Способ получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к интерферону типа омега

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при получении МОН АТ к интерферону типа омега. Животное MUS MUSCULUS L. подвергают двукратной иммунизации гибридным интерфероном - 1 ч. интерферона типа омега-1 и 1 ч. интерферона типа α-2 и затем двукратной иммунизации интерфероном типа омега-1. Полученные иммунные клетки селезенки культивируют в сывороточной среде для кисточной культуры. Получают миеломные клетки линии Р3Х63 AG8,653. Клеточные культуры раздельно промывают и суспендируют в бессывороточной среде для клеточной культуры. Суспензии объединяют, суспендируют, осадок суспендируют в среде, содержащей 45% RPMJ 1640, 50% ПЭГ и 5% ДМСО, суспензию встряхивают, добавляют бессывороточную среду для клеточной культуры, а затем среду с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Смесь центрифугируют, осадок суспендируют в среде с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, гипоксантином, аминоптерином и тимидином. В суспензию вносят перитонеальные макрофаги, инкубируют и отбирают целевой продукт.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬГГИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4203388/30-13 (22) 29.09.87 (31) P 3633323.9 (32) 01, 10.86 (ЗЗ) ЛЕ (46) 23. 10.90. Бюл. Р 39 (71) Берингер Ингельгейм Интернациональ ГмбХ (DE) (72) Гюнтер Адольф (AT). (53) 578.085.23 (088.8)

I (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДОМЫ, ПРОДУЦИРУЮР1ЕД МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К ИНТЕРФЕРОНУ ТИПА -ОМЕГА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при получении монАТ к интерферону типа омега. Животное Nus

musculus h. подвергают двукратной иммунизации гибридным интерфероном—

1 ч. интерферона типа омега -- 1 и 1 ч

Изобретение относится к гибрипом- ной технологии и может быть использовано при получении монАТ к интерферону типа омега.

Способ осуществляют следующим

o6PR9oM»

Селезеночные клетки животного, прошедшего предварительную иммутизацию интерфероном типа омега или гибридным интерфероном, состоящим из одной части интерферона типа омега-1., и одной части интерферона типа альфа, предпочтительно интерфероном типа омега-1 или интерферонами типов омега-1 и альфа-r. и последующую допол„,Я0„„1602393 А 3

С 12 N 5/00, С 12 P 21/08

2 интерферона типа оС 2 и затем двукратной иммунизации интерфероном типа омега-1. Полученные иммунные клетки селезенки культивируют в сывороточной среде для кисточной культуры. Получают миеломные клетки линии РЗХ63 Ag 8,653. Клеточные культуры раздельно промывают и суспендируют в бессывороточной среде для клеточной культуры. Суспензии объединяют, суспендируют осадок В среде, содержащей

457 КРМ1 1640, 507 ПЭГ и 57, МСО, . суспензию встряхивают, добавляют бессывороточную среду для клеточной культуры, а затем среду с 107 эмбриональной телячьей сыворотки. Смесь центрифугируют, осадок суспендируют в среде с ?07. эмбриональной телячьей сыворотки, гипоксантином, аминоптериром и тимидином, В суспензию вводят перитонеальные макрофаги, инкубируют и отбирают целевой продукт. ааааа нительную иммунизацию интерфероном типа омега, предпочтительно интерфероном типа омега-1, подвергают p слиянию с миеломными клетками, котоФ рые предпочтительно сами не продуцируют антитела, например с миеломными клетками линии РЗХ63Ая 8,653.

Получаемые при этом гибридомные культуры подвергают скринингу с целью идентификации тех клонов, которые продуцируют направленные против интерферона типа омега моноклональные антитела (монАТ). Для этой цели, например, исполвзуют биологические опыты, которые могут подтвердить

16О.Л98 выли»яемую полученными янтителами нейттэялиэяц»»ю биологических активностей» интерферона гипа омега, например антивирусной активности.

Из полученных по способу пяти

5 культур, которые обозначают как

ОМГ-4, ОМГ-5, ОМГ-6, ОМГ-7 и ОМГ-8 и которые проявляют существенное уменьшение антивирусной активности интерАероня типа омега-1, выбирают клоны ОМГ-4, ОМГ-5 и ОМГ-7, которые используют для производства монАТ.

