении 1,055 кг/см . Затем пластины г

55 засевают 4 мл свежей ночной культуры

MIcrococcus luteus (АТСС 9341), а на 700 мл агара М.luteus выращивают в К544 питательном бульоне, который содержит Dlfco пептона 5,0 г; Dlfco дрожжевого экстракта

1,5 г; хлористого натрия 3,5 г. безводного ди1623567 устройчива к замораживанию и оттаиванию.

Более высокая стабильность связана с разницей в обработке фермента между

С.acremonlum и Е.соИ. Так, например, синтетаза иэопенициллина-N, выделенная иэ

С.acremonlum, не содержит первых двух аминотерминальных аминокислотних остатков, метионина и глицина, которые имеются в ДНК, кодирующей активность синтвтазы иэопенициллина-N С,acremonlum и которые также присутствуют в предлагаемом материале, продуцируемом Е.coll.

10

Формула изобретения

Составитель Н.Кузенкова

Редактор А.Коэориз Техред M.Моргентал Корректор С,Шекмар

Заказ 116 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета Ilo изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент, г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 калийфосфата 3,7 г; монокалийфосфата 1,3 г;

РИсо бычьего экстракта 1,5 г в 1 л деиониэированной воды. Раствор доводят до кипения, охлаждают до 25ОС, доводят до рН 7,0

1 н, HCI или 1 í. NaOH, а затем выдерживают в автоклава в течение 20 мин при 1210C и давлении 1,055 кг/см перед употреблением. Засеянный агар помфцают в пластины

100 х 15 мм в количестве 15 мл засвваемого агара на пластину. Углубления получают оТсасыванивм 5 мл пипеткой; каждое углубление имеет диаметр 10 мм.

После подготовки пластин образцы помещают в эти углубления и инвубируют rip@

37 С 18ч. Результаты анализа определяют измеряя диаметр чистых поверхностей

Вокруг каждого углубления с Образцом, кОтОров Обраэовывавтся иэ эа того, чтО

М.luteua нв могут расти в присутствии пенициллина.

Хотя линейность анализа по измерению размера зон заметно падает, когда размер зоны прввывавт 2,1 мм, результаты анализа показывают, что Е.coll К12 й1/308/рП337 трамсформанты экспрвссируют активность симтетазы изопвницИллинай, тогда как трансформанты E.coÈ К12

RV308/pCZ106 этого не делают.

Фермент, продуцирувмый Е.соИ, существенно болев стабилен, нежели синтетвэа иэопенициллинр N, полученная иэ

Cephaloaportun асгееопШпт. Эта более высокая стабильность проявляется в экспериментах по замораживанию и оттаиванию.

Синтетаза изопенициллина С.acremonfum быстро инактивирувтся при замораживании и оттаивании, но синтетаэа изопенициллина-N, продуцированная Е.coll, достаточно

Способ получения рекомбинатной глазмидной ДНК р1Т337, экспрессирующей иэопенициллин-N-синтетаэу, заключающийся в том, что из штаммов бактерий Escherlchla

coll К12 JA22 i/р!ТЗЗ5 и Е.coll K12

Ю/308/рС2106 выделяют плаэмиды, которые подвергают обработке эндонуклеаэами рестрикции с получением N col-N col u

N со1-BamHI фрагментов плаэмиды pCZ106 размером 7,8 kb и 1,5 kb, а также N colВагпН! фрагмента плаэмиды plT335 размером 1,5 ко; полученные фрагменты лигирую с помощью ДНК-лигаэы в буфере, содержащем 50 ммоль трис-НО, 10 ммоль MgCIz, 200 ммоль ДТТ, 10 ммоль АТФ, бычий сывороточный альбумин, рН 7,8 при комнатной температуре и концентрации ДНК 1 мг/мл в течение около 2 ч, полученной рекомбинантной ДНК трансформируют штамм бактерий Е,coll RV308 с отбором устойчивых к канамицину клонов, способны х экспрессировать активность изопенициллина-М-синтетаэы, и выделением целевой плаэмидной ДНК.