Способ очистки суспензии эритроцитов от холестерина

 

СООЗ COBETCHHX

РЕСПУБЛИК (51) С 01 11 33/92

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 6 .1 736/14 (22) Оо.01."9

1 -46) 30.04,91. nÃãë. Х 16 (7) ) I!ау но-исследовательский институ. пе, .атрии Л11Н ГССР и Московский инс iнту тонкоЙ химической техноло

i Hki HM. 11. B,Ë M H CO :i (, 2) ll. В. Банков а, И. Ц. i:оджаева, N, И. Баканов, Ю.Л. Зотов, И. В, Кислов а и 11. В. Кислиновск ая (53) 612.015 (ОЗЯ.8) (56) Вопросы медхи ии. !982, 1!" 6, с. 131-133. (54) СПОСОБ ОЧРГТ Ж С Г! .1.НВИИ РИТ-РОЦИТОЗ 07 ХО !ЕС.ГРРНЛ (57) Изобретение относится i, медипиИзобретение относится к медицине, а именно к способам очистки эритроцитов.

Цель изобретения — повышение физиоло..ичности способа за счет сохранения нативных свойств клеток.

Пример 1. К 200 мкл уплотФнной взвеси эритроцитов,добавляют

500 мкл буфера и 200 мкл 0,5-1,07-ного латекса. В контрольные пробы (без латекса) добавляют 700 мкл трисНС1 буфера. Пробы инкубируют 30 мин при 37 С, затем пробы эритроцитов о промывают 3-4 раза физраствором (до полного отмывания от латекса).В 57 взвеси эритроцитов в буферной среде определяют содержание МДЛ : 400 мхл взвеси + 450 мкл буфера + 500 мкл

207.-ной трихлоруксусной кислоты

+. 150 мкл 5н. НС1 + 600 мкл 0,67Xной тиобарбитуровой кислоты,добавля,.SU„„1645899 A 1 не и может быть использовано для очистки эритроцитов от холестерина и МЦЛ. Целью изобретения является повышение физиологичности способа.

Цель достигается применением известного вещества, латекса,используемого в резиновой промышленности в качестве сорбента малонового диальдегнда, и холестерина из эритроцитов. Для этого готовят взвесь латекса в трис-НС1 буфере (pH 7,4) в концентрации 0,5-1,07. и инкубируют отмытые эритроциты 30-40 мин в соотношении

1:I с латексом с добавлением буфера или без него при непосредственном контакте с латексом, 4 табл ° ют в центрифужные пробирки,,встряхивают и ставят в баню 93-99 С. Через

20-30 мин пробы центрифугируют и в надосадочной жидкости определяют количество МДА на спектрофотометре

СФ-26 при 532 и 600 нм. Содержание ф,! холестерина определяют ферментативным методом по наборам Lab.systems (Фин- д ляндия). Конъюгированные гидроперекиси определяют по УФ-свечению (233 нм) гептанового слоя их экстрак- © та из эритроцитов. Интенсивность деградации МДА определяют по проценту разрушения введенного в пробу эритроцитов экзогенного МЛА. В конт - ДЭВ, рольных пробах (беэ латекса) содержание МДА и ХЛ составляет соответст4 венно 2, 28 и 29,12 нмоль/10 эр, а .после экспозиции с латексом их содер" жанне уменьшилось соответственно до

1,60 и 19,12 нмоль/10 эр (см.табл.l)

164539

Пример 2. К 200 мкл уплотненной взвеси эритроцитов добавляют

200 мкл 1Х-ного свежеприготовленно го латекса, встряхивают и инкубируют при 37 С 30 мин. Контрольнук1 пробу инкубируют с 200 мкл буфера. чатем эритроциты центрифугируют, отделяют надосадочную жидкость, 3-4 раза промывают физраствором и определяют содержание в контрольной и опытной пробах МДА и ХЛ. Содержание этих веществ в контрольной пробе составило соответственно 1,19 0,15 и 23.08 +

+3,48 нмоль|10 эр, а после экспозиб ции с латексом 0,76+0, 11 нмоль/

/10 эр (P C 0,05) и 15,4842,20 эмили/

/10 эр (и 8) . Как и в первом варианте, низкие значения РДА и УЛ латекс не изменял ° 20

Таким образом, экспозиция с латексом эритроцитов как с буферной,так и без буферной средой приводит к удалению из клеток красной крови МДА и

ХЛ, повышенное количество которых 25 приводит к повышению вязкости, жесткости мембран, снижает активность многих мембранных ферментов, ухудшает структурно-функциональное состояние клеточной мембраны. Не меняется после инкубации с латексом деформационный индекс эритроцитов, определенный по степени фильтрации эритроцитов через мембранный фильтр sin por (без латекса деформационный индекс эритроцитов 0,191+0,12, а после экс35 позиции с латексом 0,230+0,020), не изменяется и степень гемолиза эритроцитов, определенная по выходу гемоглобина. Эти данные вместе с уменьшением содержания ХЛ и МДА указывают на улучшение реологических свойств эритроцитов и структурно-функционального состояния клеточной мембраны, бОЖ-ный натуральный латекс, содержащий аммиак, разводят в буферной среде (трис-НС1 буфер, pH=7 4, 25 мМ, разведенный 1:1 физраствором с добав лением 0,175 М КС1) до концентрации

0,5-1 03. Другие концентрации латекса оказались менее эффективными:

0,1Х-ный латекс не оказывает существенного влияния на содержание МДА и ХЛ в эритроцитах, а 5-107.-ный латекс способствует склеиванию эритроцитов. Таким образом, наиболее физио55 логическая и активная концентрация латекса, используемого в качестве сорбента, является 0,5 — 1,0X. B качестве биологического материала использовались отмытые в физрастворе эритроциты.

