Ассоциация микроорганизмов для скармливания молодняку крупного рогатого скота

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новую ассоциацию целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Целью изобретения является повышение прироста живой массы молодняка крупного рогатого скота за счет увеличения потребления грубого корма и повышения перевариваемости клетчатки в пищеварительном тракте животных. Ассоциация состоит из смеси штаммов бактерий CLOSTRIDIUM THERMOCELLULOLITICUS ВКПМ В - 4291, KUMINOCOCCUS ALBUS ВКПМ В - 4292 и CLOSTRIDIUM LOCHHEADII ВКПМ В - 4290 в соотношении 38 - 50:19 - 25:31 - 40 соответственно. Ассоциация позволяет увеличить привес животных на 10 - 26%, улучшить микробиологические и биохимические показатели желудочно-кишечного тракта. 14 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К A BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР 1 (21) 4663151/13 i 4674149/13 ,(22) 16.03.89 (46) 23.08.91. Бюл. 11 - 31 (71) Всесоюзный научно-исследовательский инститУт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных (72) Т.А.Николичева, Б.В.Тараканов, Г.Б.Бравова, Н.H.Гаврилова и Е.И.Белевич (53) 576.8(088.8) .(56) Авторское свидетельство СССР

1043165, кл . С 12 N 1/0О, 1983. (54) АССОЦИАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ

СКАРМЛИВАНИЯ МОЛОДНЯКУ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и предИзобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новую ассоциацию целлюлозолитических микроорганизмов.

Целью изобретения является повышение прироста живой массы молодняка крупного рогатого скота за счет увеличения потребления грубого корма и повышения перевариваемости клетчатки в пищеварительном тракте животных.

Ассоциация состоит из смеси штаммов бактерий Clostridium thermocelluloliticus ВИП1 †42, Ruminococcus

albus ВКП11В-4292 и Clostridium lochheadii ВК171 В-4290 в соотношении, равном (38-50): (19-25): (31-40) соответственно.

„„SU„„1671693 A 1 (Я) 5 С 12 P 39/ОО, А 23 К 1/165

2 ставляет собой новую ассоциацию целлюлозоразрушающих микроорганизмов.

Целью изобретения является повьш ение прироста живой массы молодняка крупного рогатого скота за счет увеличения потребления грубого корма и повышения перевариваемости клетчатки в пищеварительном тракте животных. Ассоциация состоит из смеси штаммов бактерий Clostridium thermocelluloliticus ВКПМ В-4291, Rumxnococcus albus ВКПМ В-4292 и Clostridiuy lochheadii ВКПМ В-4?90 в соотношении (38-50):

:(19-25):(31-40) соответственно. Ассоциация позволяет увеличить привес животных на 10-26Х улучшить микро- с ф биологические и биохимические показатели желудочно-кишечного тракта.

14 табл.

* Ассоциация выделена из рубца телят, в рационе которых использовано 407 грубых кормов. .Селекцию ассоциации осуществляют на питательных средах с соломой, сеном и травяной мукой в качестве един- Ж ственного источника углерода. Основ- C4 ным критерием для отбора ассоциации является ее способность быстро и наиGo;-ee полно расщеплять целлюлозу названных источников углерода в питательной среде. В in vitro экспериментах оценивают целлюлоэолитическую активность ассоциации, убыпь клетчатки, уровень белкового азота, концентрацию редуцирующих сахаров и летучие жирные кислоты (ЛЖК) в культуральной жидкости.

