Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклональных антител против белка р24 вируса лейкоза крупного рогатого скота
Изобретение относится к гибридомнон технологии и может быть использовано в биологии и ветеринарии для иммуноиндикации вируса лейкоза КРС. Цель изобретения - получение штамма гибридомных культивируемыхкпеток, продуцирующего моноклональные антитела (монАТ) против бечка р24 пируса дейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), относящиеся к субклассу Ip,G-2b. Ытамм потучают гибридизацией клеток селезенки мышей линии Balb/c, иммунизированных ВПКРС, с клетками миеломы мышей Balb/c РЗХбЗЛ З.653. Птлчм депонирован под номером ВСКК/П/ № 225П. Шгамм культивируют в среде /1МЕМ с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы, 20 мМ Ht-PES, 2,5 мМ L-глутамина, 200 мкг/мл гентамицина при 37 С и 7,5% СО в воздухе. Мтамм приминается в брюшную полость сингенных мзлгаей в виде асцитных опухолей. Гнбридома продуцирует монАТ класса TgG2b, специфичные к белку р24 ВЛКРС. Специфичность монАТ установлена иммунофермеитным анализом на очищенном белке р24, а также методом Вестерн-блотинга. Продуктивность штамма - около 7 мг монАТ из 1 мл асцнтной жидкости. 45 (Л
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (Ч?С С 12 N /ОО С 1 Р 21/08
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 46001 41/13 (22? 31.10.88 (46) 15.02.91. Бюл. Р 6 (71) Институт биохимии АН ЛитССР (72) Г.1(?.Микалаускене, Н.П.Дикинене, К.А,Инанлусклс, А.Э.Велецкайте, Д.IO.Àäîìàéòåíå, М.М.Млурицас и В.If.Тлмошюнас (53) 578.085.23 (088,8) (56) ida Т. et al. 1fonoclonal
antibodies деГ1пе antigenic ref,ions
on the major interna1 protein р24
of. bovine 1.eukemia virus (BLV).
Arch, V i.r o1»f;y, 1987, v. 94, р.315-321. (54) ИТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ
КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ IfUS М118С1Л.ПБ L. — ПРОДУПЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ
БЕЛКА р24 ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО
РОГАТОГО СКОТА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в биологии и ветеринарии дпя иммуноиндиклции вируса лейкоза
КРГ. Цель изобретения — получение
Изобретение относится к гибридомной технолог!ги t! может быть использовано в биологии и ветеринарии для иммуноиндикации вируса лейкоза крупного рогатого скота (КРС).
Целью изобретения является получение штамма гибридомных клеток, продуцирующег,! ((оноклональные антитела (монАТ) против белка р24 вируса лейк зл крупного рогатого скота, относящиеся к субклассу Ig С2Ь.
„„SU„„1627557 А 1 штамма гибридомных культивируемых клеток, продуцирующег» моноклонлльные лнтителл (монАТ) против белкл р24 нирусл,пейкозл крупного роглтого скота (ВЛКРС), относя!н(еся к субк.-(лcc у I 8 G — 2Ь . f 1тa(((! пол у1(лют Г((бр (! дизлцией клеток селезенки мьпяей линии ВаI Ь/с, им((унизировл нных ВЛКРС, с клетками миеломы мьицей ВлlЬ/с
РЗХ63А88.653. Штамм депониро! лн под номером ВСКК/Ц/ 1! 2" 5Д. Ш л!!и культивируют в среде Я1ЕМ с .;(облнлснием
107 сыворотки эмбриона коровы, 20 мМ
Н!.Pf,"S, 2,5 мМ L-глутлм нл, 200 мкг/мл гентлмицина при 37 Г и 7,57. СО в о воздухе. Штамм при!((лается н брюшную полость сингенных миней н виде лсцитгн(х опухолей. Гибридома продуцирует м»нАТ клзссл TgG2b, .специфичные к белку р24 ВЛКРС. Специфичность монАТ установлена иммуноферментным анализом на очищенном белке р24, л
It 11 также методом Вестерн-блотингл
Продуктивность штлммл — около 7 мг монАТ из 1 мл лсцитной жидкости, Штамм BI.V-pi 4-V1, HCKK/Ï/ Ф 225Д получают следу! !!н!..! nбразом.
