Способ определения активности фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов

 

Изобретение относится к исследованиям биологических материалов, в частности к определению активности фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов крови, ч го может быть использовано в исследованиях состояния сенсибилизации Т-лимфоцктов к определенным антигенам с целью диагностики иммунопатологических заболеваний. Цель изобретения - упрощение способа за счет применения желатина для удержания клеток в малом объеме Для этого лейковзвесь осаждают в среде 199 с 1 %-ным желатином , осадок помещают в лунки планшета для иммунологических реакций, инкубируют 30 мин при комнатной температуре, затем 300 мин при 4°С, после чего добавляют исследуемую культуральную жидкость, инкубируют 18-24 ч при 37°С. измеряют зоны миграции и по их разнице в контроле и опыте судят об активности фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов.

сонзз соретских

СацикпистичЕСких

Республик (5k)5 6 01 N 33/48

Госудюстееннь.й комлтБт пО иэсБРетения 4 и ОткРытиям пРи Гкит сссР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCÊÎÓY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4362657/14 (22) 20.10.87, (46) 15.05.9 ;. Бюл, Ф 18 (71) Институт клинической иммунологии

СО АМН СССР (72) В,С.Кожевников и В.П,Лозовой (53) 612.015 (088.8) (56) Int. Arch. А!!ег9у. 1970, v,39, р.172-178. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФАКТОРА, ИНГИБИР гОЩЕГО МИГРАЦИЮ ЛЕйкОЦИТОВ (57) Изобретение относится к исследованиям биологических материалов, в частности к определению активности >актора, ингибирующего миграцию лейкоци":ов крови, что может быть использовано в сследованиях

Изобретение относится к исследованиям биологических материалов, в частности к определению фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов.

Цель изобретения — упрощение предлагаемого способа — достигается;-::,-ем осаждения лейковэвеси в среде с 1%-ным желатином с последующей. инкубацией осадка в лунках иммунологического планшета в течение 30 мин при комнатной температуре (для оседания клеток на дно лунки),-а затем

30 мин при 4ОС (для образования твердого геля, в котором сконцентрированы лейкоциты}. После этого в лунки добавляют исследуемую культуральну;о среду и инкубируют планшет при 3! Ñ не менес 18 ч, после чего измеряют эоны миграции клеток и рассчитывают активнос"",ü фактора ингибирующего миграцию лейкоцитов, по формуле

„.,5Q„„1649431 Al состояния сенсибилизации Т-лимфоцитов к определенным антигенам с целью диагностики иммунопатологических заболеваний.

Цель изобретения — упрощение способа за счет применения желатина для удержания клеток вмалом объем,е. Для этого лейковэвесь осаждают в среде 199 с 1 -ным желатином, осадок помещают в лунки планшета для иммунологических реакций, инкубируют 30 мин при комнатной температуре, затем 300 мин при 4 С, после чего добавляют исследуемую культуральную жидкость, инкубируют 18-24 ч при 37 С, измеряют эоны миграции и по их разнице в контроле и опыте судят об активност и фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов. о/ ИУ . 1QQ (%) где А — увеличение зоны миграции в контроле;

Б — увеличение эоны миграции в опыте (т.е. в присутствии исследуемой культуральной среды);

% NM — процент ингибиции миграции лейкоцитов.

Пример 1, Лейковзвесь, полученную путем расслаивания гепаринизированной крови трех доноров, отмывали средой 199, после третьей отмывки суспендировали в среде 199 с 5 -ной сывороткой крупного рогатого скота (СКРС) в концентрации 1 х х 10 кл/мл и культивировали в течение 1 ч

6 при 37"С с фитогемагглютинином (ФГА) в разведении 1:1000 в объеме 2 мл. После культивирования клетки трижды отмывали средой 199 и культивировали в той же кан5

20

30 центрации еще 18 ч при 37"С в среде 199 с

5%-ной СКРС (опыт). Контрольные культуры проводили также, но без добавления ФГА. ,. После культивирования забирали надосадочную жидкость, которую центрифугировали при 300 об/мин в течение 10 мин для удаления остатков клеток, после чего тестировали на активность фактора ингибиции миграции.