16 71693

Общую це:?чюлозолитическую активность определяют по гидролиэу Ьильт— ровальной бумаги марки Ле?в?вградская хроматограсн ческая по методу Иандельс-Вебера с последующ??м определением редуцирующих сахаров по Нельсону и Сомоджи. На единицу активности принимгиот 1 мг редуцирующих сахаров, образующихся под действием 1 мл куль- 10 турально"I жидкости при рН 6,9 и тем9 пературе 39 С в течение 1 ч. Убыль клетчатки устанавливают весовым методом по Чюрлисч. Эндоглюканазну?о активность определяют -вискозиметрическим методом по степени разжижения карбоксиметилцеллюлоэы (КИЦ) и по действию на нее 17.-ного раствора с последующим определением редуцирующих веществ в .пересчете на глюкозу. 20

Белковый азот определяют по Къельдалю, общий уровень ЛН<К вЂ” методом паровой дистиллядии в аппарате Иаркгама, а их с тношения — с помощью гаэожидкостной хроматографии. 25

Ассоциацию выращивают на стерильной модио?ицированной питательной среде Хангейта, содержащей, г/л: КН РО

0.2; К2НРОФ 0,5е ИКАО 4 0?1; Сас12

0,01; ХаС1 1; (ИН4) ЯО4 0,5; соляно- 30 кислый цистеив 0,2; ИаНСО 5; пептон

1; дрожжевой экстракт 1; фильтровальная бумага или другой источник целлюлозы 10; фильтрат содержимого рубца

200 мп; дистиллированная вода — до

1 л, рН среды 6,8 — 7,2. Дпя создания анаэробиоза среду перед посевом насыщают СО, затем осуществляют засев среды ассоциацией и культивируют в пробирках, закрытых резиновыми Ilpop-40 ками, при 38 — 39 С в течение 4

5 сут до полного расщепления полоски фильтровальной бумаги.

Для выделения чистых культур иэ накоп??тельно?? используют метод предель- 45 ных разведений с последующим рассевом на агаризованные среды такого же состава, но с разными источниками клетчатки, методом roll tube culture. ,Дпя и??актива??и?? неспоровых МНКроор 5р ганиэмов ассоциацию прогревают при

100оС в течение 10 мин, а затем выделяют термойильные целлюлозолитические микроорганизмы по Снежко.

Чистоту выделенных культур прове—

55 ряют микроскопически и высевами на плотные питательные среды с КИЦ, 0,51 целлобиозы и жидкую среду .Хангейта с полосками Ьильтровальной бумаги.

При изучении биологических свойств у чистых культур бактерий, выделенных из ассоциации, используют обычно применяемые для идентификации тесты, а количественные соотношения видов в ассоциации определяют по морфологическим различиям путем прямого подсчета клеток под микроскопом по методу Брида.

В результате исследований быпо установлено, что активно разлагающая целлюлозу ассоциация бактерий состоит из Clostridium thermocellulolit icus, штамм Р BKIIM В-4291 (17), Puminococcus albus У ВКПМ В-4292 (37) и Clostridium lochheadii9 ВКПИ В-4290 (8), количественные соотношения между которыми варьируют в пределах (38 — 50):

:(19-25):(31-40) соответственно.

Штамм бактерий Clostridium thermocel1ulo lit icus 11? 17 идентифицирован по Берги, депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-429 1.

Клетки имеют форму тонких, прямых или слегка изогнутых палочек. Размеры варьируют в пределах (0,3-0,4)х х(4-12) мкм, а в культурах 12 — 15-сРточного возраста длина клеток достигает нескольких десятков микрон. Окраска по Граму вариабельна. Образуют овальной формы терминальные споры размером от 0,5 до 0,8х(1 — 1,2) мкм.

При развитии культурЬ| на плотных средах может наблюдаться полиморфизм: палочки длинные, нитевидные и корот— кие, по форме напоминающие кокки. факультативный анаэроб. На поверхности ИПА с целлобиозой в твердой среде Хангейта с 107. КМЦ образует мелкие, округлые с ровными краями колонии, и глубине среды они имеют форму чечевички. На скошенных агаризованных средах культура может расти сплошным штрихом. В жидкой питательной среде с фильтровальной бумагой расщепление целлюлозы наблюдается визуально уже через 72 ч после посева. Бумага раэрыхляется, слегка окрашивается в желтый цвет пигментами бактерий и через

4-5 дней брожение обычно заканчивается. На дне пробирки остается небольшой, рыхлый осадок из остатков неразрушенной целлюлозы.

