Способ получения растений-регенерантов эспарцета

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается культивирования растительных тканей и клеток. Изобретение может применяться для ускоренного размножения эспарцета. Целью изобретения является повышение количества получаемых растений за счет массовой регенерации. Способ состоит в том, что после стерилизации исходный эксплантат высаживают последовательно на модификации питательной среды Мурасиге-Скуга для получения клеточной массы и ее размножения, а для регенерации и укоренения полученную клеточную массу высаживают на модифицированную среду Шенка-Хильдебрандта. 4 з.п. ф-лы, 6 табл. с S

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51)5 А 01 Н 4/00 списочник изовркт НИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ П1НТ СССР

Н АBTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4484746/13 (22) 05.08.88 (46) 28.02.91. Бюл. Р 8 (71) Всесоюзный селекционно-генетический. институт (72) С.Ф.Лукьянюк и С.А.Игнатова (53) 578.085.23 (088.8) (56) Zhuping Gy: Callus culture of

Sainfoin (0nobrychis) and plant

regeneration through somatic embryogenesis. Annals of Botany, 1987, 60, Р 3. (54) CIIOCOB ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ЭСПАРЦЕТА (57) Изобретение относится к биотех..Изобретение относится к биотехно- логии и может быть использовано в, селекции и семеноводстве эспарцета, в частности для ускоренного размножения, в биотехнологической работе: в селекции на клеточном уровне, для укоренения при черенковании, в других областях исследований — в фитопатологии, генетике.

Конкретной областью применения предлагаемого способа является сель-! скохозяйственная биотехнология — для массового получения растений эспарцета из тканей, клеток и протопластов.

Целью изобретения являетея повышение количества получаемых растений эа счет массовой регенерации.

Способ состоит в том, что после стерилизации исходный эксплантат (лист, стебель, корень, семядоли, нологии и касается культивирования растительных тканей и клеток. Изобретение может применяться для ускоренного размножения эспарцета, Целью изобретения является повышение количества получаемых растений за счет массовой регенерации. Способ состоит в том, что после стерилизации исходный эксплантат высаживают последовательно на модификации питательной среды Мурасиге-Скуга для получения клеточной массы и ее размножения, а для регенерации,и укоренения получен ную клеточную массу высаживают на модифицированную среду Шенка-Хильдебрандта. 4 з.п. ф-лы, 6 табл. завязи) высаживают последовательно .на модификации питательной среды

Иурасиге-Скуга для получения клеточ-. ной массы, затем ее размножения и, наконец, для регенерации растений и их укоренения на среду Шенка-Хильдебрандта.

Способ осуществляют следующим образом.

Отобранные для работы эксплантаты растений поверхностно стернлизуют насыщенным раствором гипохлорита кальция, или готовят к исполнению отдель- ные части растений, выращенных в сте-. рильных условиях.

Для получения инициальной каллусной массы эксплантат помещают на 2024 дней (1 пассаж) на питательную среду с солевой основой и витаминами по Мурасиге-Скугу, в которую добавлены тригонеллин 9-10 мг/л, индолилмас1630707 ляная кислота (ИМ1() 1,5-2 мг/л и культивируют в стандартных условиях.

Полученные каллусы для размножения помещают на 20-24 дня (2 пассаж) на

5 питательную среду с солевой основой и витаминами по Мурасиге-Скугу, индолилмасляной кислоты О, 20-0,25 мг/л, бензиламинопурина 0,05-0, 10 мг/л (6 БАП), пептон-гидролизата 200

250 мг/л, зеатин-рибозида 0,55

0,65 мг/л и оставляют в тех же условиях. Затем для получения эмбриогенных структур каллусы переносят на 1012 дней (3 пассаж) на жидкую среду

Мурасиге-Скуга с половинным содержанием солей и витаминами по прописи с добавлением тех же компонентов в тех же концентрациях и культивируют при 16-часовом фотопериоде и стан- 20 дартных температурных условиях и медленном качании, затем (4 пассаж) переносят на твердую среду на 20-24 дня, этого же состава, исключая пептонгидролиэат, с добавлением 0,30--0.35 мг25

6Д-диметилаллиламинопурина (бД-g) и, культивируют при тех же условиях до . появления регенерантов, которые за тем пересаживают с добавлением индо лилуксусной (ИУК) кислоты 0,50—

0,55 мг/л °

Пример. Проводят стерилизацию исходного экснлантата, высадку его, размножение полученного инициального каллуса, пересадку его для образования. эмбриогенных структур, регенерацию из них растений, исполь-, . зуя модификации питательной среды Мурасиге-Скуга, и заключительную пересадку растений для образования корней на модифицированную среду

Шенка-Хильдебрандта, и дальнейшее

1 выращивание растений при 16-часовом фотопериоде. При этом в первичную.

