Способ выращивания мицелиальных организмов

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, медицинской и микробиологической промышленности. Цель изобретения - повышение выхода биомассы мицелиальных организмов. Процесс выращивания Panus tigrinus 8/18, Panus tig- rinus 144, Streptomyces tumemacerans BK№-502 осуществляют в условиях гидродинамического расслоения культуральной жидкости и локализации мицелия внутри объема кулвтуральной среды в придонном слое. Перемешивание культуральной жидкости проводят посредством колебаний гидростатического столба всего ее рабочего объема с амплитудой колебания 1-3 мм. Аэрацию осуществляют через насыщение кислородом воздуха придонного слоя. В процессе культивирования отработанную культуральную среду, образующуюся над слоем мицелия, замещают свежей питательной средой. 1 ил (Л

„.Я0„„163644

СОКИ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (g1)g .С 12 Й 1/14, 1/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

Н АВЩКНОМУ сииаательствм

1 (21) 4673545/13 (22) 04.04с89 (46) 23.03,91. Вюп. Ф 11 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР и Научно-исследовательский вычислительмий центр

АН СССР (72) 5.В, Редикульцев, Н.В. Яиршнков, С.В. Петрикевич и И.Б. Пасяева (53) 577,15(088.8) (56) Высшие съедобные базидиомицеты в поверхностном и глубинном .культивировании. - Наукова думка, 1983, c. 257.

Авторское свидетельство СССР

Р 1308624, кл. С !2 N 1/00, 1985, (54) СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ ИИЦЕЛИАЛЬНЫХ

ОР ГАНИ З1ОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, медицинской и пищевой промышленности.

Цель изобретения - повышение выхода биомассы.

На чертеже представлена установка для осуществления способа.

Способ заключается в том, что процесс выращивания мнцепиальных оргйнизм0в осуществляют в условиях гидродинамического расслоения культуральной.жидкости и локализации слоя мицелня внутри объема культуральной сре-ды °

2 пищевой, медицинской и микробиологи- . ческой промышленности. Цель изобретения - повышение выхода биомассы мицелиальных организмов. Процесс выращивания Panus tigrinus 8/18, Ратае йц;

rinus 144, Streytomyces tumemacerans

ВК1+.502 осуществляют в условиях гидродинамического расслоения культуральной жидкости и локализации мицелия внутри объема кулвтуральной среды в придонном слое. Перемешивание культуральной жидкости проводят посредством колебаний гндростатического столба всего ее рабочего объема с .амплитудой колебания 1-3 мм. Аэрации осуществляют через насыщение кислородом воздуха прндонного слоя. В процессе культивирования отработанную культуральную среду, образующуюся над слоем мицелня, замещают свежей питательной средой. 1 нл.

Установка содержит ферментер I, крышку 2, перемешивающий узел 3 с пробкой 4 и штуцером 5, подключенным к генератору 6 пневмоимпульсов, штуцер 7 для ввода инокулята, штуцер 8 для отвода воздуха из ферментера, штуцер 9 для отвода культуральной среды, штуцер 10 для ввода в фермен- тер свежей питательной среды, насос 11, теплообменную рубашку 12, бу тыли 13 и 14 для питательной среды и для сбора культуральной среды, бактериальные фильтры 15 и 16 и технологическую сеть трубопроводов 17.

Перемешивающий узел 3 (устройство

1636445 для перемешивания и насыщения пита-:. тельной среды кислородом воздуха) содержит кусок силиконовой трубки диаметром 10,.мм, которую размещают в металлической трубе с боковым отводом.

Силиконовую трубку с одной стороны снабжают лепестковым клапаном, а затем герметично скрепляют с торцами металлического корпуса накидными гай- 10 ками со штуцерами. На металлический корпус одевают эластичную пробку, с помощью которой устройство вертикально закрепляют в крышке емкости . ферментера АНКУМ«2 таким образом, чтобы штуцер находился на расстоянии

5-10 мм от дна этой емкости.

Установку стерилизуют в автоклаве в режиме 1 атм в течение 1 ч, Из бутыпи 13 в ферментер 1 с помощью насо- 20 са 11 закачивают заданное количество питательной среды, Через. штуцер У вводят посевной мйцелий и включают генератор 6, пневмоимпульсы которого воздействуют на силиконовую трубку 25 перемешивающего узла 3, заставляя ее вибрировать с заданной частотой генератора 6. При поступлении пневмоимпульсов в перемешивающий узел 3 силиконовая трубка деформируется с заданной частотой, вследствие. чего образуется пульсирующий турбулентный газожидкостной поток, который активно насыщает слой питательной среды.

Воздух в ферментер поступает через бактериальный фильтр 15, установлен35 ный на бутыли 13 с питательной средой и отводится из:ферментера в атмосферу через бактериальный фильтр 16, установленный на бутыли 14 для слива отработанной жидкости. Заполнение полости перемешивающего узла питательной средой и воздухом и возврат образован-. ной газожидкостной смеси в ферментер параллельно с насыщением питательной 45 среды кислородом воздуха и перемешиванием придонного объема питательной среды вызывают колебания всего объема культуральной жидкости с амплитудой

1-3 мм и частотой, заданной генератором, и обеспечивают пассивное (ламинарное перемешивание культуральной жидкости в приповерхностном объеме

I йерментера.