Штамм хорошо растет в диапазоне температур от 38 до 60 С, а споры

0 выдерживают кипячение в течение 10

15 мин.

16 716<13

Бактерии сбрл,<а<в,нот с образованием кислоты целлн<позу, ксилан., млльтозу, слхарозу, к< илезу, лрлбинозу, целлобиозу и нс Аерментируют маннит, сорбит, инозит, инулин, дульцит, глице5 рин, мелибиозу, глллктоз,, трегалозу, рлф<Ьинозу, лактоэу, рамнозу, *руктозу и салицин. Крахмал не расщепляют. Молоко свертывают медленно. Образуют сероводород, но не продуцируют индол .

Нитраты восстанавливают.

Расщепление штаммом целлюлозы

Аильтровлльной бумаги зл 24 ч культивирования составляет 35 †407, а общая целлюлозолитическля и эндоглюканазная активности достигают 0,36 и

0,24 ед/мл соответственно. При этом в среде накапливается 12 — 20 мг/

/100 мл среды редуцирующих сахаров 20 и 6,7 — 7,8 ммоль/100 мп ЛЖК, в составе которых доля уксусной, пропионовой и масляной кислот обычно варьирует в пределах 75 — 80, 4 — 12 и 2,8

97. соответственно. Штамм не патогенен.25

Штамм Ruminococcus aibus М 37.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-4292.

Клетки сферические или слегка 30 овальные от 0,9 до 2 мкм в диаметре, в мазках располагаются одиночно и короткими цепочками. Окраска по Граму вариабельна. Перед делением клетки незначительно удлиняются.

Для культивирования требует строго анаэробные условия . Питательные среды перед посевом насьнцают бескислородной газовой смесью из СО u Ng (1:1).

На поверхности агара, содержащего 4п

0,5Х целлобиозы и рубцовую жидкость, образует мелкие, круглые и выпуклые колонии, а в глубине среды колонии имеют форму линзы и окрашены в белый или светло-желтый цвет.

Ферментирует целлобиозу, целлюлозу, глюкозу, лактозу, маннозу и не сбраживает арабинозу, декстрин, гллактозу, мальтозу, раффинозу, сахарозу и трегалозу. Индол и сероводород разует.

Расщепление штаммом целлюлозы, фильтровальиой бумаги за 24 ч культивирования составляет 12 — 157, а общая целлюлозолитическая и эндоглюканазная активности достигают О, 12 и

0,23 ед/мл соответственно. Конечными продуктами ферментации целлюлозы являются уксусная, пропионовая, маслянля и нллерил«оная vèc. <от<,< л т ля:< глз.

11!тамм Бншiпос осc«s л1h«s 1" 37 сбраживает цел.ч« лозу зна <ительно м<.дленнее, чем ассоцилпия, из которой он выделен. Обычно его числ< нность в ассоциации влрьиру< т п пределах

19 — 25Х, «о члше составляет 257.

При выращивании руминококков в составе ассоциации прн 45 — 50 С оьн< те—

pHNT активность и па 3 — 4-е <-утки погибают. Оптнмл.<ь«o! < cрсдой для в< <— ращивания этого штлммл является среда с 1Х фильтровлльной бумаги и 30? рубцовой жидкости. 1<1тамм не плтогснен.

Штамм Clostridium 1ochheadii Р 8 идентифицирован по моногра4ии HunBate R. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промьпнленных микроорганизмов под 11 В-4290.

Грамположительные палочки от 0,8 до 1,0 мкм шириной и 7 — 9 мкм длиной. Могут образовывать гигантские клетки, внутри которых располагаются споры. Размер спор колеблется в пределах (1,0 — 1,5)х(2 — 3) мкм.

Гтрогий анлэроб.

