Способ активации тканевого активатора плазминогена (его варианты)
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения активного плазминогена. Целью изобретения является улучшение качества конечного продукта за счет более полного восстановления его нативных свойств. Способ активации тканевого активатора плазминогена - T PA, полученного в результате экспрессии гена T PA в клетках ESCHERICHIA COLI и PSEUDOMONAS PUTIDA, предусматривает проведение реакции реактивации при PH 9 - 11, концентрации G SSG 0,05 - 3 ммоль/л и концентрации G SH 0,1 - 20 ммоль/л. В качестве слабого денатурирующего раствора используют раствор L-аргинина в концентрации 0,05 - 1 моль/л или мочевины в концентрации 1 - 4 моль/л, или метилмочевины в концентрации 0,5 - 3 моль/л, или демитилмочевины в концентрации 0,5 - 1 моль/л, или этилмочевины в концентрации 0,25 - 0,75 моль/л, или формамида в концентрации 0,5 - 5 моль/л, или этилформамида в концентрации 0,5 - 5 моль/л, или ацетамида в концентрации 0,5 - 4 моль/л, или бутирамида в концентрации 0,5 - 1 моль/л. 2 с. и 5 з.п. ф-лы, 24 табл.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
Мй
РЕСПУБЛИН
30ЫОВММ
@,щук тцр цр ущип
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТЫ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
1 (21) 4202987/30-13, (86) РСТ/ЕР 86/00610 (23.10.86) (22) 22.06.87 (31) P 3537708.9 (32) 23,10.85 (33) DE (46) 15.11.90. Бюл. В 42 (71) Берингер Маннхайм 1йбХ (DE) (72) Райнер Рудольф, Штефан Фишер и Ральф Маттес (DK). (53) 575.224.2(088.8) (56) EP И 0114506,кл. С 12 Н 15/00, 1984. (54) СПОСОБ АКТИВАЦИИ ТКАНЕВОГО. АКТИ-.
ВАХОРА ПЛАЗМИНОГЕНА (ЕГО ВАРИАНТИ) (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения активного плазминогена, Целью изобретения является улучшение качества конечного продукта за счет более полного восстановления его нативных свойств. Способ активации ткаI
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения активного плазминогена..
Целью изобретения является улучшение качества конечного продукта sa счет более полного восстановления его нативных свойств.
Пример 1. а) Приготовление "refractile Ъоdies".
100 г влажной клеточной массы
Е. coli в 1,5 л 0,1 моль/л трис/НС1 !
SU... 16076&9. А 3 (g1)g С 12 Я 15/12, С 12 Р 21/00
2 невого активатора плазминогена — tPA, полученного в результате экспрессии гена tPA в клетках Escherichia coli и Pseudomonas putida, предусматривает проведение реакции реактивации при рН 9-11 концентрации gSSg 0 053 ммоль/л и концентрации gSH 0,120 ммоль/л. В качестве слабого денатурирующего раствора используют раствор L-аргинина в концентрации 0,05l моль/л или мочевины в концентрации
1-4 моль /л, или метилмочевины в концентрации 0 5-3 моль/л, или диметилмочевины в концентрации 0,51 моль/л, или этилмочевины в концентрации 0,25-0,75 моль/л, или формамида в концентрации 0,5-5 моль/л, или этилформамида в концентрации 0,55 моль/л, или ацетамида в концентрации 0,5-4 моль/л или бутирамида в концентрации 0,5-1 моль/л. 2 с.и 5 з,п. ф-лы, 10 табл.
1 и 20 ммоль/л ЕДТА гомогенизируют (Ultra-Turrax 1 0 с) и добавляют
0,25 мг/мл лиозима. После 30 мин инкубации при комнатной температуре вновь гомогенизируют и охлаждают до
30С, Разложение клеток осуществляют путем дисперсии п,".и высоком давлении (550 кг/см ). Затем проводят и промывку 300 мг/л 0,1 моль/л трис/
/НС1 (рН 6,5) и 20 ммоль/л ЕДТА.
После центрифугирования (2 ч для
27000 g, 4 С) гранулы вводят в, 1607689
Выход готового продукта в пересчете на количество tPA примерно 12%.
1,3 л 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 696), 20 ммоль/л ЕДТА и 2,5% тритон-Х-100 и гомогенизируют. После повторног о центрифугирования (30 мин для
27000 g, 4 С) гранулы вводят в 1 3 л
0,1 моль/л трис НС1 (рН 6)5), 20 ммоль/л ЕДТА и 0,5% тритон-Х-100 и гомогенизируют. Чередование центрифугирования (30 мин для 27000g, 4 С) и гомогенизации гранул в 1 л
0,1 моль/л трис/НС1 (рН 6,5) и
20 ммоль/л ЕДТА проводят еще трижды.
