Способ отбора регуляторных мутантов фотосинтезирующих микроводорослей и штамм водоросли снlоrеllа sp-продуцент углеводов
Изобретение относится к селекции микроводорослей и может быть использовано в биотехнологии фотоавтотрофных биосинтезов, в частности к получению углеводов. Целью изобретения является повышение эгЬЛечгивности отбора регуляторных мутантов фотосинтеэирующих микроводорослей с повышенной продуцирующей способностью фотосинтетического аппарата и получение штамма, обладающего более высоким синтезом углеводов. Способ заключается в том, что проводят последовательное проведение двух этапов селекции микроводорослей и выращивание колоний на питательной среде с добавлением неутилизируемого клеткой аналога глюкозы 2-дезокси-Д-глюкозы (2дДГ) в количестве, полностью подавляющем рост исходной культуры, и культивирование всех полученных на 1-м этапе резистентных к селективному агенту мутачтных клонов на среде, содержащей глюкозу, в темноте. В результате данного способа получен новый штамм водоросли Chlorella sp. C-/5, депонированный в коллекции микроводорослей Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева. Полученный штамм синтезируют до 60% углеводородов. 2 с.п.ф-лы, 2 ил., 5 табл. 3 (Л 0 ел 4ь со со 1
СОЮЗ СОВЕТСКИ)(COU
РЕСПУБЛИК (19) (И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ П(НТ СССР (21) 4260256/13 (22) 11.06.87 (46) 07.06.91. Бюл. Р 1 (71 ) Институт фи з и оло гии р зс те ний им. К.А. Тимирязева (72) В.E.Ñåìåíåíêî и Л.А.!1)итова (53) 576.8(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
У 627163, кл. С 12 N 15/00, 1978, Семененко В. F. Механизмы эндогенной регуляции фотосинтеза и адаптивные свойства хлоропласта. В кн.: Физиология фотосинтеза, М., 1982.
Покровский A.À. Белки одноклеточных. (54) СПОСОБ ОТБОРА РЕГУЛЯТОРНИХ МУТАНТОВ ФОТОСИНТЕЗИРУ10ЩИХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ И WfAMM ВОДОРОСЛИ CHLORELLА
БР. — ПРОДУЦЕНТ УГЛЕВОДОВ (57) Изобретение относится к селекции микроводорослей и может быть ис— польэовано в биотехнологии фотоавтоTpoAHblx биосинтезов, в частности к получению углеводов. Целью изобретения является повышение эдне;тивносИзобретение относится к селекции микроводорослей и может быть использовано в биотехнологии фотоавтотрофных биосинтезов.
Целью изобретения является повьппение эффективности отбора регуляторных мутантов фотосинтезирующих микроводорослей с повьппенной продуцирующей способностью фотосинтетического аппарата и получение штамма, обладающего более высоким синтезом углеводов. рц С 12 N 15/01, 1/1 .;
А 11 G 33/00, С 1, Р 19/)4 ти отбора регуляторных мутантов фотосинтезирующих микроводорослей с повышенной продуцирующей способностью фотосинтетического аппарата и получение штамма, обладающего более высоким синтезом углеводов. Способ заключается в том, что проводят последовательное проведение двух этапов селекции микроводорослей и выращивание колоний на питательной среде с добавлением неутилиэируемого клеткой аналога глюкозы 2-дезокси-Д-глюкозы (2дДГ) в количестве, полностью подавляющсм рост исходной культуры, и культивирование всех полученных на 1-м этапе реэистентных к селективному агенту мутантных клонов на среде, содержащей глюкозу, в темноте. В результате данного способа получен новый штамм водоросли Chlorella sp. С-75, депонированный в коллекции микроводорослей Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева. Полученный штамм
cHHTeзируют до 607 углеводородов.
2 с.п.h-лы, 2 ил., 5 табл.
Сверхпродукция фотосинтеза в данном случае является следствием нарушений регуляторного механизма, действующего по принципу отрицательной обратной связи, где роль эффектора выполняет один из конечных продуктов фотосинтеза — глюкоза.