На поверхности плотной среды с целлюлозой образует колонии с неровными краями и плльцеобразными выпячиваниями. При длительном культивировании (10 — 12 сут) вокруг колоний наблюдается зона расщепления целлюлозы шириной 1 — 2 мм. На жидкой среде дает рыхлый осадок на дне пробирки. Штамм может расти на питательных средах без рубцовой жидкости, но при условии замены ее экстрактами из сена или смеси кормов для жвачных животных.

Ферментирует целлюлозу, глюкозу, целлобиозу, мальтозу, сахарозу, крахмал и салицин. Лакмусовое молоко пептонизирует за 48 ч .

Штамм Clostridium lochheadii М 8 является активным разрушителем клетчатки. Его численность в ассоциации варьирует от 31 до 407, но чаще составляет 357.. Расщепление клетчатки травяной муки достигает 62,5 — 65, 7Х, а основными конечными продуктами брожения являются уксусная, масляная кислоты и газ. Гидролиз целлюлозы фильтровальной бумаги за 1 сут составляет

45 — 527, а общая целлюлозолитическая активность 0,2 — О,?5 ед/мл. Штамм не патогенен.

Ассоциация трех видов целлюлозолитических бактерий хранится в музее

1671693 культур лаборатории биотехнологии микроорганизмов пищенаритепьногo тракта сельскохозяйственных животных ВНИИ

Физиологии, биохимии и питания сель5 скохоэяйстненных животных. Она обла— дает высокой целлюлозолитической активностью. После 72-часового культивирования общая целлюлозолитическая активность составляет 0,3 ед/мл, эндоглюканазная активность достигает

0,5 — 0,6 ед/мл, а в среде накапливается до 58 — 70 мг /100 мп редуцирующих сахаров. Кроме целлюлозы ассоциация сбраживает ксилан, крахмал, Ксп- !5 ! лозу, глюкозу, мальтозу, арабинозу, целлобиозу, маннозу, лактозу, сахарозу и фруктозу, а маннит, сорбит,.иноэит, дульцит, глицерин, инулин, мели,биозу, трегалозу, раффинозу и рамнозу 20 не ферментирует.

Интенсивность роста ассоации и ее ферментативная активность в значительной степени зависят от условий культивирования. 25

Оптимальные условия для роста создаются при внесении в свежую среду

10Х маточной культуры ассоциации и дальнейшее увеличение ее количества .существенно разрушение целлюлозы не улучшает. При внесении меньшего объема инокулята развитие ассоциации замедляется и процесс расщепления целлюлозы удлиняется до 8 — 9 сут.

КультивиРование ассоциации проводят в анаэробных условиях, поскольку в условиях аэрации рост бактерий и разложение клетчатки сильно замедляются.

Концентрация целлюлозы в среде не должна превышать 1 — 27, так как увеличение уровня этого полимера приводит к уменьшению ферментации сухого вещества, сырой клетчатки и снижению концентрацИи ЛЖК. 45 ф

Оптимальная температура для роста ассоциации и образования целлюлозолитических ферментов находится в диапазоне 38 — 40 0. Снижение температуры инкубации до 30 С удлиняет процесс о расщепления целлюлозы фильтровальной бумаги н среде до 8 — 10 сут вместо

3 — 4 сут при 39 С, а повышение температуры до 45 — 50 С прнноднт к гибели о руминококка.

Наилучшее развитие ассоциации и гидролиз целлюлозы наблюдаются при начальном РН среды н пределах 6,8 — 7,?, 11ри этом РН среды н 6 — суточной культуре снижается до 5, 5, концентрация

ЛЖК достигает 12, Ь вЂ” 14, 5 ммоль/

/100 мл, а молярная доля уксусной, пропиононой и масляной кислот варьирует н пределах 75 — 79, 1Π— 12 и

8 — 167 соответственно. При РН 5 и 9 роста .ассоциации не наблюдается.

Ассоциация удовле".ворительно переносит 12-часовой кочтакт с воздухом и сохраняет жизнеспособность после высушивания при 55 — 60 С. Способо ность к разрушению целлюлозы у сухой ассоциации сохраняется после ее хранения-при комнатной температуре или о в холодильнике при 5 С в течение 8

10 мес. При высушивании ассоциации на воздухе происходит гибель румино" кокков, что снижает целлюлозолитическую активность сухого препарата на

20 — 2 57..

