Штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент активатора плазминогена тканевого типа

 

Изобретение относится к активатору человеческого плазминогена и новому штамму бактерий, трансформированному плазмидой PT - PATRP12 - продуценту активатора плазминогена тканевого типа. С помощью генно-инженерных приемов конструируют плазмиду PT - PATRP12, кодирующую 1 - 110 аминокислоты плазминогена. Полученной плазмидой трансформируют штамм E.COLI К12, путем многократного пересева отбирают клон, синтезирующий до 50 пг на 1 клетку в 1 день активатора тканевого плазминогена.

„„SU„„ l 662352

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А3 (51)5 С 12 N 15/12

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 3595638/13 (22) 04.05.83 . (31) 374860 (32) 05. 05.82 (33) US (46) 07.07.91. Бюп. Ф 25 (71) Генентек, Инк. (US) (72) Давид Ваннорман Геддель, Вильям

Джек Кор, Диана Панника и Гордон

Аллен Вехар (US) (53) 576.851.48 (088.8) (56) EP Ф 0037687, кл. С 12 N 15/00, 14. 10 ° 81.

Изобретение относится к активатору человеческого плазминогена и новому штамму бактерий, трансформированному плазмидой р -pAtrp12-продуценту активатора плазминогена тканевого типа.

Пример 1. Клетки меланомы че- ° ловека культивируют в 100 мл среды

Игла, дополненной бикарбонатом нат- . рия (конечная концентрация 0,12K), 2 мИ глютамина и 10Х инактивированной нагреванием сыворотки плода коровы. Клетки промывают один раз фосфатным буфером и прибавляют 0,3 мл среды, не содержащей сыворотки и мети онина. Добавляют 75 мкКи (358)-метионина, инкубируют при 37 С в течео ние 3 ч, затем среду удаляют и обра- I батывают или специфическим 1 gG ак2 (54) DITANM БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI—

ПРОДУЦЕНТ АКТИВАТОРА ПЛАЗИИНОГЕНА ТКАНЕВОГО ТИПА (57) Изобретение относится к активатору человеческого плазминогена и новому штамму бактерий, трансформированному плазмидой pt = pAtrp12 — продуценту активатора плазминогена тканевого типа. С помощью генно-инженерных приемов конструируют плазмиду ptpAtrp12, кодирующую 1 †1 аминокислоты плазминогена. Полученной плазмидой трансформируют штамм Е. cnli К1? путем многократного пересева отбирают клон, синтезирующий до 50 пг на

1 клетку в 1 день активатора ткане:вого плазминогена. 2 табл . тиватором тканевого плазминогена или преиммунной сывороткой для иммуноосаждения. Продукты иммуноосаждения подвергают электрофорезу в107-ном SDSакриламидном геле. Пластину геля фиксируют, сушат и подвергают флюорографии е

Из клеток меганомы экстрагируют

РНК. Клетки центрифугируют, повторно суспендируют в 10 MH NaC1, 10 мИ трис-НС1 (рН 7,5), 1,5 мИ ИрС1, ли- зируют добавлением NP-40 (конечная концентрация 1X) а ядра осаждают центрифугированием. Надосад очный слой, содержащий всю РНК, очищают многократными экстракциями фенолом и хлороформом. Концентрацию соли в водной фазе доводят до 0,2 И NaC1

Осаждают PHK добавлением двух объе1662352 мов этанола и хроматографируют на олиго-d Т-целлюлозе. Выход от 10 r культивированных клеток меланомы составляет 5-10 мг общей РНК и 50-200 мкг полиА мРНК.