На фиг. 1 изображен уровень репрессии карбоангидраз ной активности аналогом глюкозы, на фиг. 1 — синтез
1654331 углеводов известным штаммом и штаммом
Chlorel1а sp. CRS-03 2дДГ яes
Способ предусматривает последовательное проведение двух этапов селек5 ции микроводорослей: выращивание колоний на питательной среде с добавлением неутилиэируемого клеткой аналога глюкозы (2-деэокси -Д-глюкозы, 2дДГ) в количестве, полностью подавляющем рост исходной культуры, и культивирование всех полученных на первом этапе резистентньм к селективному агенту мутантных клонов на среде, содержащей глюкозу, в темноте. 15
Известный из практики селекции микроорганизмов прием отбора мутантов с нарушениями механизма регуляции
Продуктивности некоторых ферментов глюкозой, состоящий в выращивании культур на питательной среде с 2дДГ, обычно приводит к получению достаточно широкого спектра мутантных форм и нуждается в последующем длительном отборе клонов с целевыми свойствами. 25
Учитывая то, что у фотосинтезирующих микроводорослей рост колонии на
2дДГ может быть обусловлен в основном двумя причинами — нарушением регуляции уровня фотосинтеза и мутациями по белку — переносчику глюкозы, для массового "отсева" второй группы мутантов (нерегуляторного характера) в предложенном способе клоны, реэиатентные к 2лДГ, сразу переносят на питательную среду с глюкозой (1X), инкубируют их в течение 3-5 сут в темноте.
Благодаря введению второго этапа селекции, представляющего собой до- 4О статочно простую и нетрудоемкую процедуру, удается добиться существенного роста эффективности отбора регуляторных мутантов с повышенным уров" нем продукции фотосинтезирующего an- 45 парата, а именно, более 80Х полученных предложенным способом клонов демонстрируют ту или иную степень сверхпродукции фотосинтеза.
Иэ отобранных новым методом мутантов получают соответствующие мутантные штаммы хлореллы, в т.ч. и штамм
Chlorella вр, " продуцент углеводов.
Вновь полученному штамму присвоили номер CRS 03-2дДГ . 16гамм депоЯеь
55 нирован в коллекции одноклеточных водорослей Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева под номером
С-75.
Морфологические признаки штамма, Темно-зеленые клетки с гладкой поверхностью, шаровидной формы, на агаризованной среде Тамийя, размер клеток равен 4,5-5 мкм. Клетка содержит небольшое ядро и крупный чашеобразный хлоропласт. Размножение вегетативное.
Физиологические признаки. Оптимальньии условиями для выращивания является среда Тамийя, в качестве источника углерода использует углекислый газ, бикарбонат, гаэовоздушную смесь, содержащую 1,5-2 углекислого газа, в качестве источника азота — мочевину, рост при 35-37 С.
Отношение к освещенности. Требует круглосуточного освещения.
При описанных условиях накопление биомассы составляет 3, 1 мг/мл, скорость роста составляет 280<10 кл./мл, при этом получают биомассу следующего состава, : белок 50; углеводы 15 5; липиды 15.
При культивировании штамма на среде Тамийя нли на среде Тамийя без источника азота при рН среды 6,3, температуре 42 С, круглосуточном освещео нии 40 Вт/м получают биомассу, содержащую 60 углеводов. Штамм устойчив к контаминации, агглютинации и автолиза не наблюдается, имеет маркерный признак — рост на среде с 2 дДГ и глюкозой (в темноте) .
Штамм поддерживают на агаризованной среде Тамийя при 27-28 С, освещенности 4 эрг/см . Хранят при 1012 С, освещенности 0,4 эрг/см .
П р и и е р 1. Суспенэию клеток
СЫ.orella зр. К с концентрацией 2х х10 кл./мл наносят на агаризованную среду Тамийя с добавлением 0,250,5 2дДГ, которая полностью подавляет рост исходной культуры, и равномерно распределяют по поверхности шпателем. Такой же гаэоновый засев делают на контрольной чашке, т ° е. без
2 дДГ. Появившиеся на опьггной чашке колонии рассевают на агариэованную питательную среду Тамийя с глюкозой (1X) и помещают в темноту в термостат при 36 С. Колонии, растущие в этих о условиях в течение 3-5 сут, анализируют затем на способность к накоплению продуктов фотосинтеза.