Пример 1. Приготовление ассоциации целлюлозолитических бактерий.

Готовят питательную среду следующего состава, г/л: КН РО, 0,2; IC Н1 О,,),5; .1@80 д,1; СаС1 0,01; NaC1 1

9 1 t (ЯН ) $04 ),5; солянокислый цистеин

0,2; НаНСО 5; пелтон 1;.дрожжевой экстракт 1; фильтровальная бумага или другой источник целлюлозы (размолотое злаковое сено, солома, травяная мука или свекловичный жом) 1Х; содержимое рубца 200 мл; дистиллированная вода — до 1 л . В качестве заменителя рубцовой жидкости н среду целесообразно вводить соли ЛЖК в количестве

5 мг уксуснокислого натрия, ЯО мг иэомасляного натрия и по 90 .мг валерианонокислого и изовалериановокислого натрия. РН среды устанавливают 6,8 — 7,2, закрывают резиновыми пробками с дефлегматорами н стерилизуют при 1 атм в течение 30 мин. !

В готовую среду вносят 10 об. 7. ассоциации целлюлозолитических бактерий с соотношениями Сl. thermocellulо l it i cu s; R. al bus; Сl . 1ochheadi i, равными (38-50): (19-25): (31-40) соответственно, концентрация клеток в которой варьирует н пределах(3,7 -4,ф л10 /мл . Посевы инкубнруют в термостате при 38 — 39 С в течение 4 — 5 сут. о, При нормальном развитии культуры энергичное Расщепление клетчатки начинается спустя сутки после посева. Через

4 — 5 дн, брожение заканчивается и на дне сосуда оста тся небольшой, рыхлый, ачорйный осадок. Готовую ассоциацию

lJ) I

lflf JI ltPIf (—

II p lt и (р,l. !$3(((ян((с со«тft«ttt

Из представленных в табл .. 1 данных видно, что лучшим источником целлюло- 25 зы для ассоциации целлюлозолитнческих бактерий является Ьильтровальная бумага, затем следуют травяная мука, свекловичный жом,злаковое сено и на последнем месте находится пшеничная солома. Кроме того, переваривание клетчатки соломы и сена не остается постоянным, а существенно меняется в зависимости от соотношения видов бактерий в ассоциации и максимальных

35 значений достигает при соотношении

Cl.thermocellulo1 it icus, R.albus и C l . 1ochh ca

В другом опыте переваривание клетчатки микрорациона, состояцего иэ

0,8 г комбикорма и 1,2 г сенажа, ассоциацией с соотношением видов Cl.

thernocellulo lit icus, R.alhus u Cl.

lochheadii, равным 38:"-22:40, также было высоким и составило 58,47.

Высокая целлюлозолитическая активность ассоциации обеспечивается при соотношении видов Cl.thermocellulo liticus, R.albus H Cl.lochheadii в пределах (38 — 5 .!):(19-25):(31-4<)) соот50 ветственно, а максимальная переваримость клетчлтки соломы и сена достигается при отношении, равном 40:25:35.

Пример 3. В серии опытов in

vitro с применением различнь(х источников клетчатки в питательной среде

55 ( сена тимофеечного, соломы, травяной муки и сухого свекловичного жома, проведена сравнительная оценка образова!

IJf!I пРо(Уктон <(3 Р. < l! г! !!Ilt l I <Р< «(К ((Т I 3ТК(f (ГГ(;lo (,(ительност((Kx . (ьтин((ронл и((я. г сухо((7 р(3 з (о (<)тог(1 субеTpaT;l д(блв

О турлльной среде опр gerltff<3T убыль c V— хого вещества и сыр.>й клетчлтки, Ko!I— цецтрлции белкового лзотл, pacTHopfr(((rx углеводов и .1ЖК, л также lrK моляр— ные соотношения. результаты предстан— лены в табл. и 3.