Содержание tPA "refractile bodies" определяют по SDS-PAGE ) идентификацию )5
tPA-полос по Westirn-blotting" денситометрическим анализом "Refractile bodies" по SDS-РАСЕ и"Mestirnblotting".
Анализ показывает плотную tPAполосу с мол. весом около 60 кДт.
Доля tPA в общем содержании протеина "refractile bodies" составляет около 21%. б) Растворение/восстановление
"refractile bodies"..
Белок инкубируют при концентра- ции 1-5 мг/мл в 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 8,6), 6 моль/л гуанидингидрохлорида 0,15-0,4 моль/л ДТЕ и l ммоль/л
ЕДТА в течение 2-3 ч нри комнатной температуре. Затем нерастворенный материал (фрагменты стенок клеток и т.п.) отделяют центрифугированием (30 мин для 35000-50000 g 40 С).
Величину рН надосадочной жидкости устанавливают концентрированной соляной кислотой до рН 3. Денатурирующее
1 средство и восстановитель отделяют диализом против 0,01 моль/л НС1 при 4 С.
40 в) Повторное окисленне/активация.
Повторное окисление/активацию проводят 1:50 — 1:200 разбавлением
45 буфером 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 10,5), 1 ммолы л ЕДТА, 1 мг/мл BSA, . 0,5 моль/л 1 -аргинина, 2 ммоль/л
GSH 0,2 ммоль/л GSSG.
После 17-24 ч активации при 20 С определяют активность в сравнении
50 с активностью естественного гликолизированного tPA из эвкарнонтов.
Выход готового продукта в пересчете на общее содержание протеина
2,5 + 0,5%., стимулируемость 10+ 5.
Та блица 1
Выход)) ) % С тимулируемос (коэффициент) GSSG) ммоль /л
0,2
5
7
0
О,13
1,49
1,28
1,04
0,98
l ) 7 7
4,0
7,4
5,4
5,8
6,2
10,0 Выход активного tPA в пересчете на общее содержание. протеина "refractile bodies". г) Повторное окисление/активация без отделения денатурирующее средство/в осстановитель .
Белок инкубируют при концентрации
1,25 мг/мл в 0,1 моль/л трис/HCl (рН 8,6), 6 ммоль/л гуанидингидрохлорида, 0,2 моль/л ДТЕ и 1 моль/л
ЕДТА в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем сразу же проводят повторное окисление 1:100 разбавлением в 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА) 1 мг/мл BSA) 0,3 моль/л
L-аргинина и:в указанных в табл, 1 количествах GSSG. Дополнительно в активирующей добавке находится остаточная концентрация 0,06 моль/л гуанидингндрохлорида и 2 ммоль/л ДТЕ .
Зависимость выхода активаций от
GSSG-концентрации при активации без отделения денатурирующее средство/ восстановитель показана в табл. 1.
Пример 2. Около 5 мг белка инкубируют в 1 мл 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 8,6), 6 моль/л гуанидингидрохлорида и 0,15-0,2 моль/л ДТЕ в течение
2-3 ч при комнатной температуре, Нерастворенный материал (фрагменты стенок клеток и т.д.) отделяют центрифугированием (20 мин при 17000 g)
Денатурирующее средство и восстановитель удаляют гелевой фильтрацией через Sephadex G. 25 в 0,01 моль/л
НС1, При этом проба разбавляется на коэффициент -10. Восстановленный материал растворяют в 0,01 моль/л
НС1 при -20 С.
5 160768
Пример 3. В табл. 2-15 пока вано влияние различных параметров на активацию и стимулируемость tPA.
Для эксперимента повторного окисления восстановленный протеин, раство5 ренный по примеру 2, больше, не очи-., щают.
Восстановленный протеин (в
0,01 моль/л HCl) активируют растворением 1:10 - 1:500 в буфере повторФ ного окисления..Активацию определяют после 22-48 ч.инкубации при комнатной температуре. Активация окисленного повторно протеина по отношению к стандартному повторному окислейию (IOOX) в О,1 моль/л трис/НС1 (рН 1 0,5) + I ммоль/л ЕДТА, 0,5моль/л
L-аргинина, 1 мг/мл BSA, 0,5 моль/л
GSH (восстановленный глютатион), 20
0,5 ммоль/л GSSG (дисульфид глютатиона) .
