Штамм бактерий вrеviвастеriuм iммотuм - продуцент эндонуклеазы рестрикции в @ 1

 

Изобретение относится к биотехнологии. Целью изобретения является выявление штамма - продуцента BREVIBACTERIUM IMMOTUM ВКПМ В - 4151, обеспечивающего получение эндонуклеазы рестрикции BIM 1, являющейся изошизомером MLA 1. Штамм выделен в результате поиска штаммов - продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов, обитающих в озере Балхаш, практически не патогенен для человека, растет на дешевой доступной питательной среде. Из 1 г сырой биомассы выделяют 2500 ед.фермента с удельной активностью 10000 ед/мл. Штамм B. IMMOTUM В - 4151 продуцирует эндонуклеазу рестрикции BIM 1 и имеет сайт узнавания TTCGAA, идентичный сайту узнавания MLA 1.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 С 12 N 9/14 р т" ",Ò*. ;. !,,:,-I:1, ., с (1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АBTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4392192/31-13 (22) 15.03.88 (46) 30.12,89. Бюл. Р 48 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ и

Институт микробиологии и вирусологии

АН КазССР (72) С.Х. Дегтярев, Н.И. Речкунова, М.И. Новожилова, Г.В. Семенченко и P.ill. Галимбаева (53) 577. 15(088.8) (56) Gelinas R.Е., Myers P.A., Weiss G.À., Murray К. Roberts R.I,, I.Mol. Biol., 1977, 114, 433-440.

de Waasd А. and Duyvesteyn М., А.

rch Microbiol 1980, 128, 242-247.

Smith Н.О., Nathan D., I. MolBiol ., 1973, 81, 419-423 °

Duyvesteyn M.G. С., de Waard А.

А new seguence — specific endonucle, ase from à thermophilic cyanobacterium. — FEBS Letters, 1980, 111, 423-426.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению эндо- . нуклеазы рестрикции Bim I изошизомера Mla I.

Целью из î бр е те ния являет ся выявление штамма-продуцента, нетребовательного к питательным средам и синтезирующего эндонуклеазу рестрикции, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов TTCGAA с высоким выходом.

Штамм бактерий Brevibacterium immotum ВКПМ В-4151 выделен в результа„„SQ„„1532584 А1

2 (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BREVIBACTERIUM

IMM0TUM — ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

РЕСТРИКЦИИ BIM I (57) Изобретение относится к биотехнологии. Целью изобретения является выявление штамма — продуцента

Brevibacterium immotum BKIIM В-4151, обеспечивающего получение эндонуклеазы рестрикции Bim I являющейся изошизомером Мlа Х. Штамм выделен в результате поиска штаммов — продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов, обитающих в озере Балхаш, практически не патогенен для человека, растет на дешевой доступной питательной среде. Из 1 r сырой биомассы выделяют 2500 ед. фермента с удельной активностью 10000 ед/мл. Штамм

В. fmmotum В-4151 продуцирует эндонуклеазу рестрикции Bim I и имеет сайт узнавания TTCGAA, идентичный сайту узнавания Мlа I. те поиска штаммов — продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов, обитающих в озере Балхаш. Предлагаемый штамм обладает следующими морфалоги1 ческими, культуральными и физиологическими признаками.

В молодых культурах (18-24 ч) правильные .неразветвленные палочки, длина 2- 8 мкм, диаметр 0.8 мкм. Старые культуры состоят из кокковндных клеток. Эндоспор не образуют. Грампо-ложительные, каталазоположительные, оксидазоотрицательные, не восстанав1532584

3 левают нитраты. Аэробы. Хороший рост в присутствии 4-6Х-ного NaC1 Не обр зуют кислоту из углеводов.

На рыбопептонном агаре после 48 ч нкубации при 28-30 С образуют кругte с ровными краями колонии, гладкие, лестящие, плоские, консистенция пас тообразная.

Цвет колоний желтый. Клетки обрауют пигмент типа каратиноидов.

В мясопептонном бульоне образует ть.

На синтетической среде с минераль м азотом рост скудный, колонии тоечные, серовато-белые.

Полученная рестриктаза Bim I харакеризуется следующими свойствами: узает и специфически расщепляет послеовательность нуклеотидов TTCGAA; оп- 20 имальное значение рН для действия естриктазы 7,5-9,0; оптимальная темература действия 37 С; для активноти рестриктазы требуются ионы Mg2, птимальная концентрация 5-15 мМ. 25

Рестриктаза из Brevibacterium imotum 19 названа Bim I согласно обще- . инятой номенклатуре Натана и Смита.