Для этой цели выбранные линии гибридомных клеток культивируют 111 Uivo или in vitro, Клетки выбранных клоНоВ инокулируют в Mb»1!IeA породы

Balb/с, которым предварительно вводят пристян или неполную среду Фройнда. Через 7-18 дней собирают асцитную жидкость, из которой монАТ выделяют путем осаждения сульАатом аммония и последующей аффиной хроматограАии или же другими известными методами, Образовавшиеся антителя можно также только обогащать в ос— цитной жидкости.

Образовавшееся антитело можно аналогично обогащать или же выделять из нясадочной жидкости соответствующей клеточной культуры, подготовленной in vitro. Получаемое по способу монАТ можно использовать не только для доказательства наличия интерАерона типа омега, но и для очистки интерАерона типа омега, предпочтительно интерАерона типа омега-1.

Если получаемое монАТ предназначено,пля тонкой очистки интерфероня типа .40 омега, то его предпочтительно ковалентно связывают с биологически неактивным носителем. При этом ковалентная связь антитела осуществляется на соответственно активированном

45 носителе, предпочтительно на декстрановой основе, например, на активированной бромистым цианом или группой СН сефарозе. При этом подлежащий очистке интерАерон типа омега, например омега-1, в виде раствора пропускают няд полученным монАТ на носителе при слябоосновной величине рН, например при рН 7-8, предпочтительно 7, 5, после чего промывают при рН 7,5 до тех пор, пока

1элюат больше не содержит протеина.

Затем связанный интерАерон элюируют в кислой области, например, при 1»омощи О, 1 М лимонной кислоты в 257ном этиленгликоле. Получаемые таким образом содержащие протеин фракции подвергают хромятогряАии на сильнокислом катионите, например, на катионите Моно-С. При этом человеческий интерферон в упомянутом элюате немедленно абсорбируется катионитом и затем элюируют при помощи градиента хлористого натрия.

Если монАТ используют в качестве антигена для доказательства наличия или для количественного определения интерАерона типа омега, то можно использовать общеизвестные методы с использованием иммунопроб.

Пример 1. Получение моноклоняльных антител, специфических относительно интерферона типа омега.

Иммунизация.

Самку мьппи типа ВаТ.b/ñ возраста около восьми недель подвергают иммунизации высокоочищенным (степень .истоты 957) гибридным интерфероном типа омега-1/Ы? следующим образом.

Первая иммунизация: 200 мкг указанного интерфероня вместе с полным адъювантом Фройнда (внутрибрющинно), вторая иммунизация: 200 мкм указанного интерАерона вместе с полным составом добавки Фройнда (внутрибрюшинно).

Вторая иммунизация осуществляется по истечении 5 недель после первой иммунизации.

По истечении восьми недель после второй иммунизации мьппь подвергают дальнейшей иммунизации с помощью

70 мкг очищенного интерАерона типа омега-1 (степень чистоты у9ОХ) при использовании неполного адъюванта

Фройнда (внутрибрюшинно). Через 12 дней берут пробу сыворотки. Опыты по нейтрализации показывают, что сыворотка мыши имеет относительно высокие титры нейтрализующих антител против интерферона типа омега-1 (полная нейтрализация при разбавлении сыворотки до 1000-кратного, частичная нейтрализация при 1000-кратном разбавлении). Опыт по нейтрализации осуществляют следующим образом . 100 мкг разбавленной пробы сыворотки в среде клеточньгх культур

5 16023 смешивают с 100 мкг раствора интерфероня типа омега-1 (100 антивирусных ед./мл) . и в .течение 90 мин инк убир уют при 37 С. Затем антивирус ную о активность проб определяют биологичес5 ким методом с использованием клеток

А549 рака легких, инфицированных вирусом энцефяло-миокардита. Через 5 недель после третьей иммунизации

10 мышей еще раз инъецируют 70 мкг очищенного интерферона типа омега-1 (степень чистоты >90%) без добавки.

93

6 эмбриональной телячьей сыворотки.