ПолиА мРНК (200 мкг} фракционируют путем электрофореза,через мочевиноагарозный гель: 1,75 агарозы, 0,025 М цитрата натрия (РН 3,8) и

6 М.мочевины в течение 7 ч при 25 мА и 4 С. Гель разрезают лезвием. Индио видуальные тонкие слои в виде ломтиков расплавляют при 70 С и экстрагио

Руют дважды фенолом и один раз хло- 15 роформом. PHK осаждают этанолом и последовательно испытывают трансляцией in vitro в системе лизата ретикулоцитов кролика, дополненной микросомами поджелудочной железы собаки, сле 20 дующим образом. Проводят трансляцию, используя 25 мкКи (35$) -метионина и 500 нг РНК из каждого тонкого слоя геля в 30 мкл среды, содержащей 25 мМ

HEPES, 48,3 мМ хлористого калия, 10 MM 25 креатин фосфата, 19 аминокислот по

50 мМ каждой, 1,1 мМ хлористого магния, 16,6 мМ ЗДТА, О, 16 мМ дитиотрейтола, 8,3 мМ гемина, 16,6 мг/мп креатинкиназы 0 33 MM хл орист ог о кальция 30

0,66 мМ ЕДТА, 23,3 йМ хлористого нато рия. Инкубирование проводят при 30 С и течение 90 мин. Продукты трансляции или иммунооаажденные продукты трансляции анализируют с помощью электрофореза в 10 .-ных полиакриламид35 ных гелях и додецилсульфат.е натрия.

Пластинки гелей фиксируют, сушат и подвергают флюорографии, l

Полученные в результате продукты трансляции из каждой гель-фракции иммуноосаждают. Наблюдается одна основная полоса иммуноосажденного полипептида, имеющая молекулярную массу 45 приблизительно 63000 дальтон.

5 мкг фракционированной в геле мРНК используют для получения двутяжевой кДНК с помощью стандартных процедур ° Фракционируют кДНК по Размеру в б -ном полиакриламидном геле. Элект"

Роэлюируют кДНК размером больше чем

350 основных пар (125 нг} . 30 нг ÍK с деокси(С)остатками трансформируют в 300 нг плазмиды pBR 322 с деокси(0)остатками по PstI участку.

Смесь затем трансформируют в Е. coli

112 штамм 294 (ATCC-31446) . Получают приблизительно 4600 трансформантов.

Диализируют 2 мг образца активатора тканевого плазминогена против

0,01 Твина 80 в течение ночи при комнатной температуре. Затем растворяют лиофилизованный протеин в 12 мп

0,56 М трис-НС1 буфера (pH 8,6), 8 M мочевины и 5 мМ ЗДТА. Восстанавливают дисульфидные связи добавлением

0,1 Nli j3-ìåðêàïòoýòàíîëà. Эту реакцию проводят в азоте в течение 2 ч при 45 С. Восстановленныедисульфиды алкилируют карбоксиметилпроизводным при добавлении 1,0 мп 1 4 M йодуксусной кислоты в 1 í. NaOH, через

20 мин реакцию останавливают диализом против 0;01% Твина .80 и лиофилиэу ют. Лиофилизованный карбоксиметилированный протеин снова растворяют в

3 мл О, 1 M натрийфосфатного буфера (pH 7,5), прибавляют трипсин (TPCK) в соотношении 1:50 и выдерживают при

37 С. Второе добавление трипсина проо водят через 12 ч. Через 24 ч наблюдается полное расщепление пептида.

0,5 мл образца наносят на колонку высокого разрешения Альтекс С-8 ультрасфера 5 мкм с двумя циклами. Устанавливают постепенный градиент ацетонитрила (от 1 до 5% за 5 мин, от 5 до 35 за 10 мин, 35-50 за 30 мин).

Элюент контролируют по двум длинам волн (210 и 280 нм) .

После определения последовательности примерно 25 лучших возможных пептидных пика объединяют для получения предварительной модели первичной структуры активатора тканевого плазминогена. Так получают несколько возможных зондов.

Индивидуально инокулируют колонии в отверстия пластин микротитратора, содержащие 1.В + 5 мкг/мл тетрациклина после добавления ДМСО до 7 . и хранят при -20 С. Выращивают две коо пии фонда колоний на нитроцеллюлозных фильтрах и фиксируют ДНК каждой колонии на фильтре.

Готовят Р-меченый ТС/

/ТСССА зонд из синтетического олиго-мера. Фильтры, содержащие 4600 трансформантов,предварительно гибридизуют в течение 2 ч при комнатной температуре в 50 мМ натрийфосфата (РН 6,8), 5NSSC, 150 мкг/мп обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося, 5х раствора

Денхардта., 1О% формамида, а затем гибридизуют с 5 х10 имп/мин меченого зонда. После инкубации в течение ночи

1662352

50 при комнатной температуре фильтры промывают 3 раза в бх$$С, 0,1 SDS в о течение 30 мин, один раз в 2xSSC а затем экспонируют на рентгеновской

5 пленке.