Клк видно из тлбл. If 3, нлиболь— шая уб(в(ь клетчлтки наблюдле тс Я нл

4-е и 6-е сутки культивирования, Но концентрация редуцируюгв(х сахаров и белкового лзотл в гн(тлтельной среде на 6-е сутки имеет тенденцию к снижеHHK!. Снижается также доля vKcvcной кислоть(и общий уровень Л;!(К в культуральной жидкости.

Все это свидетельствует о том, что максимальная метлболи((еская лктивность ассоциации проявляется при культивировании в течение 4 — 5 дн.

Пример 4. Исследуют влияние различных температур культивирования (3О, 38 — 39 и 5О С) на целлюлозолитическую активность штаммов, входящих в ассоциацию, образование ЛЖК и их соотношение в 4-суточной культуре.

Культивирование проводят в пробирках под резиновыми пробками, а начальная величина рН среды во всех вариантах 6,8.

Оптимал ьной для роста и целлюлозолитической активности у всех штаммов является температура 38 — 39 С (табл . 4). Как понижение температуры культивирования, ТаК и ее повышение приводит к снижению целлюлозолитической активности. При этом уменьшается валовое образование ЛЖК (табл.5).

Пример 5. Изучают влияние начального значения рН среды на общую целлюлоэолитическую, экзоглюкозидазную и эндоглюклнаэную активности, а также продукцию ЛЖК отдельными штаммами бактерий, составляющих ассоциацию; проводят серии опытов zn vitro., (ля этого штаммы выращивают на среде с целлюлозой (состав приведен в примере 1) при различных значениях рН

1671693!

2 от 5 до 9. Культивирование ведут при

38 С в течение 96 ч.

Оптимальные условия для образования целлюлозолитических ферментов и

ЛЖК обеспечивает среда с начальным значением рН, равным 7, (табл.6).

В этих условиях штаммы продуцируют наибольшее количество ЛЖК Р(О 01 с максимальной молярной . долей ацетата (табл. 7) .

Пример 6. Изучают использование получ нн )I1 ассоциации для скармливания бычкам.

Формирунп две-группы животных по

6 голов в каждой. 5 — 7-месячных бычков кормят в соответствии с существующими нормами.

В сухом веществе рациона концент.раты составляют 267, сочные корма 297 и грубые корма 457. Первая группа служит контролем, а бычки второй группы ежедневно в смеси с концентратами в утреннее кормление получают по 50 мл ассоциации целл1олозолитических бакте- 25 рий, содержащей 180 — 200 млрд. мик— робных клеток. За подопытными животными ведут клинические наблюдения, в течение 55 дн. следят за функцией желудочно-кишечного тракта и его микро- 30 флорой, учитывают поедаемость кормов, определяют перевариваемость питательных веществ и использование азота.

Скарм:швание ассоциации целлюлозолитических бактерий бычкам не оказывает неблагоприятного действия на функции желудочно-кишечного тракта, общее состояние животных и стимулирует потребление ими грубого корма.

Так, бычки опытной группы съедают по 40

1,69+0,02 кг тимофеечного сена, а контрольной — по 1,38+0,05 кг или на

187 меньше (Р(0,05) .

В содержимом рубца у животных, получавших микробную добавку, количест- 45 во целлюлозолитических бактерий и активность целлюлозолитических ферментов максимальные, что свидетельствует о функционировании в преджелудках вводимой с кормом микробной добавки (табл . 8). Создающаяся при этом метаболическая ситуация обеспечивает повышение перевариваемости питательных веществ кормов и лучшее использование азота (табл. 9).

Прирост живой массы у подопытных бычков увеличивается íà 26! (P(0,001), а затраты кормовых единиц и переваринаемого протеина на 1 кг прироста уменьшаются на 20,8 н 21,2 7, соответственно (табл. 10) .

Пример 7.