1. Зависимость выхода активации от добавки Ь-аргинина или гуанидингидрохлорида. 25
Повторное окисление в 0,1 моль/л,. трис/НС1 (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл L-аргинина, 0,5 ммоль/л BSA, 0,5 ммоль/л GSSG
Зависимость выхода активации от 30 концентрации Ь-аргинина представлена в табл. 2.
Та блица 2
L-аргинин, Ак тив нос ть Стимулируемоль /л мость (коэффициент) Зависимость активации от добавки мочевины следующая:
Мочевина Ак тив ность, моль/л Ж
I 59
1,5 126
2 162
2,5 141
3 72
4 12
Зависимость активации от добавки метилмочевины:
Иетилмочевина Активность, моль/л й
0,5 22
1 174
1,5 313
2 375
2,5 332
Э 215
Зависимость активации от добавки этилмочевины:
Зтилмоч евина Ак тив нос ть, моль/л Х
46
212, 323
0,5
1,5
2 300
2,5 107
Зависимость активации от добавки диметилмочевины представлена в табл. 3.
Та блица 3
98
27
0,25
0,5
0,75
1,0
7,5
21,9
16,3
3 5
Актив нос ть, (X) 0,25 22
0 5 53
0,75 58
2 . .Зависимость активации от добавки мочевины и производных мочевины.
Повторное окисление в 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл BSA, 5 ммоль/л GSH,.
0,2 ммоль/л GSSG.
Зависимость выхода активации от концентрации гуанидинхлорида следующая
Гуанидинхлорид, моль/л
Диметилмо- Активность, Стимулируечевина, Х мос ть (коэф40 моль/л фициент) 50
Э. Зависимость активности от добавки амидов жирных кислот.
Повторное окисление в 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 10,5) 1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл BSA 5 ммоль/лGSH 0,2 ммоль/л
GSSG, Зависимость активации от добавок фо рмамида:
0 5
45 1в5
2,5
167
256
283
177
78
23
8,8
8,9
9,4
7,7
8,9
9,9
8,6. 1607689
Формамид, Активность, моль/л %
0,5 59
1 175
1,5 245
2 325
2,5 423
3 444
4 416
5 341
Зависимость активации от добавок метилформамида:
Метнлформамид, Активность, моль/л %
L-аргийийа, ) мг7мл 3 А, 0,5ммоль/л
GSH, 0,5 ммоль/л СЗБС.
Зависимость активности от величины РН представлена в табл,4, ) . а б л и ц а 4
РН Ак тив нос ть, С тимулируем ос ть
% (коэффициент) 13,6
20,3
21,3
105
9
5. Зависимость выхода активности от GSH/GSSG концентрации.
Повторное окисление в 0 1 ммоль/л трис/НС1 (рН 1 0,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 0,5 ммоль/л I.-аргинина, 1 мг/мл BSA. а) 1 ммоль/л СЯН.
Зависимость активности от концент25 рации GSH представлена в табл. 5.
Активность, %
Таблица 5
GSH, Ак т ив ность, Стнмулируемос ть
30 (коэффициент) 0,5
1,5
2,5
72
134
207
261
204
237
14,9
15,3
13,3
12,5
2,1
239
273
)93
198
17
О
0,1
0,2
0,5
4 ) 98
5 141
Зависимость активации от добавок пропионамида:
Пропионамид, Активность, моль/л % б) О, 2 ммоль/л GSSG зависимость активности от концентрации GSSG представлена в табл. 6.
Та блица 6
Активность, СтимулиРУЮ
% мость (коэффициент) С$8С, ммоль/л
Актив нос ть, %0,5 55
1 52
4. Зависимость выхода активности от величины РН.
Повторное окисление в 0,1 моль/л трис/НС1, 1 ммоль/л ЕДТА„0,5моль/л
0,5
1,5
2,5
4
Зав ис им ос ть ацетамида:
Ацетамид, моль/л
0,5
1,5
2,5
4
Зависимость бутирамида
Бутирамид, моль/л
304
389
466
452
121 активации от добавок
99
197
150
101
2 активации от добавок
5С О,О5
0,1
0i2
0 5
5
)5
)12
142
273
143
2,2
3,8
6,8
7,4
6,8
7,9
6,3
5,) 1607689 !0
1 ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/л L-аргинина, 1 мг/мл BSA и 2 ммоль/л GSH (табл. 17) .
Воспроизводимость результатов активации tPA,SSG представлена в табл. 8.
Пример 4. Активация tPA сме шанными дисульфидами ):РА и глютатиона.
Использование "refractile bodies полученных по одному из предыдущих примеров, Восстановление "refractile
bodies" проведено за 2 ч инкубации ! при комнатной температуре в 0,1 моль/л, трис/ЧС1 (pH 8,6), ) ммоль/л ЕДТА, 6 моль/л Gdn HCl, 0,2 моль/л ДТЕ при концентрации протеина около I мг/мл.