45 инициальную среду с солевой основой и витаминами по Мурасиге-Скугу вносят ,9 мл/г тригонеллина с 1,5 мг/л индо-

:лилмасляной кислоты и культивируют

1 в темноте. Для размножения каллусной массы в среду с солевой основой и виТаминами по Мурасиге-Скугу добавля ют 0,2 мг/л индолилмасляной кислоты

0,05 мг/л, 6-бензиламинопурина, 200 мгл/л пептон-гидролизата, 0,55 мг/л зеатнн-рибозида .и культивируют в темноте. Получение эмбриогенных структур и регенерацию осуществляют на среде Мурасиге-Скуга с половинным содержан .."м солей и витаминами (полностью по прописи) с компонентами предыдущего этапа, исключив пептон-гидролизат и добавив

0,3 мг/л бо-диметилаллиламинопурина.

Заключительную пересадку для ускоренного образования корней и растений осуществляют на среду Шенка-Хильдебрандта с добавкой 0,5 мг/л индолилуксусной кислоты и выращивают при

ib-часовом фотопериоде.

Аналогично примеру 1 осуществляют другие примеры, при этом проанализирована возможность использования различных эксплантатов и различныхконцентраций добавок к среде.

Результаты исследований представлены в табл. 1-6.

Использование изобретения позволяет за 10-12 недель за счет оптимизации образования эмбриогенного каллуса и его быстрой и массовой регенерации увеличить выход растений эспарцета из культуры тканей, облегчить процесс размножения и укоренения, а также расширить объем работ по клеточной селекции для получения исходного материала с ценными хозяйственными признаками для ускоренного создания новых сортов эспарцета.

Ф о р м у л а и з о.б р е т е н и я, .1, Способ получения растений-регенерантов эспарцета, включающий стерилизацию исходного эксплантата, посадку его на питательную среду, получение и размножение инициального каллуса, пересадку его на среду для образования эмбриогенных структур, регенерацию из них растений, пересадку их на среду для корнеобразования и дальнейшее выращивание при 16-часовом фотопериоде, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения количества получаемых растений за счет массовой регенерации, независимо от особенностей генотипа, получение инициального каллуса осуществляют на питательной среде Мурасиге-Скуга, в которую дополнительно вносят тригонеллин и индолилмасляную кислоту, размножение каллуса проводят на питательной среде Мурасиге-Скуга, до" полнительно содержащей индолилмасляную кислоту, б-бензиламинопурин, пеп тон-гидролизат, зеапин-рибозид, образование эмбриогенных структур и регенерацию из них растений осущест.

Таблица

Частота индукции каллуса в зависимости от эксплантата и инициальной среды (Ж от эксплантата). Сорт Закавказский

Вариант среды по способу

Эксплантат предлагаемому известному

МурасигеСкуга

МурасигеСкуга

Линсмайер Линсмайер

Скуга Скуга

2,4 Д к-та

РКК + три- 2,4 Д к-та 6-БАП гонеллин 6-БАП

50,8+2,7

66, 1+3, 1

70, 1+1,8

Семядоли Листья

Стебли

95,1+2,3 60,9+2,3

93,7+2,8 88,7+1,9

96,8+3,1 86,2+3,3

37,9+3,4

47,0+3,1

80,8+2,8

Таблица 2

Влияние различных концентраций ИМК на индукцию каллуса

Вариант среды

Эксплантат

МурасигеСкуга

МурасигеСкуга

Мур а сиг еСкуга

ИМК

1,5 мг/л

ИМК + HMK +

+ 9-10 мг/л + 11-12 мг/л тригонеллин тригонеллин

66,8+3,4

80 1+3,7

73,7+2,9

88,9+1,9

91,7+3,7

95,8+2,4

75,7+2,7

87,0+4,0

88,7+2,5

Семядоли .