Выделяют плазмидную ДНК из всех колоний, показывающих положительную реакцию гибридизации. Определяют последовательности вставок кДНК этих клонов после субклонирования фрагментов в М13 векторе мр 7. Одна вставка кДНК в клоне 25Е10 имеет ДНК, кодирующую активатор тканевого плазминогена. Клон 25Е10 имеет 2304 пары 15 оснований в длину и наиболее длинную структуру, кодирующую протеин из

508 аминокислот (Молекулярная масса

56756) и содержит 772 п.о.3 нетранслируемой области . 20

50 мкг рРА25Е10 расщепляют рестриктазой Pstl и вьделяют фрагмент

376 п.о. электрофорезом в б .-ном полиакриламидном геле. 3 мкг этого фрагмента расщепляют рестриктазой 25 о

DdeI в течение 1 ч при 37 С, экстрагируют фенопом и хлороформом и осаждают этанопом. Полученные в результате Ddel липкие концы обрабатывают

5 единицами ДНК полимеразы I (фрагмент Кленова). После экстракции фенолом и хлороформом ДНК расщепляют 15 единицами рестриктазы NarI в течение 2 ч и подвергают электрофорезу в б -ном полиакриламидном геле.

Извлекают приблизительно 0,5 мкг фрагмента размером 125 п.о. с тупым концом NarI. Этот фрагмент кодирует аминокислоты с номера от 69 до 110 зрелого протеина активатора тканевого 40 плазминогена полной длины.

30 мкг рРА25Е10 расщепляют 30 единицами NarI и 35 единицами BglII в течение 2 ч при 37 С и подвергают реакционную смесь электрофорезу в 45 б .-ном полиакриламидном геле. Вьделяют приблизительно 6 мкг 1645 п.о.

NarI-BglII фрагмента.

Плазмида рае lta RISRC является производной плазмиды psR Сех 16, в которой Eco RI участки, проксимальные к trp промотору и дистальные к

SRC гену, удаляют репарацией ДНК по лимеразой I и встраивают самокомплементарный олигонуклеотид AATTATGAATTCAT, синтезированный по фосфотриэфирному методу. 20 мкг этой плазмиды расщепляют егоRI, экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом. Затем плазмиду разрезают 100 единицами нуклеазы SI при 16 С в течение 30 мин в 25 мМ ацетата натрия (pH 4,6), 1 мМ ZnC1 и 0,3 М NaC1 для создания тупого конца с последовательностью ATG. После экстракции фенолом и хлороформом и осаждения этанолом ДНК рестрицируют BamHI проводят электрофорез в б -ном полиакриламидном геле и извлекают большой (4300 п.о.) фрагмент вектора.

Экспрессионную плазмиду собирают соединением 0,2 мкг вектора, 0,06 мкг фрагмента 125 п.о. с тупым концом

NarI и 0,6 MKI фрагмента 1645 п.о.

Nar-BglII с 10 единицами Т4 ДНК лигазы в течение 7 ч при комнатной температуре и трансформируют в Е.coli штамм 294 (ATCC N- 3 1446) .

Плазмидную ДНК из 26 колоний вьделяют и расщепляют рестриктазами ХЬаХ и EcoRI.12 из этих плазмид содержат фрагменты 415 п.о. ХЪаХ-EcoRI u

472 п.о. EcoRI. Анализ последователь ности ДНК подтверждает, что некоторые из этих плазмид имеют ATG начальный кодон, правильно расположенный в начале аминокислоты номер 69 (серин).

Одна из этих плазмид — рДНХРА продуцирует активатор тканевого плазминогена.