В данном случае иэ 11 реэнстентньм к 2 дДГ мутантов лишь 7 обладают способностью расти в темноте на среде с глюкозойе
«Ь 5433 ге»»ой и»же»ерин
Данные роста резистентных K .? дДГ мутантов Chlorella sp. на разл»нных средах приведены в табл. 1.
Пример 2. Для создания усло5 вий направленного синтеза уг;.)енодон
Ch1 or el l a sp. Ê полученные мута и гы помещают в сосуды для интенсинногo выращивания на питательную среду Та мийя без азота. Барботиронание культур осуществляют газовоэдуш»ой смесью с 27 СО, выращивание проводят при
ЗЬ С. Освещение 5 ) Вт/м круглосуточное. Иачальная концентрация клеток н
1 мл 111х10 15
Содержание углеводов в исходной культуре и культурах мута»тон определяют методом Аенол-серная кисло а.
Через определенные интервал:i времени отбирают O,t)5-«),1 мл успе»эии, ?О добавляют 0,1)5 мл 8«)7-ного pacTI!opa фенола и 5 мл конце»;рирона»»ой 1 . (<
Оптическую плотность oxpattle»»t?t.o ра:твора измеряют на Аотоэлектроколориметре с использованием Аильтра с максиму- 25 мом пропускания 490 нм.
Количество углеводов рассчитывают по градуировочной кривой, предварительно составленной по глюкозе. Полученный конечный продукт имеет следую- 30 щий состав, 7.: водopacTI«opHMbte сахара
5; крахмал 80; гемицеллюлоэа 3; клетчатка 1-3.
Сравнительная характеристика »акопления углеводов в клетках исходного
35 и мутантных Chlorella CRS 5 и Clllcirella CRS 10, Chlorella СКБ «)3 2д",Г "сз штаммов в условиях роста без аэота приведена в табл. 2 и 3.
П р и M е р 3. Другим факт opo 1 40 вызывающим напранленный синтез угле;одов, является экстремаль»ая температура 43 С. Исходную культуру и муг;»ты выращивают»а полной среде Тами««я при ЗЬ С, при круглосуточ»о«-; освеще- 45 нии (50 Вт/м ) и непрерывном барботировании газовоздушной смесью C,?7 СО, а затем переводят в условия экстремальной температуры 43 С. Содержание углеводов определяют тем же мстодом, 5Q что и в примере 2. Результаты анализа представлены в табл. 4 и 5.
Пример 4. Одним из доказательств, указывак««цих нз то, чтс. С»1оге11а нР.СЕЯ 03 2дЛà — регуляторный мутант с нарушенным меха»измом негативной метаболитной регуляции Аотосинтеза на уровне экспрессии генома хлоропласта является отсутствие ч
7 6
«?епр е с сии ан «!Io го?1 ;1««?к о 311 (1. д, !1 )
Г > фе",,мe»òa, кодируемого и хл<.ропласгНоМ ге««о«е — хлоропластной карбоа»i itдра эы.
С1?1огеl .. sp. K и мутант культивируют г ., IoBEI»x и»генсинной культуры при постоя н»ом освещении и непрерывНоМ барботиронани«: гаэоноздушной сМе с»ю с;.4 СО . Культуру нь«ра«Н1нают до
11»от»ос г«1 71) 1 )«) ы1» кле гок н 1 MII + пос.« . Чсго вносят сте1?1«льную д Г
«со««це1«грац»«т 1), ?Х. Акт«11 1«ость карбоангидр» 1. nit)? e;tcляь?т электрометрическим мего«тг, 10 1«э?«е»с 1н«ю р8 н процессе ро:lкц«««1 »дратв»ии С«1 . 1 онтролем с?л«уул,. «т с "-.«э«1матическая р еакция .
)с«. »:«д::. » э t»tr. 1, при проникноне«1»» н клегкit микрон одоросли 2 дДГ акти» «ость хлоро:.ласт»о» карбоангидраэы i 1 сходной Аормы Chlorella sp.Ê ропрсс »руется до 5,7 ?, а у Cltl.orel
1» sp. t;i .S )3, ? д1Г ез остается на
5wc oItd?t gpor«Hc с ос та Вляя 8Ь ", QT Нсход««о г о э««ач е ни я .