К 4,5 мл гепаринизированной крови добавляли 0,5 мл 10%-ного раствора желатина, инкубировали 45 мин при 37 С лейковзвесь дважды отмывали средой 199 и один раз средой 199 с 1%-ным желатином. Надосадок сливали, остатки удаляли стерильным марлевым тампоном, осадок встряхивали и разносили по 2 мкл в центр углубления У-образных лунок планшета ("Флоу", Шотландия). Планшет инкубировали 30 мин при комнатной температуре, 30 мин — при

4 С и добавляли по 0,1 мл среды 199 с 5%ной СКРС. Затем, оставив в качестве контроля по две лунки от каждого донора, в остальные добавляли по 0,1 мл надосадочной жидкости от тестируемых культур и Ф ГА 2 в конечном разведении 1:5000. Планшет инкубировали 18 ч при 37 С во влажном воздухе с 5% COz, после чего измеряли диаметры зон миграции с помощью штангенциркуля.

Средние величины диаметров зон миграции (каждый из трех. доноров крови тестировался на лейковзвеси от трех неродственных доноров) приведены в табл. 1.

Наименьшие зоны миграции получены 3 в лунках с надосадочной жидкостью ФГА.стимулированных клеток, средний % ИМ cocTBBMll 84% в опыте и 7% е контроле. % ингибиции миграции (% ИМ) рассчитывали по формуле 4

% ИМ = — х 100 (%)

А где А — разность диаметра (средняя из двух лунок) зоны миграции в лунках с ФГА и без

ФГА; Б -разность диаметра зон миграции 4 в лунках с ФГА и надосадочной жидкостью и в лунках беэ ФГА.

Таким образом, надосадочная жидкость лейкоцитов, стимулированных ФГА, содержит фактор ингибиции миграции лейкоци- 5 тов.

Пример 2. Иэ периферической крови здоровых доноров выделяли мононуклеарные клетки с помощью центрифугирования на растворе верографии-фиколл. после чего из мононуклеаров выделяли Т-клетки, образующие ранние розетки (рЕ-P0K) и восстановленные розетки (вЕ-P0K) с помощью осаждения соответствующих видов розеток на растворе верографин-фиколл(по известной методике), По 1 х 10 клеток (рЕ- и вЕPGK) инкубировали при 37 С в мл среды

199 с 10% АВ-сыворотки в присутствии фитогемагглютинина (Ф ГА-Р, "Дифко" США) в конечном разведении 1:1000 в течение 1 ч, трижды отмывали средой 199 и культивировали в концентрации 1 х 10 кл/мл в среде

199 с 1.0% АВ-сывороткой в течение 18 ч.

После инкубации надосадочные жидкости тестировали на активность фактора ингибиции миграции с помощью известного способа и предлагаемого способа.

Процент ингибиции миграции, измеренный в одних и тех же образцах двумя способами, приведен в табл. 2.

Результаты показывают, что для культуральной жидкости как от рЕ-, так и от вЕPOK активность фактора, ингибирующего миграцию, определяемая двумя способами, не отличается друг от друга.

Таким образом, предлагаемый способ более прост по сравнению с прототипом, так как в нем отпадает необходимость работы с капиллярами в стерильных условиях, однако он позволяет оценить продукцию фактора ингибирующего миграцию лейкоцитов с той же точностью, Формула изобретения

Способ определения активности фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов, путем измерения зон миграции лейкоцитов при инкубации их с исследуемой культуральной средой при 37 С не менее 18 ч, о тл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью упрощения cno".;àáà используют лейкоциты, выделенные в растворе 1%-ного желатина, которые до начала инкубации с культуральной средой помещают в лунки планшета для иммунологических реакций и инкубируют

30 мин при комнатной температуре, а затем

30 мин при 4 С, Таблица 1

1649431

Продолжение табл, 1

Таблица 2

Составитель В.Синауридзе

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор В.Гирйяк

Редактор С.Рекова

Заказ 1868 Тираж 417 Подписное

Вг1ИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101