Определение максимально эфйективных доз скармливания ассоциации целлюлозолитических бактерий проведено методом групп и периодов на телятах с 6- до 9-месячного возраста.

По принципу парних аналогов формируют 3 группы по 15 голов в каждой (5 телочек и 10 бычков). Средняя живая масса телят при постановке на опыт составляет 169 †1,5 кг. Кормление животных проводят в соответствии с нормами В1Иа три раза в день. Рацн— он состоит из 1,5 — 2 кг тимофеечного сена, 8 кг кукурузного силоса (Т период) или 8 Kr разнотравного сенажа (II период), 1,5 — 2 кг комбикорма, 0,2 кг подсолнечникового шрота (II период), 20 — 25 г поваренной соли и 30 г монокальциййосфата.

Первая группа в обоих периодах опыта служит контролем. Вторая группа в Т периоде (31 день) дополнительно к основному рациону получает ежедневно в дневное кормление в смеси с концентратами по 30 мл ассоциации целлюлозолитических бактерий, а во II периоде (60 дней) — по 100 мл. Телята третьей группы на протяжении всего опыта ежедневно получают по 60 мл ассоциации.

Скармливание разных доз микробной добавки не оказывает отрицательного влияния на функции желудочно-кишечного тракта и состояние здоровья животных, а наоборот, стимулирует микрофлору и ее метаболическую активность.

В рубце у животных, получавших микробную добавку, достоверно увеличивается количество Ьактерии, гидролизующих целлюлозу и гемицеллюлозы, причем существенно возрастает целлюлазная активность микрофлоры (табл.11 и 12). При этом коэффициенты переваримости сухого вещества и клетчатки рационов рубцовой жидкостью телят

in vitro повышается с 64 и 48,81 в контроле до 66,7; 68,7; 64 и 60,2;

62,4 и 53,97 у животных, получавших

30,60 и 100 мл микробной добавки соответственно. Более интенсивный гидролиз клетчатки в рубце сопровождается увеличением концентрации сахаров в содержимом рубца. Уровень ЛЖК у животных подопытных групп или не изменяется, или несколько повышается,, тогда

I 5

16 t jf>t) 1 и 3ftp Jlt. I(.11 If<>< т1 6jt l < t<< 111(я 11 1 II(jl! 1<) де опыrë сме(ц;1< т< я н сторону 1(ов(,п<1(.— (н(я обри.зования а(1(т;(тя за < I< т (ников ния проп((оната (табл. 11) . Пр(1 более

5 продолжительном (карм<(ивангн(добавки в дозе 60 мл нчблю<(ч в(<<не гя различия невелировалис ь, а дача 100 мл

КУЛЬТУР(1 УНЕЛ((Ч(lваС f !(акоПЛЕНИЕ Б CO тер;ч(мом рубца пропионата и бутирата

3а счет снижен1(я ацетата (табл. 12) .

Анализ зос;технических данных показывает, что максимальный прирост дают ж3(вотные, получа вшие ежедневно по

60 мл ассоциации целлюлозолитических бактерий (табл.13). При этом заграты кормовых единиц и перевариваемого протеина на 1 кг прироста живой массы vt teltblf(af<3T(s(в среднем на 10,8 и

10,97 соответственно.

Снижение суточной дозы микробной добавки до 30 мл или ее повышение до

100 мл существенно продуктивность телят не изменяет.

Таким образом, для стимуляции пере-!5 варивания питательных веществ кормов и роста молодняка крупного рогатого скота ассоциацию целлюлозолитических бактерий целесообразно скармливать в дозе 50 — 60 мл «а голову в день.

Пример 8. Производственная проверка эффективности применения ассоциации целлюлозолитических бактерий в кормлении молодняка крупного рогатого скота проведена в ОПХ Ермолино

Il

„35 и колхозе им. Иарп(ала Жукова.

В ОПХ "Ермолино" из бычков 10

11-месячного возраста по принципу парных аналогов Формируют контрольную и 40 опытную группы по 24 животных в каждой группе. Кормление проводят в соответствии с существующими нормами.