Клетки собирают центрифугированием, суспендируют н 400 мл среды ГАТ (с добавкой 20% эмбриональной телячьеч сыворотки, гипоксянтина 1,6х10 М, "7 яминоптериня 4х10 ?1 и тимидина

1,бх10 M) . К этой суспензии прибавляют перитонеяльные мякрофаги из мышей породьr 1)aLb/с (приблизительно

50000 кл./мл).

Получение и скрининг гибридом.

Получение гибридом осуществляют при использовании несецернирующих клеточных линий РВХ63Ая8,653. По истечении 4 днеч после последней иммунизации берут селезенку мыши; клетки селезенки механически удаляют из ткани, суспендируют и среде для клеточной культуры (среда: RPMI 1640 с добавкой пенициллина н виде натриевой соли; 100 ед/мл) и стрептомици.25 на в виде сульфятной соли (50 ед/мл) и центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об/мин н центрифуге типа

Бекмянн TI-б, 2х1О" миеломных клеток (культивированных в упомяьуточ сре де с добавкой 10% эмбриональной телячьей сыворотки) собирают центрифугиронанием и проминают один раз бессивороточной средой для клеточ— ной культуры, Клетки селезенки и 35 миеломные клетки затем повторно cvc пендируют н бессынороточной среде для клеточной культуры, суспензии. соединяют и повторно центрифугируют.

Недостаточную жидкость удаляют, клет- 4р ки суспендируют н 3 мл среди, состояrqeA из 45% среды RPtII 1640, 50% полиэтиленгликоля с ь олекулярним весом

4000 и 5% диметилсульфоксида, и в течение 9О с осторожно встряхивают. 45

Затем оставляют стоять в течение

60 с. В течение 90 с по каплям прибавляют 3 мл бессывороточной питательной среды, суспензию в течение

60 с оставляют стоять, зятем по кяп- 50 лям в течение 90 с добавляют дань— нейшие 6 мл бессывороточно . пнтятель— ной среды и, наконец, постоянно пе— ремешивая, медленно прибавляют 1? мл питательной среды с 10% эм рионяльной телячьей сиво,глотки, оставляют стоять в течение 10 мин н затем доводят до объема 50 мл добявленнем среды для клеточной культуры с 10,.

Суспензию пипеткой подают на пластинки, каждая из которых снабжена

48 углублениями (каждое углубление имеет емкость 0,5 мл), Пластинки инкубируют при 37 С (95% воздуха, 5% двулк:-:си углерода, насыщение во дяным паро".<). По истечении трех дней к каждой культуре прибавляют

0,5 мл среды ГАТ. Из всего 800 исходных культур по истечении 2-3 недель приблизительно 300 культур показывают рост гибридомных клеток. Последуюл1ий скрининг осуществляют следующим образом. Нядосадочные жидкости по меньшей мере 10-20% слитых гибридомных культур смешивают с одинаковым объемом раствора человеческого интерферона типа омега-1 (20 антивиральвых ед./мл), инкубируют в течение

90 мин при 37О0изатем исследу,ют по меньшей мере два разя с соблюдением промежутка в одну неделю. 5 из культур, которые далее обозначаются как

ОИГ-4, ОИГ-5, О1-1Г-б, ОМГ-7 и OtGГ-Я, во всех опытах всегда проявляют уменьшение антивирусной активности.

Все культуры клонируют путем лимитирующего разбавления и клоны снова исследуют ня нейтрялизующую яктчвность. Из каждой культуры 3-5 положительных клонов подвергают дальнейшей обработке. Для получения антител

6 ня живом организме 3-10х10 клеток каждой гибридной культуры внутрибрюж:H:-io инокулируют и мыши породы

Вя1Ь/с, которым зя ?-3 дня до этого внутрибрюшинно инъеццруют 0,5 мл неполного,ядъювянтя Фройндя или за

7-10 дней до этого — 0,5 мл пристава. По истечении 7-21 дня собирают образовавшуюся асцитную жидкость.

Содержащиеся в ней антитела обогащают до степени чистоты выше 90% путем осаждения 50% cvJTbABTR аммония и аффинной хромята. рафии на связанном с носителем лротеине А. Для всех гибридом ня 1 мл асцитной жид1602393 кости получают приблизительно 2-5 мг чистого янтителя, Характеристика антител ОМГ-4, ОМГ-5 и ОМГ-7.