Листья

Стебли

5 16 вляют на питательной среде МурасигеI

Скуга, содержащей микро- и макросоли в количестве, равном половинному, указайного в прописи, в которую дополнительно вносят индолилмасляную кислоту, 6-бензиламинапурин, зеатинрибозид и 6 (-диметиламинопурин, и дальнейшее ускоренное образование корней проводят на среде Шенка-Хильдебрандта, в которую добавляют индолилуксусную кислоту.

2. Способ по п ° 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в среду для получения инициального каллуса тригонеллин вносят в количестве 9-10 мг/л, индолилмасляную кислОту — в количестве 1,5-2 мг/л.

3. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в среду для раз30707

MHQiKpния каллуса вносят индолилмас-, ляную кислоту в количестве 0,20—

0,25 мг/л, 6-бензиламинопурин - в количестве 0,05-0,10 мг/л, пептонгидролизат — в количестве 200-250 мг/л, зеатин-рибозид — в количестве 0,55—

0,65 мг/л.

4. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в среду для образования эмбриогенных структур вносят компоненты по п.3, а пептон-гидролиэат заменяют на 6fg-диметиламинопурин, который вносят в количестве

0,3С-0,35 мг/л.

5.. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в среду для корнеобразования вносят индолилуксусную

20 кислоту в количестве 0 50-0 55 мг/л.

1630707

Таблица 3

Влияние компонентов среды на интенсивность накопления каллуса (прирост в Ж к исходной величине). Сорт Закавказский

Среда Мурасиге-Скуга

Показатели

ИМК

БАП

Зеатинрибоэид

249-300

250-340

140-178

170-200

160-198

150-208

180-238

200-220

190-248

За 2 пассажа

Минимум-максимум

В трех независимых опытах

207-219

169-211

298-370

Таблица 4

Среда Мурасиге-Скуга 1/2 солей

Показатели

2 3

6-БАП

ИМК

Зеатинрибозид б- БАП

HMK б-Д -g

6-БАП

ИМК

Зеатин» рибозид

ИМК

Зеатинрибозид б-ф-g

360-600

150-168

178-200

195

117

П р и м е ч а н и е. 1 все четыре компонента (по предлагаемому способу); 2:3:4 - с отсутствием одного из компонентов соответственно.

Т а блица 5

Влияние питательной среды на образование корней у растений-реге-нерантов эспарцета в трех независимых опытах,:X. Добавлена ИУК 0,500,55 мг/л во ace среды, Вариант среды (I

Шенка

Хильдебрандта

Гамбор Б-5 МурасигеСкуга

Сорт Закавказский

3,1 27,1

2,-1 15, 1

57,! .47,2

Образование эмбриодов (почек) за

2 пассажа минимуммаксимум

Образование растений за

2 пассажа

HMK

БАП

Пептонгидролизат

Зеатинрибозид

БАП

Зеатин.рибозид

Пептонгидролизат

ИМК

Пептонгидролизат

Зеатинрибозид

1630707

Продолжение табл.5

Влияние питательной среды на образование корней у растений-регенерантов эспарцета в трех не,зависимых опытах, X. Добавлена . ИУК 0,50 — 0,55 мг/л во все среды

Вариант среды

Гамбор Б-5 МурасигеСкуга

Шенка

Хильдебрандта

3 5

Сорт Песчаный

5,8

8,1

Сорт Мустанг

11,2

14,3

7,2

33,1

18 3

12,1

7,4

63,1

59,8

40,3

39,2

24,7

«7,1

80,1

49,3

76,1

Таблица 6

Инициация каллусных культур из эксплантатов сорта Закавказский в зависимости от условий-культивирова.ния через 7 дней от момента посадки,Ж

Среда Мурасиге-Скуга с добавлением ИМК и тригонеллина (по предлагаемому способу) Эксплантат

В темноте (по предлагаемому способу) При освещении (по известно му способу) Листья

Семядоли

Стебли

70-73

58-61

83-86

51-57

38-38

70-75

Составитель В.Демкин

Редактор С.Лисина Техред, M.Ìoðãåÿòàë Корректор Н.Ренская

Заказ 505 Тираж 348,Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при. ГКНТ СССР

113035 Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 г

1Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðîä, ул. Гагарина,101