Способ получения мутантов у спорообразующих бактерий sтrертомyсеs и сlоsтridiuм асетовuтyliсuм

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получении мутантов промышленных штаммов актиномицетов и анаэробнон бактерии Clostridium acetobutyii- L-uia Целью изобретения является повышение выхода мутантов с минимальным числом множественных мутаций при увеличении абсолютного числа мутантов в популяции клеток0 Способ заключается в обработке на стадии прерастания спор бактерий Clostridium aretobuty- 1 irura и бактерий рода Streptomyces низкими концентрациями химических мутагенов, 1 табл0 3 (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1645 01 А 1 (5I)5 С 12 И 15/О1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АЬТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4490424/13 (22) 04.10.88 (46) 30.04.91. Бюл Y 16 (71) Всесоюзный нау ьно-исследовательский институт генетики и селекции промышпенности микроорганизмов (72) Н.Д. Ломовская, Т,А, Чиненова, О.А„ Елочкова, И,.В„ Бирюкова, Л.Ii. Емельянова, Т.А,. Воейкова, Н.И. Икртуиян и С.Е. Лбилев (53) 575.224.2,4.08(088„8) (56) Bowring N., Norris Y. J Appl.

Bacteriology, 1985, 58, р. 577-584.

Genetic manipu1аtion оf Streptomyces А laboratory manual. The Tohn

Innes Foundation. J. Cen. IIicrobiol

1978, 107, р. 93-102.

Изобретение относится к микробиологической промьиыенности, в частнос ти к получению мутантов промышленных шта а1ов актиномицетов и аназробной бактерии Clostridium acetobutylicum, Цель изобретения — повышение выхода мутантов с минимальным числом множественных мутаций при увеличении абсолютного числа мутантов в популяции клеток.

Способ осуцествляют следуюцим образом.

Применительно к актиномицетам: на чашки с минимальной средой, содержацей необходимые . акторы роста, наносят полужидкий агар того же состава, содержащий спороную суспензию культуры и раствор мутагена в нужной концентрации. На определенной стадии проЪ) ( (54) CIIOCOIJ IIOJIY×ÅØIJI Г1УТА1!ТОБ У СПОРООБРАЗЛЦ11Х БЛЕТЕРИ11 БТ1ЖРТО117СЕБ

И С1,0STI .П) ПЛ1 ACLTOBUTYI.TCËI (57) 11эобретепие относится к микробиологическоп промьплненности, в частности к полученин мутантов промышленных ытаммов актиномицетов и анаэробной бактерии Clostridium acetobutyliсиь1. Целью изобретения является повыиение выхода мутантов с минимальным числом множественных мутаций при увеличении абсолютного числа мутантов в популяции клеток. Способ заключается в обработке на стадии прерастания спор 6актерий Clostridium acetobuty1 1сum и бактерий рода Streptomyces низкими концентрациями химических мутагенон, 1 табл. растания спор смесь центрифугируют, отмывают физиологическим раствором или дистиллированной водой и рассевают на чашки со средами, содержацими антибиотики в определенных концентрациях в качестве селективных агентов, R дпя подсчета мутантов Ant, устойчивых к антибиотикам.

Применительно к С„ acetobutylicum: споры вносят в полужидкий агар, содержаций мутаген в нужной концентра-, ции и эту смесь наносят на чашки с

Э твердым слоем агара, содержацие в качестве селективного агента антибиотик. Чаики инкубируют в анаэробных условиях при 37 С в течение 6472 ч и отбирают мутанты, устойчивые к антибиотику.

1645301

40 существенно не снижается. Для мутагенов ДДЦТДП, Д БП, НИИ и НГ выживае 55 мость прш оптимальных для получения мутантов дозах мутагена составляет .от 30 до 100Х. Исключение составляет лииь мутаген HXO: использование

Иутагеннув обработку прорастающих спор С. acetobutylicum производят в слое полужидкого агара, как и в случае антиномицетов. Однако из-за чувствительности анаэробных бактерий к кислороду нет воэможности определить число выживших клеток традицнонным методом разведения. Поэтому учет мутантов С. acetobutylicum проиэво- 10 ! дят путем подсчета абсолютного числа выросших на селективной среде колоний.

Пример 1. Определение эффективности мутагенного действия 15

N-метил-N-нитро-N-нитро зогуанидина (НГ) .

На чашки с минимальной средой, содержащей в качестве факторов роста необходимые концентрации крахмала н 20 дрожжевого экстракта, наносят полужидкий агар со споровой суспензией клеток S. aureofaciens ТБ 633 ФУ н

HI в разных концентрациях. После прорастания спор до определенной 25 стадии на чашки вторично наносят полужидкий агар, содержащий антибиотик олеандомицин в концентрации 10 мкг/мп для отбора мутантов 01п . При конй центрации НГ 5 мкг/мг число полу- 30 ченных мутантов является максимальным и составляет 10 на 10 выживших клеток (см. табл.).