5 При электрофорезе на полиякриламидном геле с использованием доденилсульфята натрия, проводимом н невосстанавливяющихся условиях, и жидкостной гель-хроматографии под давлением все антитела проявляют удерживающую характеристику, идентичную с иммуноглобулином Г. В опыте по нейтрализации, в котором исследуют торможение. антивирусной активности интерферонов, все антитела в концентрации 100 микг/мл нейтрализуют активность интерферона типа омега-1, но не активность интерферона типов альфа- 2с, бета и гамма. Вышеуказан- gg ные клоны дегонировяны под номерами 870; 1404 (ОМГ-4), 87081402 (ОМГ-5) и 8708 1403 (ОМà — 7) в European Collection of Animal Cell

Cultures. Centre for Applied Micro- 5

biology and Research (Великобритания).

Пример 2. Анализ с использованием связанной с энзимом пробы для определения ин-30 терферона типа омега- I ..

Антитела ОМГ-5 и ОМГ-7 ковалентно связывают с пероксидазой из хрена. Для этого 2 мл пероксидазы н воде 35 смешивают с 0,2 мл 100 мМ перйодата натрия, встряхивают при комнатной температуре в течение 40 мин и подвергают диализу при С в течение но,а чи при рН 4,4 с использованием 40

2х500 мл 1 мИ ацетата натрия, Затем раствор доводят до рН примерно 8 добавлением 0,1 М бикарбоната натрия с рН 9,5. К раствору добавляют раст-. вор.моноклонального антитела (ОМГ-5, 2 мп с 1,6 мг/мл; или ОМГ-7, 1,5 мл с 4,7 мг/мл, каждый раз в 10 мМ бикарбонята натрия с рН 9,5), после чего встряхивают при комнатной температуре н течение 2 ч. Добавляют

100 мкл раствора бората натрия (4 мг/мл ввода) и раствор инкубируют на ледяной бане в течение 2 ч. Затем по каплям добавляют 3 мл холодного насыщенного раствора сульфата аммония и инкубируют на ледяной бане в, течение 1 ч. Образовавшийся осадов, связанный с пероксидазой иммуноглобулина, собирают путем центрифугиронания, растворяют в содержащем и фосАатный буфер изотоническом растворе поваренной соли с рН 7,4 и стабилизируют путем добавления 1 мл раствора яльбумина сыворотки крупного рогатого скота (10 мг/мл н содержащем фосфатный буфер растворе поваренной соли). Получаемый раствор замораживяют при минус 7ООC.

Определение интерферона типа омега-1 с использованием связанных с энзимом иммунопроб ня твердом носителе осуществляют следующим образом.

Для покрытия пластинок используют антитела OMI — 2, ОМГ-5 или ОМГ-7 в концентрации 10 мкг/мл в 0,1 М карбоната натрия с рН 9,5 (100 мкл на углубление) и пластинки инкубируют либо при комнатной температуре в течение часа, либо при 4 — 8 С в течение о ночи. Раствор антителя удаляют, углубления промывают 200 мкл воды и заполняют 100 мкл раствора альбумина сыворотки крупного рогатого скота (5 мг/мл) в содержащем фосфятный буфер изотоническом растворе поваренной соли с рН 7,4 (далее "раствор

AC/ПС"). Затем добавляют 100 мкл раствора интерфероня типа омега-1 c KOHцентрацией 20 нг/мл и перемешивают.

Затем во все углубления подают 50 мкл раствора, связанного с энэимом антитела (ОМГ-5/пероксидаза или ОМГ-7/пероксидаза), (ряствор разбавлен в соотношении i !0000 в AC/ЛС) и пластинки инкубируют при комнатной температуре н течение 3 ч. Затем раствор удаляют, углубления трижды промывают водой и заполняют 100 мкл су6стратного раствора (3 мг/мл о-фенилендиамина, 1 мг/мл пербората натрия в 0,067 М пчтрата калия, рН 5). Через 30 мин инкубации при комнатной температуре в каждое углубление пипеткой подают 100 мкл 4 н серной кислоты, после чего замеряют оптическую плотность при 492 нм. При всех исследуемых пробах (используемое для покрытия янтитело и связанные с пероксилазой антитела) достигаются зависящие от дозы изменения абсорбции, Для выполнения покрытия также используют 10 мкл/мл иммуноглобулина против интерферона типа омега-1, полученного путем двукратной иммунизации кролика интерфероном типа омега-1 и частичной очистки из сыворотки осаждением 50ь-ным сульфатом