3 мкг ДНК лимфоцитов человека. полностью расщепляют различными эндонуклеазами, проводят электрофорез в 1,0 -ных агарозных гелях и переносят на нитроцеллкитозный фильтр. Гото 2 вят P-меченую ДНК в виде зонда из вставки 5 конца кДНК клона рРА25Е10 (фрагмент 230 п.о. Hpall-RSAI) и гибридизуют с нитроцеллюпозным фильтром в течение 40 ч, затем фильтр промывают. Полученные данные свидетельствуют о наличии одного гена активатора

4 тканевого плазминогена в человеческом геноме.

Реконструкция полной кодирующей последовательности возможна с применением обычного HhaI участка рестрикционной эндонуклеазы, разделенного на два частичных клона рРА17 и РА25Е10.

Из плазмиды рРА17 вьделяют рестрикционный фрагмент 55 п.о. Sau 3AIHhaI, соответствующий аьжнокислотам

5-23. Из плазмиды рРА25Е10 выделяют фрагмент 263 п.о. HhaI-NarI (кодирующий аминокислоты 24-110) . Конструируют два синтетических деоксиолигонукле отида, которые реконструируют кодоны

1662352 для аминокислот 1-4, включают кодон инициирования трансляции ATG и создают ЕгоКХ липкое окончание, Эти три фрагмента затем связывают вместе с образованием 338 п.о. фрагмента, ко5 дирующего аминокислоты 1-110. Этот фрагмент н фрагмент 1645 п.о. NarlBglII из рРА25Е10 затем связывают по

EcoRI u BglII участкам плаэмиды

pLeIPAtr р 103 для получения плазмиды экспрессии pt-PAtrp12.

Выращивают Е.coli K12 штаммом 3110 (АТСС N 27325), содержащий плазмиду

pt-PAtrp12>, и готовят экстракты дпя проб на фибринолитическую активность.

Количество образовавшегося плазмина определяют измерением степени расщепления фибрина на агарозной пластине, содержащей плазминоген и фибрин. Плазмин дает четкую зону лизиса на фибриновой пластине и площадь этой зоны коррелируют с количеством активатора тканевого плазминогена в .образце.

При испытании экстрактов из pt-PA

trp 12 клонов на активность активатора тканевого плазминогена используют пробы с фибриновой пластиной с образованием четкой зоны лизиса. Эта фибринолитическая активность ингибирует- 30 ся анти-т-АП IgG но не преиммунизируется IgG или антиурокиназа IgG.

Экстракт, полученный из клеток, содержащих в качестве контроля лейкоцитно-интерферонную плазмиду pLeIFtrp

103, не показывает активности. Полу" чают приблизительно 20 единиц экстрагированной активности на 10 клеток (для очищенного т-АП 90000 единиц

Плуга = 1 мг) .

Полученный штамм бактерий Е.coli г ATC C31446 характеризуется следующими свойствами.

Имеет гепотип endA, Thi hsr

hsm

Ф

Растет в среде LB (10 г бактотриптона, 5 r бактодрожжевого экстракта и 10 г хлорида натрия на литр среды).

Для хранения на 3 мп LB ночной культуры добавляют 2 мп 50 -ного глицерина, размешивают и замораживают в| стерилизованных бутылочках при -20 С.

Пример 2. Колонию .Е.coli, содержащую плазмиду phRIPA, выращивают в 5 мп среды роста LB, содержащей

20 мкг/мл ампициллина, в течение ночи при 37 С. Аликвоту этой культуры разбавляют 1:100 в 300 мп И9 среды, содержащей 20 мкг/мп ампициллина, и выращивают при 37 С в течение 4 ч до плотности ОЕ = 0,419. Добавляют триптофановый аналог индолакриловой кислоты до концентрации 30 мкг/мп.

Инкубируют клетки 90 мин до плотности ОЕ о = 0,628 . Кпетки центрифугируют и повторно суспендируют в 0,8 мп

0,01 И трис-буфера (рН 8,0), содержащего 0,01И ЭДТА. Полученную суспензию интенсивно перемешивают 18 ч при комнатной температуре. Образцы центрифугируют и проверяют надосадочный слой на активность активатора тканевого плазминогена.

В табл .1 и 2 приведены результаты, полученные при активации плазминогена соответствующими экстрактами Е.co1i °

Генерируемая активность зависит от наличия плазминогена (табл.1) .