Диализированный 0,0) мл/л НС1 восстановленный протеин разбавляют в соотношении 1:1 0,1 моль/л трис/НС1, рН 9,3, 9 моль/л мочевины и0,2 моль/л
GSSG и инкубируют 5 ч .при комнатной температуре.
После подкисления концентрированной соляной кислотой до рН Э проводят диализ 0,01 моль/л НС1 при.4 С. После диализа общая концентрация протеина составляет 0,35 мг/мл. Таким образом получают tPASSG. а) рН вЂ” оптимум активации tPASSG. 25
Здесь, как и в последующих экспериментах по оптимизации условной реактивации, не применяют GSSG и активацию проводят через 17 ч путем разбавления в 0,) моль/л трис, ) ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/л L-аргини" на, 1 мг/мл BSA и 1 ммоль/л GSH npu изменении величины рН (табл. 7).
Таблица 8
8,65
4,47
4,49
8,50 ,45
4,32
3,29
3,54
5,07
2
4
6
8
Средняя величина
7,0
9,3
9,7
6,5
17,2
8,3
)4,0
13,4
)6,4
5,1+ ),9
11,3+,8 в) Стабильность активированного протеина.
Активацию проводят в 1:200 разбавлении в О,l моль/л трис/НС1, 1 ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/л Ь-аргинина, мг/мл BSA и 2 ммоль/л GSH.
Данные о стабильности активированного протеина приведены в
35 табл. 9.
Таблица 7
Та блица 9 рН
Время
6
47
45. 71,2) 5
239
1,35
11,4
)5,5
23,1
23,6
2I 5
22,6
14,3
5,66
7,32
8,65
8,59
8,32 °
6,)5
3,07
7 1
8,2
7,0
8,7
11,7
12,5
11,2
7,5
8,5
9,5
10,5
Выход, 7 Стимулируемость
Выход готового продукта определен по проценту активности tPA в пересчете на введенное количество протеина, б) Воспроизводимость результатов активации tPASSG.
Все данные активации суммируют; после 1:)00 или 1:200 разбавления в О,) моль/л трис/НС1 (рН 8,5), Выход, Х Стимулнруемость
Выход, Х Стимулируемос ть
0,89
2,43
2,83
2,62
2,21
2,28
II р и м е р 5. Активация полученного генной технологией интерфероíà-Р.
Восстановление/рас тв оренис и ров одят следующим образом: осадок инкубируют Э ч при 25 С в 10 мл 9,1 моль/л трис/НС1 (рН 8, 6), 6 моль /л Gdn НС1, 1 имоль/л ЕДТА и 0,2 моль/л ДТЕ и . после 30 мин центрифугирования при
4ОС и 48000 g величину рН надосадоч160768
Таблица 10!
13
13
13
13
0,5 ,0 5
0 5
0,5
0,1
0,5
1,0
5
5 иой жидкости устанавливают концентри" рованной НС1 около 3, Затем проводят гелевую фильтрацию через Sephaclex
G25 в 0,01 моль/л НС1.
Элюат исследуют на проводимость, концентрацию протеина и реактивируем,ость, Активацию повторно окисленного протеина определяют по стандартной активации (= 100%) в 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 5 ммоль/л GSH) 0,5 ммоль/л GSSG u
0,25 моль/л L-аргинина, а) Зависимость выхода активации от добавки L-аргинина.
Элюат разбавлен 0,1 моль/л трис/
НС1 (рН 8,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 5 ммоль/л GSSG и активирован 20 ч при 0 С.
Зависимость активации от L-аргинина следующая
L-аргинин, Ак тив ность, моль/л %
9 12
Элюат разбавляют 1:50 буфером
0,1 моль/л трис/НС1 (рН 8,5), 1 ммоль/л ЕДТА и 0,25 моль/л L-аргинина и пробу исследуют после 17 ч активации при 0 С.
Зависимость активации от добавки
GSH/GSSG представлена в табл. 10.
G SH/G SSG, Зав ис им ос ть. Ак тивнос ть, ммоль/л активации, % ммоль /л
Ак тив нос ть, %
Мочевина, моль/л
13
100
0,5
13
13
40
1,5
56
Ак тив нос ть, % рН
6,5
7,5
8,5
9,5
10,5.0
l3
100
0,25 8
0,5 15
0,75 15 б) Зависимость выхода активации от добавки мочевины.
Раствор активации соответствовал рас тв ору п о пункту а), однак о ак тио вацию проводят 17 ч при 0 С.