В-лим((!оциты из селезенки иммун- . ных мышей линии Pal.Ь/с гибридизируют с помощью 507,-ног! раствора полизтиленгликоля 1550 по общепринятой методике с клетками ((ы(п(ной миеломы
РЗХ63А(;8.653,, Предварительно мышей иммунизируют трижды лизированным вирусом лейкоза КРС t(o 80 мкг ннутри162755 7
50 брюшиIIII<3 с полным лдъюнлнтом Фрейндл с -,енедельно.
Нустер33<3< .313OI1esIIIe в хв<3стовую гену 50 мкг белк;«3eрe э месяц после третьей 33лсл1у33из<3 цни, В-клетки селе зенки мыши вь3деляют методол1 л фи3333ой хрсзматогрл<3331и нл основе Р(лЬ ) -фрл IIOII roI3, иммобилизонлнных нл .ефлдекс à — 200. 10
В реэул3,тате тестирования методом иммунофермент. <3гс анализа (ИФА) получеш<ых гибридных культур по признаку продукции антител против бепка р24 вируса лейкоза КРС и последующе- 15 го их клсв<ироплн<1я отобран штамм, продуци13уюций монЛТ против белка
3324 вирус.,з .<<с 31к<з.3а 1 1 С.
1ГФЛ Ilpo130!I33 T IIO следующей схеме .
Вирус лейкоза ЕРС н карбонатном- 20 биклрбо33лтном буфере при рН 9,6 с концентрлцз<е 3 1 мкг/мл н объеме
100 мкл вносят в лунки полистиролоных планшетов. Адсорбцию проводят в течеш3е 18 ч при 4ОС. Лунки отмыва- 25 ют <33осфлтныл1 буфер ом, рН 7,4, с О, 1 М
:1аГ1 (ФБ) и с 0,057 Твин-20 (ТФБ) .
Злтем в лунки добавляют по 100 мкл .лстворл ФБ, содержащего 17 альбумина бьп<ьей сыворотки (БСА), инкуб .гуют 1 ч при ;омнатной температуре и с тмынлют Т<".Б несколько раэ. Затем в лунки доблвляют по 100 мкл асцитной жидк<3сти в разведении 1:10
1:8192 с ТФ l — БГЛ инкубируют 1 ч
;.ри 37 Г, o r! II!IIa!r <3 ТФБ вносят IIO 10с) мкл субстрата АВтБ. Через 30 мин реакцию останавливают добавлением 100 мкл 27.-ного раствора 3имонной кислоты, определяя оптическую плотность при 416 нм. Анализ данных показал, что монАТ реагируют с вирусом лейкоза КРС титр антител составляет 2048 для асци,»ых жидкостей. В качесте положительного контроля используют иммунную сыворотку мышей кВ1.Ч, а в качесте отрицательного контроля — сыворотку интактных мышей и супернлтант миеломь3, не продуцирующей иммуноглобулины. Нтлмм характериэуе-.ся следующими свойствами. К нет!! II культивируют на ростовой среде Иглл в модификации Длльбекко (37! Г<:::1) с добавлением 107. сыззоротки эмбриона I Ку. п,тивирова3пзе проводят при 3 / и .3нкублторе с с< держанием 7, 5i. СО . И< в<<а я КОНПЕНтрацня 10 K,<1/ÌË, 5 крат31ость рассевл 1: 6. KJIOHIIpoI 1 3 1ОКс333сPp!3л1\3«, 31роно;;Ят 13 I IBO" -ротк ° <мбрионов кор,в с доба<.ление.1 0 диметил< у .!, 3с ксидл, 507 сы-<ор ë KII 3IIápIIoII.;<3 крупного рогатого ь <.ко гл при Icn!I;Iã.птр 3ции 1x i O кле.т к <лзл. PIIýíåñïoooá!«3ñòü 3133е; ок ш., мма п<зсле размор.зживания состав3 л т 80,, Hp,свивка по 10 кл .ток штамма 3<1. < -p24-Vl сингенным предобработанным мышам вызывает у них образован Зе лс цит 33 ой опухоли, с опр овождающе ся выделением асцитной жидкости г ко . личе тп 1-5 мл. В асцитной ж3<дкост3< одержлтся с 3С ". <ЬТИ3331РОНаНИЯ КЛЕТО!С 1П Vill <3. После размораживания клетки сохраняют способность продуцировать монЛТ,. Прививка мь:33ам клеток на р.,— 3н зх пассажах культивирования стлб3льно вызывает образование у них асцитных опухолей. Для гыделения мон„Т иэ лсцитн<й жидк зсти иммуногл< буэинь3 осаждают сульфатом аммония Осадок отделяю1 цен, рифугироьанием, д31аз<,1зуз<зт, после чего про во-сят фракционирование через сефадекс G-150. Из 1 мл асцитной жидкости после осаждения белкс в сульфатом ал1л1ония получают 7 мг монЛТ. Титр антич ел н лсцитной жидкости, устанонлс нный с помощью иммуноферментного метода, составляет 2048. Субкласс монЛТ определяют с помощью коммерческих лнтисубкллссовых Г сывороток методом иммунодиффузии н агар оном геле . NOIIAT VT V-р? 4-V1 принадлежат к субкллссу l8 Г213. 