Способ тестирования рестриктаз s @ и s @ из микроорганизмов рода sтrертомyсеs

 

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии, касается способов тестирования рестриктаз Sac II и Sst II рода Streptomyces и может быть использовано в молекулярно-биологических и биотехнологических исследованиях. Целью изобретения является повышение специфичности тестирования. Способ заключается в том, что клетки микроорганизмов вносят в охлажденный буфер и разрушают ультразвуком. Экстракт разрушенных клеток прогревают при 50-55°С в течение 10-15 мин. После охлаждения до 4-6°С экстракт , содержащий рестриктазу Sac II или Sst II, освобождают от дебриса. Активность ферментов на 1 г влажных клеток составляет не менее 6000 единиц для рестриктазы Sac II и не менее 10000 единиц для рестриктазы Sst II. 1 табл. Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 9/14

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

";Йл (21) 4498142/30-13 (22) 26.10.88 (46) 15.03.91. Бюл. N. 10 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) Л.И.Пучкова, Г.Н,Кривопалова и Г.Д.Серов (53) 577. 15.08. 155.2(088.8) (56) Журавлева Л,И., Орешкин Е.Н. Влияние условий культивирования и ультразвукового разрушения биомассы Streptomyces

achromagenes АТСС 12767 на выход эндонуклеаз рестрикции.

Прикл. биохимия и микробиология, 1985, т. 21, N. 3, с. 401 — 406. (54) СПОСОБ ТЕСТИРОВАНИЯ РЕСТРИКТАЗ SAC II È SST ИЗ МИКРООРГАНИЗМОВ

РОДА STREPTOMYCES

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии, касается способов тестирования рестриктаэ Sac II u Sst о

II в микроорганизмах рода Streptomyces u может быть использовано в молекулярнобиологических и биотехнологических исследованиях.

Цель изобретения — повышение специфичности тестирования.

Способ заключается в том, что клетки микроорганизмов вносят в охлажденный буфер и подвергают гидродинамическому разрушению ультразвуком. Экстракт разрушенных клеток прогревают при 50-55 С в течение 10 — 15 мин. После охлаждения до

4-6 С экстракт освобождают от дебриса, а надосадок содержит рестриктазу Sac II или ее изошизомер Sst II. Активность ферментов на 1 г влажных клеток составила не ме. Ы,, 1634714 А1 (57) Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии, касается способов тестирования рестриктаз Sac II u Sst

II рода Streptomyces и может быть использовано в молекулярно-биологических и биотехнологичеСких исследованиях. Целью изобретения является повышение специфичности тестирования. Способ заключается в том, что клетки микроорганизмов вносят в охлажденный буфер и разрушают ультразвуком. Экстракт разрушенных клеток прогревают при 50-55 С в течение

10 — 15 мин. После охлаждения до 4-6 С экстракт, содержащий рестриктазу Sac П или

Sst II, освобождают от дебриса. Активность ферментов на 1 г влажных клеток составляет не менее 6000 единиц для рестриктазы Sac

П и не менее 10000 единиц для рестриктазы

Sst II. 1 табл. нее 6000 ед. для рестриктазы Яас It и не менее 10000 ед, для Sst 11. Экстракт разрушенных клеток микроорганизма-продуцента нескольких экдонуклеаз рестрикции подвергают термообработке при 50-55 С, в результате повышается точность определения целевой рестриктазы (Sac (! и Sst II) эа счет освобождения клеточного экстракта от сопутствующих термолабильных ферментов. Термообработка клеточного экстракта позволяет также облегчить селекцию по целевому продукту, а из нескольких продуцентов выбрать наиболее активный.

В таблице приведена зависимость точности тестирования рестриктаэ от режима термообработки клеток.

Как видно иэ таблицы, оптимальной для тестирования рестриктаз Sac II u Sst II ÿâëÿется обработка клеточного экстракта при

1634714

Активность рестриктазы Sac !! в грубо очищенном экстракте клеток составила

6000 ед. в 1 г влажной биомассы или 90900 ед. в 1 г сухого мицелия.

Sst + Sst !!); (+) — наличие одной рестриктазы (Sac !! или Sst II); (О) — инактивация обеих рестриктаз.

Составитель В.Варламов

Редактор М.Недолуженко Техред М.Моргентал Корректор И.Эрдейи

Заказ 733 Тираж 362 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский кбмбинат "Патент", г. Ужгород, yn,Гагарина, 101

50-55 С. При температуре ниже 50 С сохраняется картина рестрикции, характерная для двух эндонуклеаэ рестрикции (Sac I +

Sac II или Sst I i Sst II), при 60 С и выше инактивируются.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Один грамм биомассы

S,achromogenes АТСС 12767 суспендируют в 4 мл трис- буфера рН 7,5, содержащего 0 5

MM ЭДТА, 50 мМ NaCI, 10 MM 2-меркаптоэтанола. Суспензию обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-2Т на резонансной частоте в диапазоне 22 кГц в течение 4-6 мин. Экстракт разрушенных клеток прогревают 15 мин при 50 С и центрифугируют 30 мин при 18000 об/мин, Активность рестриктазы Sac II в полученном супернатанте тестируют методом гидролиэа ДНК фага А с 1857 с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в горизонтальном блоке агароэы. 3а единицу активности фермента принимают такое его количество, которое в течение 1 ч полностью специфически расщепляет 1 мкг ДНК.

Реакционная смесь для гидролиза содержит 10 MM трис-буфер рН 7,5, 6 мМ

М9С!г. 6 мМ KCI, 6 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мкгДНК А с 1857 в40мкл смеси и2-10мкл грубого экстракта клеток. Разделение полученных фрагментов проводят в 0,1 М

Na-боратном буфере рН 8.2. содержащем 2

MM ЭДТА, в 1 агарозном геле. Окрашенные этидий-бромидом (1 мкг/л) гели просматривают в УФ-свете, Пример 2. Тестирование рестриктазы

Sst II в грубоочищенном экстракте клеток

S.stanford АТСС 29415 проводят аналогично примеру 1. Активность рестриктазы Sst II

5 составила 10000 ед. в 1 г влажных клеток или

150500 ед. в 1 г сухого мицелия.

Пример 3. Тестирование рестриктаэы

Sst II проводят аналогично примеру 1 за исключением того, что экстракт разрушен10 ных клегок S.stanford не подвергают термообработке, Активность рестриктазы Sst II в грубом клеточном экстракте не определяется, гестируется суммарная активность двух рестриктаз из-за присутствия рестриктазы

15 Sst I.

Пример 4. Тестирование рестриктазы

Sst !! проводят аналогично примеру 1 за исключением того, что клеточный экстракт прогревают 10 мин при 55 С. Активность

20 фермента составляет 10000 ед. в 1 г влажных клеток.

Пример 5. Тестирование рестриктаэы

Sst II проводят аналогично примеру 1 за исключением того, что экстракт разрушен25 ных клеток прогревают 12 мин при 52 С.

Активность рестриктазы Sst II в грубо очищенном препарате клеточного экстракта

S.stanford составляет 10500 ед. в 1 г влажных клеток.

Формула изобретения

Способ тестирования рестриктаз Sac II и Sst из микроорганизмов рода

Streptomyces, предусматривающий получе35 ние грубого экстракта путем разрушения клеток ультразвуком, центрифугирование с получением супернатанта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения специфичности тестирования, экстракт разрушенных

40 клеток микроорганизмов подвергают термообработке при 50-55 С в течение 10-15 мин.