При амплитуде колебаний гидроста° 55 тического столба культуральной жидкости 1 мм происходит обрастание мицелием стенки ферментера, а при амплитуде )3 мм увеличиваются энергетические затраты на проведение процесса. Частота колебаний гидростатн- . ческого столба.культуральной,жидкости выбирается, исходя из возможностей технологического оборудования, В процессе перемешивания в момент внесения в питательную среду посевного материала осуществляется его равномерное распределение по всему объему культуральной жидкости. В,процессе культивирования происходит расслоение культуральной жидкости на слой, содержащий биомассу, и жидкую фазу (кулвтуральную среду), Плотная биомасса растущего мицелия при пассивном (ламинарном) перемешивании, вызываемом колебаниями гидростатического столба культуральной жидкости, препятствует образованию пены и зарастанию стенок ферментера.

Периодически в процессе роста по мере исчерпания, субстрата культуральную жидкость, образующуюся вне слоя мицелия, сливают в бутыль 14, а в ферментер заливают новую порцию исходной питательной среды иэ бутыли 13.

В результате весь объем ферментера может быть заполнен биомассой, Для реализации способа может быть использовано любое фермеитационное оборудование, обеспечивающее насыщение жидкости газом и позволяющее осу-. ществить колебание объема культуральной жидкости с амплитудой 1-3 мм, например аппараты, перемешивающие устройства, в которых устанавливают вблизи дна БИОР-01 и БИОР-025. При этом ферментационная емкость должна быть снабжена устройством для колебания гидростатического столба жидкости от воздействия пневматического :. или гидравлического приводов.

Для иллюстрации работы способа используют либо ферментационную емкость от аппарата АНКУМ-2, в котором вместо традиционного перемешивающего узла используют устройство для перемешивания и газонасыщения питательной:. среды, либо колбы Бунзена, .снабженные аналогичным устройством.

Пример 1. 1 риб Panus tigrinus 8/18 смывают с косяка 19 мл стерильной водопроводной воды, вносят в

Ьерментер, сконструированный из кол- бы Бунзена, куда предварительно загружают 400 мл питательной среды следую» щего состава, г/л глицерин 25,0; пеп36445

10

5 16 тон 5,0;.соевая мука 2,5; KNOg 2,0; СаС1 б/в 0,5; MgSOg 7Й О О!1.

Для осуществления аэрации культуральной жидкости с придонного . объема, ферментера с частотой 3 Гц отбирают

50 мл питательной среды, которую перемешивают с воздухом в турбулент- . ном потоке и возвращают в придонный объем ферментера. Соотношение объема перемешивающего узла к диаметру ферментера выбирают из расчета колебания гидростатического столба рабочей жидкости с амплитудой 3 мм. Объем культуральной жидоксти перемешивающего узла составля т 50 мл, а диаметр колбы Бунзена 80 мм, что приводит к изменению гидростатического столба рабочей жидкости в ферментере с амплитудой 3 мм. Выращивание мицелия проводят при t24 C. Через

3 ч после инокулирования гриб равномерно распределяется по всему объему среды. Через 6 ч начинает формировать ся рыхлый верхний слой, но часть мице лия еще распределяется по всему объему среды, Через 12 ч после посева весь мицелий гриба занимает верхний

° елой культуральной жидкости, а в придонном слое активного перемешивания питательной среды имеются отдельные включения биомассы. Через 14 ч после. посева весь растущий мицелий флотирует в приповерхностный объем колбы, а под ним находится прозрачная с яркожелтой окраской культуральная среда, ие содержащая основного субстрата.

Культуральную среду через каждые последующие 10 ч сливают в бутыль, а в ферментер загружают исходную питательную среду до уровня рабочего объема.

Через 71 ч выращивания нижняя поверхность мицелиальной массы находится на высоте 15-20 мм от дна ферменте ра, что вызывает турбулизацию мицелиального слоя и затрудняет перезагрузку питательной средой, в связи с чем процесс останавливают.

Концентрация биомассы к концу процесса составляет 13,1 г/л, что в л2,6 рава больше, чем в известном спо собе, где концентрация биомассы составляет 5 г/л. Плотность локализованного слоя биомассы составляет 18,4 r/

В (Р= -а -. ° где В " количество биомассы ч в граммах по сухому весу; Vp - объем слоя мицелия в культуральной жидкос15

20 — 25

50 л 55 ти, л; Р— плотность биомассы, г/л), Микроскопический контроль показывает в пробах отсутствие мицелия с по-врежденными гифами, что свидетельствует об активном физиологическом состоянии биомассы.

Пример 2. Емкость от ферментера АНКУМ-2, оборудованную перемешивающим узлом, подключают к бутыпи, с питательной средой и бутыли для сбо-. ра культуральной среды. В шерментер заливают 700 мл питательной среды сос" тана, указанного в примере 1,.и вносят 5 мл грибной суспензии P.tigriпаз 8/18, выращенной по примеру 1.