Зависимость активации от добавки мочев,ины: в) Зависимость выхода активации от добавки формамида.
Активация как в пункте a); пробы исследуют после 17 ч активации при
00 С
Зависимость выхода активации от добавки формамида:
Формамиц,, Ак тив нос ть, моль/л %
О 13
1 13
2 13
3 0
4 0 г) Зависимость выхода активации от окислительно-восстановительного буфера. д) Зависимость выхода активации от добавки BSA.
Элюат разбавляют 1:50 буфером
О, 1 моль/л трис/НС1 (рН 8, 5), 1 ммоль/л ЕДТА, 5 ммоль/л GSH, 0,5 ммоль/л GSSG и 0,25 моль/л L-аргинина и исследуют через 17 ч активации при ООС;
Зависимость активации от добавки
В$А:
BSA мг/мл Ак тив нос ть, % е) Зави имость выхода активации от рН.
Элюат равняют 1:50 буфером
О,) моль/л трис/НС1 „ 1 ммоль/л ЕДТА, 5 ммоль/л L-аргинина и исследуют че" рез 17 ч активации при 0 С, Зависимость активации от величины рН;
1607689
13
Формула изобретения
Составитель Т. Забойкина
ТехРед JI.Сердюкова КоРРектоР М. ШаРоши
Редактор М. Циткина
Тираж 493
Подписное
Заказ 3556
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035,;1осква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина,101
1. Способ активации тканевого активатора плазминог ена, . включающий экспрессию гена tPA в клетках Escherichia ñî1i или Pseudomonas putida, включающий суспендирование и разрушение бактериальных клеток в буферном растворе, отделение нерастворимых составных частей, салюбилиэацию в растворе, содержащем 6 моль/л гуанидинхлорида в присутствии 0,150,2 моль/л DTE очистку с отделением денатурирующего средства и восстановителя, реактивацию в слабом денатурирующем растворе путем обработки окисленной — gSSg и восстановимой—
gSH, отличающийся тем, что стадию реактивации осуществляют при рН 9-11, при концентрации gSSg
0,05-3 ммоль/л и концентрации gSH
0,1-20,0 ммоль/л, а в качестве слабого денатурирующего раствора используют раствор L-аргинина в концентра- 25 ции 0,05-1,0 моль/л, или мочевины в концентрации 1-4 моль/л, ипи метилмочевины в концентрации 0,5-3,0 моль/и, или диметилмочевины в концентрации
0,5-1,0 моль/л, или этилмочевины в концентрации О. 25-0, 7 5 моль /л, или формамида в концентрации 0,55,0 моль/л, или этилформамида в концентрации 0,5-5,0 моль/л, или ацетамида в концентрации 0,5-4,0 моль/л, или бутирамида в концентрации 0,51,0 моль/л.
2. Способ поп. 1, о тлич а ю шийся тем, что стадия реакти- щ вации концентрации - gSH составляет
О, 2-1 О, О ммоль/л и/или концентрация
gSSHg 0,05«1,0 моль/л, 3. Способ по п. 1 или п.2, о т л и— ч а ю шийся тем, что перед реактивацией проводят дополнительную стаI дию очисTKи
4. Способ по п. 1 или п.2, о т л и— ч а ю шийся тем что реактивацию проводят в присутствии денату" рирующего средства и восстановителя, при этом реакционную смесь после процедуры денатурации - восстановителя разбавляют буфером реактивации так, ч тобы п ри последующей реактивации концентрация gSSg превосходила остаточную концентрацию
ДТЕ.
5. Способ активации тканевого активатора плазминогена, включающий экспрессию гена tPA в клетках Escherichia coli или Pseudomonas putida, включающий суспендирование и разрушение бактериальных клеток в буферном растворе, содсржащем 6 моль/л
ryaHHpHíõëoðèäà в присутствии 0,50,2 моль/л ДТЕ, очистку с отделением денатурирующего средства и восстановителя с последующей реактивацией, отличающийся тем, что после отделения гуанидинхлорида белок переносят на смешанный дисульфид инкубацией с gSSg при концентрации
0,1 моль/л в присутствии 4,5 моль/л мочевины, а реактивацию проводят при рН 7-10,5 путем обработки gSH в концентрации 1-3 ммоль/л в присутс тв ии О, 5 м оль /л Ь-а рг и нина, 6. Способпоп. 5, о тлича ю шийся тем, что стадию реак-. тивации проводят в сывороточном альбумине BSA.
7. Способ по п..1 или п. 6, отличающийся тем,что суспендирование и разрушение бактериальных клеток проводят в С,1 М трис-буферном растворе с рН 6,5.