Так««м образом, из приведенных примеров следует, «то предложен»«ый способ < « I.кц«п« с!«Cспечинает гораздо ме»не - рудоемкий il б lc Tpl lit а следователь «о, » бо««е» эЫ«ектин»1«г« чем н случае протот««па отбор регуляторных мутант ?н с IIQB«1«««с»»ой продуцирующей способ««остью: >отосинтет«1«ескогс àïïàpara, оглича«?11 «хся грс.««де всего более нь«сок«1?111 ноэмож» ?стями в плане накоп— ле»1«я 1«к:«с тках yr!Ie»n;Iot« .
В i«ac TitocTII благодаря ис»ольэона»ию 1:р сдлагас;:ого спс соб» получен штамм Ch1 огеl l 1 sp. СЕБ )3 2дД1 .Res прод. цент углеводов.
Приме« ение иэобретс«»«я н биотехнологi»t АотоантотроА«н к биоси»тезов
Hoaiio:11«т пол -;ать более н:"«сокие выходы прод кгон 8«oToctt«ITeaa — полисахаридон (крахмал) с еди»ицы суспенэии, а также использовать данные мутанты для исследования молекулярных механизмов регуляции экспрессий генома хлоропласта и для констру»рования нон«,«х продуцентов на основе методов Э о р м у л а и э о б р е т е н и я
1, Способ отбора регулятор»ых мута»тон фотосинтеэирующих IIIKpoBoJTopoc— лей„. нключающии выращинаь»1е культур н присутстнии селективного агента
2-дезокси-Д-гпюкоэь; B ! 5 с повышенной продуцирующей способностью фотосинтетического аппарата, поТаблица 1 Chlorella sp. (2дДГ ) RC8 Среда Глюкоза (17) Тамийя + 2дДГ (0,57) Тами йя вет Темнота Т а б л и ц а 2 r Содержание углеводов, мг/мл, эа время инкубации, ч Штамм Прирост за 44 ч О 22 44 Ch1ore1la sp.К Chlorella sp. CRS 5 Chlorella sp. CRS 10 0,145 0,142 О, 134 I), 4.)4 ), 442 ), 437 ),445 0,817 О, 795 t), 30 ) 0,6/5, ), 661 Таблица 3 Содержание углеводов, мгlмл, за время инкубации, ч Прирост за 64 ч 0 16 О, 148 О, 390 О, 133 О, 314 О, 390 О, 242 ),604 0,471 Chlore11a sp. К Ch1orella sp. CRS 03 2 ДЛГйе9 СЬ1 огеl lа Chlorella Chlorella Chlorella Chlorella Chlorella Chlorella Chlorella Chlorella Chlorella Chlorella sp. CRS l)3 sp. GT-1 sp. GT-2 sp, CRS 2 sp. CRS-3 sp. CRS-4 sp. CRS-5 sp. GT-7 sp. GT-8 sp. GRS 10 sp. GRS UV лученные резистентные к селективному агенту клоны подвергают вторичной селекции на питательной среде с глюкозой в темноте. 2, Штамм водоросли Ch)оre11à sp. 1<ВИФР Р С-75 — прадуцент углеводов. 1654337 Содержание углеводов, мг/мл, за время ннкубации, ч Штамм Прирост, 7 0 19 42 100 ), 380 149 118 157 Chlorella sp. CRS 03 2д1Г Re зя время инкубяции, ч Chlorellp sp. К, за время инкубации, ч Параметры 9S,8 157,5 58,7 68,8 68,7 137, 5 1,25 0,26 1,75 1,11 О, 5() 0,85 0,62 0,90 0,603 О, 737 i), 134 0,604 0,405 О, 195 без 2дД 4ыг. f П исходная кулътура El мутант Chlorel 1 a sp. К Chlorella sp CRS 2 Chlorella sp. CRS 3 Chlorella sp. CRS 4 Число клеток Вес сухой массы, Mr/мл Вес клетки, мг Количество углеводов, мг/10 кл. О, 149 0, 131 0,125 О, 140 ), 263 <),27Л ), ".80 i), 29 ) ), 358 ), 35 ) ), 37 ) О, 385 Тяблица4 0,567 ), 450 l), 600 Т а б л и ц я 5 1654337 /. Е креня. и Составитель Т.Полянская Редактор Н.Гунько Техред Л.Олийнык КорРектоР М.Самборская Заказ 1930 Тиралс 393 Подписное BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101