Эта активность не вызывается предиммунной сывороткой кролика, но она четко ингибируется антисывороткой, которая была получена против активатора тканевого плазминогена, происходящего из очищенных клеток меланомы (табл.1 и 2). Это показывает, что экстракты E;coli дают активность по активации плазминогена, которая ингибируется антителами против активатора тканевого плазминогена.

Пример 3. Продуцирование т-АП с использованием ДГФР протеина с низким связывающим сродством к ИТТ.

Последовательность, кодирующую активатор тканевого плаэминогена (т-.АП) встраивают в плазмиду, содержащую мутантную ДГФР с низким связывающим сродством к ИТТ. Для этого три фрагмейта из частично перекрывающихся т-АП плазмид, рРА25Е10 и рРА17, и

p6RIPA (выше) получают следующим

Образом.

Расщепляют плазмиду рРА17 рестриктазой Ddel, обрабатывают фрагментом

Кленова ДНК полимераэы I расщепляют рестриктазой PstI, выделяют фрагмент размером приблизительно 200 п.о., содержащий 5 терминальную последовательность т"АП, Получают второй т-АП фрагмент расщеплением рЬКХРА с помощью PstI и NarI, выделяют фрагмент размером 310 п.о. Третий т-AII фрагмент получают расщеплением рРА25Е10 с помощью NarI u BglII и выделяют фрагмент размером 1645 п,о., который кроме того, содержит большую часть кодирующей области т-АП и некоторое

1662352 количество 3 нетранслируемых последовательностей.

Плазмиду рЕ342, которая экспрессирует НВУ поверхностный антиген, расщепляют с помощью HindIII превращают

HindIII концы в EcoRI концы путем добавления конвертера (AGCTGATTC). Эту

ДНК разрезают Pvull и добавляют RI связки . Последующее расщепление EcoRI приводит к вьщелению фрагмента 348 п,о, его клонируют в pBR322 Конструируют плазмиду экспрессии рН ER 348-Е путем клонирования фрагмента 1986 п.о., полученного в результате гидролиза

HBV с помощью EcoRI и BgIII, затем линеаризуют pRI-Bgl u EcoRI и вводят фрагмент 348 п.о., представляющий собой исходную область SV 40, à EcoRI участок pRI-Вя1 модифицируют рЕ342 частичным гидролизом EcoRI, заполняя отщепленный участок с использованием фрагмента Кленова ДНК полимеразы I и связывая затем части плазмиды.. Полученную в результате плазмиду рЕ342ЬК?,25 гидролизованную EcoRI, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимеразы I и расщепляют ВапйП. Путем электрофореза в акриламидном геле получают фрагмент размером 3500 п.о., экстрагируют его фенолом и хлороформом, осаждают этанолом.

Полученный таким образом вектор р342Е 3500 п.о. связывают с т-АП фрагментами размером около 2160 п,о., используя стандартные методики. Выделяют плазмиду, содержащую три т-АП кодирующих фрагмента в нужной ориентации, характеризуют и вырезают рЕ342-т-АП. Эту плазмиду гидролизуют SacII и обрабатывают бактериальной

40 щелочной фосфатазой (BRL) . Для обеспечения ДГФР последовательности вьщеляют фрагмент приблизительно 1700 п.о, гидролизом Sacll pEHeR (pEHeR являет45 ся плазмидой, экспрессирующей мутант

ДГФР). Этот фрагмент встраивают в рЕ342-т-АП плазмиду для создания

pEdPAER 400 плазмиды, которая является аналогичной pEHER за исключением того, что HBS Ag кодирующая область

50 заменена кДНК последовательностями от т-АП.

Проводят трансфекцию рЕТРАЕ 400 (pETPER) в dhfr-CHÎ ДИХ В11 клетки и ДГФР+СНО К1 (АТСС CCL 61) клетки.

Отбирают трансформированные dhf r клетки путем выращивания на среде, лишенной глицина, гипоксантина и тимидина, Отбирают трансформированные

ДГФР+ клетки выращиванием в 100 мМ

МТТ. Колонии, которые возникают на соответствующей селекционной среде, выделяют, используя клонирующие циклы, и размножают на той же среде до н ес кол ьких r енераций.