5 1бз Для подтверждения специфичности мопЛТ к р24 BLV используют также методы пммуноапализа в ттятнах (™dot" ) на Нитроцеллюлозной мембране и Вестерн-блотинга. Одновременно это является 1<римерами использования монАТ ВЬЧ-р24-Ч1 для иммуноиндикации белка р24. Пример 1. Игтмуноапализ в пятнах на нитроцеллюлозной мембране. На вырезаттные полоски питроцеллюлозной ME ff6ðaíû с диам<.тром пор 0,45 мкм, величиной 5х5 мм наносят 1 мкл белка р24 вируса лейкоза KPC в концентрации 0,1 мг/мл, высушивают и помещают в <тунки полистироловой пластины для ИФА. Затем в лунки вносят 100 мкл блокирующего буфера, сос— тоящего из ФБ, содсржацего 37. альб мина сыворотки крови быка, инкубпруют 30 мип прп комнатной температуре, промывают ФБ и инкубируют с 50 мкл асцитной жидкости в разведении от l:4 до 1:409б в течение 2 ч при комнатной темгературе во влажной камере. Затем промивают ФБ и вторично инкубируют с блокирующим буфером на протяжении 30 мин прп комнатной температуре. Затем в лунки вносят по 100 мкл конъюгата 33 ра тведении 1:1000 в блокирующем бу<ттере, пнкубируют 2 ч при комнатной т мпературе, отмывают и вносят по 100 мкл приготовленного субстрата о-дианизпдина (0,5 мг/мл о-дианизидина, 0,5 М Трис-НСI, рН 7,5, 2 мкл/мл 307. Н О ). Реактптю останавливают дистиллированной водой. Окрашиванпе опенивают визуально. Результаты свидетельствуют о взаимодействии монАТ BLV-p24-V1 с очищенным белком р24 ги<зуса лейкоза КРС. Пример 2. Применение монАТ ВЬ
Для проведенття иммунного блотинга 100 мг вирусного материала или 8 мкг белка р24 фракционируют в ДИЧаПААГ в стандартной трис-глициновой г системе. Электроперенос белков на нитрс целлюлозную мембрану (HM) .с диаметром пор 0,45 мкм проводят при 7557 6 5 l5 30 В R те«е 11е 18 l. П«л» п«п«анпя электро< торез 1 ге ffh т<ыг<ачттп,lf Затем НМ пом щают в раствор с асцптной жидкостью в разведении от 1:4 до 1:409б или в раствор очищенных монАТ. В ка«есте контроля используют, сыворотку здоровых мышей. НИ инкубттруют при комнатной температуре в течение ночи . Затем отмывают в течение 1,5 ч прп 37оC с отмываюшнм буфером (0,057. трис-НСI, рН 7,5 с 0,05 Твин-20, 3 мМ Na ЭДТА и 0,25 И NaCI ). Затем HM помешают в конъюгат, разведенный блокирующим бу<ггером 1:1000, и инкубируют в течение 1,5 ч при 37 С, после чего НИ отмывают отмывающим буфером в течение 1,5 ч при 37ОС, помешают в раствор субстрата о-дианттзпт<ттна, как описано выше, инкубпруют в темноте при комнатной температуре до появления окраски. С целью установления неспецифического перекрестного связывания монАТ в методе Вестерн-блотпнга использованы следуюгтие контрольные антигены: альбумин сыворотки крбви КРС, гемоглобин сыворотки крови КРС, лизированные лимфоциты крови здоровых коров, антигепы вируса герпеса KPC типа I, когтмерческие препараты яцурного антпгена. Результаты свидетельствуют о том, что монАУ В1 Ч-р24-Vl не связывают с перечисленными антигенами. ИонАТ высокоспецифичпо реагирует с белком р24 вируса лейкоза KPC. Формула изобретения Итамм гибридных культивируемых клеток животных 225 Д-продуцент мопоклональных антител против белка р24 вируса лейкоза крупного рогатого скота.