В табл ° 1 показано влияние двух разведений латекса на показатели в эритроцитах.

Как видно из табл.1, содержание

МДА и ХЛ уменьшается в эритроцитах только при инкубации их с 0,5

1,0Х-ным раствором латекса. При этом существенно не меняется содержание гидроперекисей. Интенсивность деградации МДА,которая в основном зависит от активности альдегиддегидрогеназы, также не меняется. Это позволяет полагать, что МДА из клеток красной крови удаляется путем адсорбции, а не повышением активности его ферментативного разрушения, При индивидуальном разборе материала выявлено, что МДА и ХЛ наиболее эффективно удаляются в случае повышенного их содержания в эритроцитах, тогда как при нормальном содержании этих продуктов инкубации с латексом не приводит к их изменению (см. табл ° 2).

В табл. 3 и 4 приведены факты повышения физиологичности способа.

Латекс адсорбирует только холестерин, но не фосфолипиды, что значительно снижает повышенное соотношение холестерин/фосфолипиды. В отличие от латекса дигитониновый сорбент (прототип) удаляет и фосфолипиды (в два раза меньше,чем холестерина), а активированный уголь в равных количествах адсорбирует эти два вещества.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н н я

Способ очистки суспензии зритроцитан от холестерина путем обработки сусцензии сорбентом, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения физиологичности способа за счет сохранения нативных свойств клеток, а также возможности одновременной очистки oò малонового альдегида, в качестве сорбента используют натуральный латекс, при этом взвесь эритроцитов смешивают с О 5-1,0Х-ным латексом я соотношении 1:1, инкубируют смесь 30 мин, а затем отмывают эритроциты физиологическим раствором.

1645899

Т а б л и ц а !

Сорбция латексом малонового диальдегида и холестерина

Показатели

Инкубация эритроцитов

J с 0,017.-ным с 0,5-1,ОХ-ным латексом латексом без латекса

ИДЛ, нмоль/

/10 эр

И+ш

Холестерин, нмоль/1О эр

И а

Де градация

МДА» 7.

И Фш

Гидроперекиси,Д/10 эр и = IB п=6 и ° 17

I, 601-0, 16 и l3

lо,12+1,38

2,28+0,26 и l3

29, 123-2,62

2,54+0,26 и 3

29, 76+8,62 и = 14

32,9+2» 21

n = l5

34»412,69 и 6

33,3+1,61

n= l7

7, 62+1, 54 и=6

5, 25+1, 39 и 15

3,8"" 1,62

M+ш

КРазличие достоверно с lloKdçëòåëÿìè в пробах эритроцитов, не инкубированнь х с латексом, P = 0,05.

Таблица2

Зависимость сорбции латекссм ИДА и ХЛ от исходного содержания этих метаболитов в эритроцитах

Подгруппа ЩА, ммоль/10 эр.

Холестерин, нмоль/1 О э р

6 без латекса с латексом без латекса с латексом

4 и = 10

2,49+0,31 1,47+0,20

P (0,05 п7

36,12+2,62 22,50+3,12

P(0,01

С повышенным содержанием метаболитов

С низким и 6

l 0+О, l 4 1, 32+0, I 9 и 6

20» 88+3» 38 18»,38+1 ° 75 содержанием метаболитов! 64 во

Т а б л и ц а 3

Изменение содержания xo!Jecтерина,фосфолипидов и индекса ХС-ттЛ в эритроцитах детей после инкуба— ции с натуральным латексом

ХС / ll .l1

Холестерин, нмоль/

/10 эр т!тост!толип идо нмоль /1 0 эр

il тт и/и т тт т j

П р и м е ч а н и е: i — инкубация эритроцитов без латекса;

II — инкубация зритропитов с латексом.

Т а б л и ц а 4

Содержанит малонового диальдегида, холестерина

H фОСфОЛИПИдОтт В ЛатЕКСЕ (17) ПОСЛЕ HHK áéHHH зритрони гами (n = 4-3) Проба 1ЯА, 1молы l o эр Холестерин, т л нмо и /10 эр с .!тол ипиды, нмоль/! 0 эр

О, 1 l+ О, О О 5 1, 7 2! О, 2 5

1,GI+0,13

Беэ эритроцитов

Инкуб ация

2, 16iО, 23 О, 1 5+0,040 1, 79+0,035 с. эритроцитами

Р!!еньт.те 0,01 Равно 0,05 Нет различий

Составитель А,Агуреев

Техред А,Кравчук

Корректор (;,Ieêìàð

Редактор И. Келемеш

Заказ 1348 Тираж 42! Подписное

BRGI1IH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при (КНТ СССР

113035, т1осква, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательскии комбинат "Патенг", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

1. б, 3, 4

39,3

50,6

35,5

30,5

19,3

35, 2«+

+5,32

25,0

35,5

26,9

14,0

13,4

22,93+

+4,13

46,9

30,0

20,0

33,3

46,2

36, 38+

+5, 03

40,6

35,0

35,0

36,5

40,6

37,54+

+1,06

0,85

1,69

1,78

0,81

0,43

1,11

0,25

0,6!

1,00

0,77

0,33

0,33

0, 62+

+0, l 2