Пример ы 2-5. Определение эффективности мутагенов 4-хинолин-135 оксида (НИО), N-нитрозо-К-метилмочевины (Н?К), динитробензоперилена (5, (5,10-ДНБП), ДДЦТДП-6,7-диамино-4,9диокси-5,10-диоксо-4,5 9 10-тетрагидро-7,9-диазапирена (ДДЦТДП).

Эксперимент осуществляют также, как в примере 1, но используют мутаген НХО (в концентрации 1 икг/мл, приводяцей к уровню мутаций 1,5 10 ), 7

Шй1 (в концентрации 10 мкг/мп, даю" 45 цей уровень мутаций 2 10 ), ДНБП (конФ центрация 1 мкг/мл, число мутантов

1 " 1О ), ДДЦТДП, который в концентрации 50 мкг/мл приводит к уровню мутаций 5 10 (см. табл.), 50

Практически при всех используем@к дозах мутагенов наблюдают, что выживаемость клеток штамма $. aureofacieps его в концентрации 1 мкг/мп приводит к снижению выживаемости клеток до

1 ° 10, а в концентрации 0,5 мкг/мл—

-В до 107. Суцественно, что во всех приведенных примерах абсолютное число мутантов, полученных после обработки мутагенами, значительно выше спонтанного уровня, а также на 2-3 порядка превышает число мутантов, полуиенных при соответствующих концентрациях мутагенов по способупрототипу (см. табл.)

Пример 6. Определение эффективности этилметансульфоната (ЭИС) для С. acetobutyl icum.

В расплавленный полужидкий агар (0,8X) объемом 2,5 мп при 45 С вносят 100 мкл суспензии спор и мутаген

ЭМС в объемах, соответствующих его конечной концентрации 0,6 мг/мл. Смесь перемешивают, наслаивают на заранее подготовленный нижний слой агара, содержащий в качестве селективного фактора рифампицин (3 мг/мп) и учитывают через 72 ч инкубации в аэростате

R число устойчивык к рифампицину (Rif ) мутантов. Для концентрации этилметансульфоната (0,6 мг/мл) число мутантов равно 185, что в 92,5 раза превышает число мутантов, получаемых при таких же концентрациях мутагена стандартным методом прототипа (см. табл.).

Применение указанного способа позволяет значительно (до 100 pas no сравнению с прототипом) уменьшить дозы мутагенов, используемых прн получении различных типов мутаций. Это приводит к экономии расхода мутаге нов и повышению безопасности работы с ними. В свою очередь, низкие дозы мутагена обеспечивают увеличение вью живаейости клеток, а следовательно, и абсолютного числа мутаций в популяции, т.е. повышают эффективность мутагенеэа. При этом сокращается число вредных и множественных мутаций. Способ позволяет быстро и с хорошим выходом (число мутантов в 10-100 раз больше, чем в способе-прототипе) получать мутанты с эаданньвчи свойствами бактерий, а также является экслресс-методом для определения эффективности действия различных мутагенов по отноше нию к актиномицетам.

Способ может использоваться в.;процессе рациональной селекции с целью улучшения технологических свойств щк Доза, икг/мл

НХО НИМ ДНБП ДДДТДП

НГ

0,5

5

5 10з

1 5.10з

1 ° 102

1, 10з

1 .10з

1 103

1, 10>

1,4 10

2 ° 10

2 10

1,4 10

1 10

1 102

1"10

9 ° 10

2 10

1 10

2 10з

1 ° 1Оз

4 10

1 ° 1О

5 ° 10

Hp и и е ч а н и е„ Эффективность действия мутагейов учитывают по увеличению числа мутантов Oln", устойчивых к олеандомицину, число спонтанных мутаций 01п - 1 ° 10з на 10 выживших клеток.

Составитель С. Бандрин

Техред М.Дндык Корректор М. Иаропя

Редактор И. Касарда

Заказ 1322 Тираж 389 Подписное

BHHHHH Государственного комитета по изобретениям н открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

5 1645301 d мышпенных штаммов — лродуцентов био- батывают иутагенои на стадии прологически активных вецеств. растания спор, а в качестве мутагена используют N-метил-Янитро-N-ннтф о р м у л а и з î 6 р е т е н н я Роэо-гуанидшюи (НГ) в концентрации

Способ получения мутантов y cnopo 5 25 ик /ил или 4 образуюцзд бактерий Streptomyces - оксидои (IIXO) О,."-1 мкг/ип, или и Clostridium acetobutyl icum, пре- N-нитрозо-Н-иетилиочевиной (НИИ) дусиатриважций обработку культуры 1-50 икг/ил, нли динитробензоперимутагенаии с последукицим отбором Ip ste oN (5110 ДНБП) 1-25 мкг/mrý мутантов на селективных средах, о т- Д ИТДП-2,"-диаиино-4,9-диокси-5 10л и ч а ю ц и и с я тем, что, с диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-7,9-днцелью повьииения выхода мутантов с аэапиреном (ДДДТДП) 5-50 мкг/ип, минимальным числом множественных му или этилиетансульфонатом (ЭИС) 0,2таций, бактериальную культуру обра- 15 У8 м /мп

1

Частота индуцированньм мутантов как показатель э4хрективности действия различных мутагенов на штамм S. aureofaciens