Штамм также содержит рестриктазу

im II, которая является изошизомеом Bsp R I.

Ферменты Bim I u Bim II хорошо тделяются друг от друга при хроатографии на фосфоцеллюлозе P-11, то позволяет получить препараты бонх ферментов без взаимных примеей.

Сравнение электрофоретической одвижности фрагментов, получаемых ри гидролизе ДНК hara h рестриктазой 40

im I с электрофоретической подвижностью фрагментов известной длины (Nru I гидролизат ДНК фага 3) поз воляет определить длину фрагментов

lEim I гидролизата. Получаемый набор фрагментов совпадает с набором фраг ментов, соответствующим гидролизу

ДНК фага 3 по последовательности TTCGAA.

Таким образом, фермент Bim I . узнает и гидролизует пбследователь,ность нуклеотидов TTCGAA и является ! изошизомером Mla I.

Ппя подтверждения последовательности узнавания рестриктазы Bim I проводили совместный гидролиз ДНК hara A рестриктазами Bim I +Nar I, а также Bim I + Xbu I. Получающиеся при совместном гидролизе дополнительные фрагменты ДНК соответствуют расчетным.

Пример . Клетки Brevibacterium immotum, хранящиеся в 50%-ном глицерине в L-бульоне при -20 С высевают на чашку с LA.

После инкубирования при 30 С клетки собирают петлей и вносят в 100 мл

В и выращивают до плотности 1,5 при

30 С. Затем культуру вносят в два литра LB и выращивают до плотности 2,5 при 30 С в течение 12-18 ч. После охлаждения клетки собирают центрифуги1 рованием. Выход биомассы 2 r сырого веса с 1 л среды. 4 г клеток суспендируют в 20 мл 0,02 М буфера трисНС1, рН 7,5, содержащего 10 з М р— меркаптоэтанол и 0,17. тритон X-100, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (18000 об/мин, 30 мин при 4 С). и надосадочную жидкость наносят на 30 мл фосфоцеллюлозы Р-11 (Mhatman), уравновешенной буфером

А (0,02 М калийфосфат, рН 7,5; 0,001 М р-меркаптоэтанол, 5 -10 4 M ЭЦТА), затем колонку промывают буфером А до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате. Адсорбированный материал элюируют раствором 1 М NaC1 в буфере А.

50 мл полученного смыва белков с колонки диализуют ночь против 2 л буфера А и затем наносят на 10 мл

ДЕАЕ-целлюлозы (ДЕ-52, Mhatman, Англия). уравновешенйой буфером А и элюируют 100 мл градиента 0-1,0 M NaC1 в буфере А. Объем каждой фракции 5 мл.

Аликвоты из каждой фракции (1 мкл) инкубируют 1 ч при 37 С с 1 мкг ДНК фага 3 и анализируют в геле агарозы.

Фракции (10-1б), расщепляющие ДНК фага 3, объединили, диализовали 3 ч против 2 л буфера А и наносили на 4 мл фосфоцеллюлозы P-11 (Whatman, Англия) и элюировали 40 мл градиентом 0-1,0N

NaC1 в буфере А. Объем каждой фракции

2 мл. Фракции, содержащие рестриктазную активность, определяли также как при хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе.

Фракции (8,9), содержащие рестриктазу

Bim I, объединили и диализовали против буфера А, содержащего 0,1 М NaC1 и 50%-ный глицерин. Полученный препарат фермента (1 мл) имел удельную активность 10000 ед/мл.

3а единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления

1532584 6 культивирования биомассы составляет всего 12-18 ч вместо 3 недель по прототипу, устойчив при хранении в . различных условиях.

1 мк ДНК фага A в течение 1 ч при

37 С.

Ферментный препарат хранят при

-20 С. Иэ 1 r биомассы получают

2500 ед. рестриктаэы Bim I.

Полученный штамм обеспечивает в 5 pas больший выход эндонуклеазы рестрикции Bim I, нетребователен к питательным средам, длительность

Формула изобретения

Штамм бактерий Brevibacterium immotum ВКПМ В-4151 - продуцент эндо1р нуклеазы рестрикции Bim I.

Составитель Н; Ходарев

Редактор Т. Лазоренко Техред Л.Сердюкова Корректор Н. Король

Заказ 8070/36 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.ужгород, ул. Гагарина, 101