1602393

Формулаизобретения

Составитель Г. Смирнова

Редактор B.Вугренкова Техрел Л.Сердюкова

Корректор Н. Король

Тираж 4-5

Заказ 3280

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета ио изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-изд;п ельский к 1.1бии» г "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 аммония, Анализ с использованием связанной с энзимом пробы можно использовать не только для количественного определения интерферона типа омега-1, но и, например, для определения содержания типа омега-1 в лейкоцитарных интерАеронах или других интерАероновых препаратах, полученных из клеточных культур, П р и и е р 3, 0пределение интерферона типа омега-1 путем иммунометрии.

Антитело ОМГ-7 известными приемами маркируют системой N-сукцинимидил (2,3 Ч) пропионат (далее: " Н-NCII":

110 Сi/ììîëü). Для этой цели в силиконизиронанной емкости в вакууме сушат досуха 1 MCi раствора Н-ИСП.

Затем пипеткой добавляют 50 мкг раст- 20 вора мон AT ОМГ-7 (4,7 мг/мл) в содержащем буАер растворе поваренной соли с рН 7,4 и 3 мкл 1 М боратного буАера с рН 8,5. По истечение 24 ч при 4 С избыточный Н-NCII удаляют 25 о

20 мкл 1 М глицина в боратном буфере, разбавляют 250 мкл 50 мМ калий-АосАатного буфера с рН 7,4, 150 мМ хлористого натрия и 5 мг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого ско- -.p та и отделяют от маркированного антитела путем хроматографии на колонке (0,5х20 мс), содержащей сe< адекс

J 1

G 50 М. Антитело показывает специфическую активность примерно 10 Ci/r протеина, Дпя осуществления опыта протравленные полистирольные шарики диаметром 6,5 мм снабжают покры-тием из антитела ОМГ-? (10 мкг/мл в О, 1 М карбоната натрия с рН 9,5; 4р

1 ч при комнатной температуре). tt!арики подают в растнор AC/ПС, инкубируют в трубках в течение часа и затем два раза промывают 250 мкл воды.

К шарикам добавляют 200 мкл раствора 45 интерферона типа омега-1 н лонышающихся концентрациях и ЛС/ПС, инкуби— руют при 4 С н течение 3 ч, после о чего трижды промывают 250 мкл воды, Затем добавляют 200 мкл раствора маркированного антитела (100 нг/мл в АС/ПС; на трубку примерно 27000 имп/мин) и инкубируют при 4 С в тео чение 20 ч, Затем шарики трижды промывают 20 мкл воды, переводят в полипропиленоные трубки и добавляют 4 мл сцинтиллирующей среды, после чего замеряют связанную радиоактивность.

Использование изобретения позволяет получать монАТ высокой специАичности к интерферону типа омега.

Способ получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к интерферону типа омега, заключающийся в том, что животное Миз.musculus I.. подвергают двукратной иммунизации гибридным интерфероном, состоящим из 1 ч интерАерона типа омега-1 и 1 ч, интерферона типа of.— 2, и затем двукратной иммунизации иитерфероном типа омега-1, полученные иммунные клетки селезенки, предварительно прокультивиронанные в сывороточной среде для клеточной культуры, и миеломные клетки несецернирующей линии РЗХ63А8 8,653 раздельно промынают и суспендируют в бессывороточной среде для клеточной культуры, далее суспензии объединяют, центриАугируют,осадок суспечдируют в сре-. де, содержащей 45% RPMI 1640, 50 полиэтиленгликоля и 5% диметилсульАоксида, суспензию встряхивают, добавляют бессынороточную среду для клеточной культуры, а затем среду с 10 эмбриональной телячьей сыворотки, центрифугируют, осадок суспендируют н среде с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, гипоксантином, аминоптерином и тимидином, в суспензию вносят перитонеальные макрофаги мышей, инкубируют и отбирают целевой продукт.