Для амплификации клетки колоний

Ф чыращивают в среде, содержащей 5 ° 10

10, 2,5 10, 5 ° 10 и 10 нМ МТТ.

ДНК амплифицированных колоний выделяют следующим образом. Промывают монослои в 150 мм пластинах 50 Mi стерильного pBS и лизируют добавлением 5 мл 0,1 -ного SDS 0,4 М СаС1, 0,1 М ЗДТА (рН 8), через 5-10 мин экстрагируют фенолом, затем хлорофор мом и осаждают этанолом. Осадок ДНК суспендируют в 1 мп (на 150 мм пластине) 10 мМ трис/НС1, рН 8,1 мМ ЗДТА (ТЕ), добавляют ГНК-азу до 0,1 мг/мп и инкубируют 30 мин при 37 С.

Затем прибавляют SDS до О, 1/, проназу до 0,5 мг/мл, инкубируют 3-16 ч при 37 С, экстрагируют фенолом, хлороформом и осаждают этанолом. Осадок

ДНК суспендируют в 0,5 мл воды, гидролизуют рестрикционными ферментами и подвергают электрофорезу в 1Е-ном агарозном геле, затем гель извлекают и окрашивают. После визуализации в ультрафиолетовом свете ДНК переносят на нитроцеллкпозные фильтры, фильтры гибридизуют меченым Sacll фрагментом ДНК размером 1700 п.о. плазмиды pEHER или BglII фрагментом

ДНК размером 1970 п.о. плазмиды

pETPER, Для трансфекции лишеннык ДГФР клеток используют плазмиду pETPFR. Испытывают 21 колонию, которые выращивают на селективной среде (-ГТТ), детекцией на образование плазмина. Обнаруживают четыре клона, имеющих одинаковую или сравнимую т-АП секрецию.

Указанные субклоны в количестве

2 10 клеток помещают на пластины

100 мм в 50 нМ МТТ, еще раз селекционируют, отбирают два клона для дальнейшего исследования и называют их

1-15 и 18В-9.

Субклоны 1-15 и 18В-9 после выдерживания примерно в течение 1-2 мес. испытывают,Для этого серийно разбавляют очищенный т-АП и очищенный меченый йодом т-АП. происходящие из клеток меланомы, до концентрации от

12,5 до 400 мг/мл в буфере, содержа12

1662352 шем забуферированный фосфатом солевой раствор (рН 7,3), 0,5% сыворотки бычьего альбумина, 0,01%. Твина-80 и 0,02% NaN>. Образцы с соответствующими разбавлениями среды прибавляют к радиоактивно меченым белкам, инку бируют в течение ночи при комнатной температуре в присутствии XgG фракции анти-т-АП антисыворотки кролика. 10

Осаждают комплекс антиген — антитело путем абсорбции кеа-анти-кролик IgG иммунобусинок (Вио Рад) в течение

2 ч при комнатной температуре. Шарики отмывают и измеряют радиоактивность.: осадков. Определяют концентра ции путем сравнения с внутренним стандартом.

Амплифицированная культура продуцирует до 50 пг на клетку в 1 день, т-АП.

Формула изобретения, Штамм бактерий Escherichia coli

АТСС 31446 (pt-рА) trp12 - продуцент активатора плаэминогена тканевого типа.

Таблица1, Активация плазминогена экстрактами иэ Е.coli культур, содержащих рЮХРА

Продолжение табл.1

Экстракт 0,451 (100) Экстракт плюс пр едиммунная сыворотка

Экстракт плюс анти4 AII антител

0,477 106

0,079 9

Процент активности вычислен вычитанием холостого опыта (О, 043) из полученных величин и делением на полученную величину экстракта.

Таблица2

Плазминогенная активация экстрактов Е.coli культур р -PAtrp12.

Актив405

Образец ность, %

Экстракт (100) 0,657

Экстракт плюс предиммунная

35 сыворотка

0,665 101

Экстракт плюс антит-АП антиЭкс тракт (без плазминог ени) О, 043 (О) 0,059 9

Составитель Т. Забойкина

Техред М,Моргентал

Редактор О. Юрковецкая

Корректор А. Обручар

Заказ 2139 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101