Культивируют при амплитуде гидростатического столба культуральной жидкости 1 мм. Через 10 ч"культивирования мицелий собирается в приповерхностном объеме ферментера. Через 20, 44 и 58 ч роста в ферментере производят замену культуральной среды на свежую питательную среду. Процесс останавливают через 92 ч. В объеме 700 см грибной мицелий занимает объем 400:си (57 об.R ), что составляет 10,8592 г (c.â.) биомасы гриба. Концентрация биомассы составляет 15,6 г/л, что в -3,1 раза больше, чем в известном способе. Плотность локализованного слоя биомассы составляет 27,2 г/л.

Микроскопический контроль подтверждает отсутствие мицелия с поврежденны» ми гифами в препаратах биомассы.

Пример 3. В ферментер емкостью 600 мл вносят 200 мл питательной среды и 10 мл суспензии гриба

Panus tigrinus 144, выращенного в колбе. Состав среды и условия культивирования как в примере 1. Культи-: вируют при амплитуде колебаний гидростатического столба культуральной жидкости 1 мм, После формирования плотного верхнего слоя мицелия на протяжении фер ментации по мере исчерпания основного субстрата три раза в сутки сливают культуральную среду, заменяя ее порцией питательной среды, поддерживая постоянным рабочий объем ферментера..

Через 6 сут процесс останавливают, так как визуально грибной мицелий занимает почти весь объем ферментера.

Hs 200 см рабочего объема мицелий занимает Vp=140 см (70 .о6.7), Этот объем сырого мицелия содержит

9,6251 г абсолютно сухой биомассы.

Концентрация биомассы составляет

7 !6364

48,1. г/л, что s 9,6 pasa больше, чем, в известном способе. Плотность лока-. лизованного слоя биомассы составляет

68„5 г/л. Микроскопический контроль показывает в пробах, отбираемых во время замены среды, отсутствие мицелия с повреждейными гйфами.

Пример 4. Актийомицет Strep".;

tomyces tumemacerans ВКМ-502, синте зирующий метаболиты с инсектицидны.ми свойствами, выращивают"в колбах на

-."среде состава, г/л: лактоэа 2,0; сое- вая мука;-Й,0; дрожжевой эктракт5,0; j

РН 7, 0-7,2, в течение 4 сут при

t29 C sa .качалке" (200 об./мин), Па- лученный посевной материал вносят в ферментационную среду состава, г/л: крахмал 15,0; глюкоза 1,5; соевая мука 20,0; сухие дрожжи 5, 0; NaC1

2,5; СаСОъ 3,0; СоС1; 6НО0 0,05;

РН 7,2, в ферментер с рабочим объе- мом 1 л и проводят выращивание клеток в течение 5 сут как описано в примере 1. Амплитуда колебаний гидро- 25 статического столба культуральной жидкости составляет 1 мм. В конце первых суток на поверхности фазового раздела.и по периметру царги (про зрачнаяя стенка Ьерментера) образуют- 30 ся заметные невооруженным глазом скоп-. ления мицелиальной биомассы, кото» рые к концу 2 сут образуют рыхлый слой биомассы толщиной 8-10 мм, пере" крывающий всю повеРхность культураль- 35 ной жидкости в ферментере. Под слоем биомассы находится прозрачная отработанная среда, не содержащая основно- . го субстрата.

После замены питательной среды, @ восстановления режима аэрации и перемешивания в ферментере наблюдается расслоение мицелиального слоя биомассы, который увеличивается в 2 раза и имеет толщину 30 мм.

Через 96 ч процесс останавливают. К этому моменту плотный слой биомассы в ферментере имеет толщину 67 мм, что составляет 50Х его рабочего объема. Концентрация биомассы составляет

9,5 г/л. сухого вещества, что в 1

М,4 раза больше, чем при выращивании известным,методам. Плотность слоя биомассы составляет 19 г/л, Таким образом, предлагаемый способ выращивания мицелиальных организмов позволяет повысить выход биомассы в культуральной жидкости в 3- tO pas по сравнению с известным способом, упростить процесс .выделения зкзометаболитов, а также увеличивает производительность аппарата при снижении энергозатрат, Формула изобретения

Способ выращивания мицелиальнык организмов, предусматривающий перемешивание культуральной жидкости, помещенной в замкнутый объем ферментера, и аэрацию, осуществляемую в ее локальной эоне,.о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода биомассы, перемешивание осуществляют воздействием колебании с амплитудой 1-3 мм имеющегося объема культуральной жидкости с получением слоя биомассы и жидкой фазы, в качестве локальной зоны для аэрации используют придоннйй слой,а жидкуюфазу, свободную от биомассы, периодически за,,мещают свежей питательной средой.

1б3644

Со ставит ель В .. Соина

Редактор Н. Яцола Техред Л.Олийнык . Корректор.М. Самборская

Подписное

Заказ 796

Тираж 379

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101