В I периоде опыта (62 дня) рацион по питательности Гостоит из сенажа 45 и разнотравного силоса (557), комбикорма (457) и кормовой патоки (5,0X).

Общая питательность 6,3 корм.ед., сухого вещества 6,7 кг, 700 г переваримого протеина и 1,6 кг сырой клет50 чатки. Во II периоде опыта (58 дней) долю концентратов уменьшают до 22,7Z, а сочных увеличивают до 67,5Е, вместо патоки вводят кормовую свеклу. Рацион содержит 6,6 корм.ед., 7,9 кг сухого

55 вещества, 766 r перевариваемого протеина, 1850 г сырой клетчатки. На протяжении всего опыта бычки опытной группы ежедневно, дополнительно к осI1

Теplfl t . (11(кро(1114 ttt доба1< к<: Г 1(lilt(It чюТ с Jt rt t ICJI I K

;JIfI1lgду чль но на t,(<11,:((((lt(J T f1 îì v. В з в е—

IIIII B tI

Б ко<(хозе Ittf. Мари(ч<(ч Жукова про— из(3одст(3енную проверку проводят в тс—

we»It(3 мес. Опытft»fe группы Фор(п(ру— ют из 8 — 9месяч III< б(чков по -5 голов в каждой группе . Рацион кормле(п(я животн((х рассчитывают на 600 г суточного приростч и состоит из 1О кг силоса многолетьи(х трав, 1О кг разнотравного сенажа и 1,5 кг комбикорма.

Обе группы кормят одинаково, но опытные бычк((дополни(тельно к основному рациону ежедневно в смеси с комбикормом получают по 50 мл ассоц((ации целлюлозолитических бактерий. Взве(ш(вание животн(.(х проводят при постановке на опыт и при его окончан((и.

В обоих опытах осуществляют контроль за состоянч(ем здоровья яд(в(1тн((х.

Производственная проверка подтверждает полученные ранее данные о том, что скармливание ассоцичции целлнттозолитических бактерий бычкам при низком и умеренном уровне ко(гцентратов в рационе не оказывает неблагоприятного действия на Ayftt.film желудочнокишечного тракта, общее состояние животных и стимулирует потребление ими грубого корма.

Дача микробного препарата увеличиваеr в преджелудке общее количество микроорганизмов и особенно бактерий, гидролизующих целлюлозу и гемицеллю— лозу, а отмеченные в микрофлоре изменения существенно повышают ее гидролитические функции. Так, активность целлобиогидролаз в содержимом рубца у подопытных бычков возрастает на

21,5Z (P(0,01), а целлюлозолитическая активность суммарной микрофлоры— на 74,27. (P(0,05). При этом переваримость сухого вещества и клетчатки увеличивается до 55,8 и 33,2 против

51„4 и 27,27 в контроле соответственно.

Общая концентрация энергетических метаболитов в содержимом рубца бычков, получавших микробную добавку, значительно выше, что обеспечивает более полное удовлетворение потребностей животного в энергии.

Вызываемая скармливанием ассоциации целлюлозолитических бактерий мета1671693

1б

Таблица 1

Источник клетчатки в среде

40:25:35 50:19:31

75,9

63,2

51,6

49,0

30 5

64,4

64,1

Таблица2

Су

Сено тимофеечное

12,0+0, 1

25,0+0,2

26,0 0,2

20,0+0 1

34,5+0,3

42,64-0, 2

43,4+0,2

41, 7+0, 3

4040, 6

47+0,9

49+0, 8

26,7+0,09

33,420,11

42,8+0,12

42,5 0,12

8001

15,0+О, 12

16,0+О, 12

15,0+0,2

О

4

Сдлома

25,000,5

3 1, 040, 5

30)5+0,9

Травяная мука

42,44-0,21

43,24 О, 16

44, 94-0, 18

45,3+О 12

15, +0,1

38,0 -0,2

39,0+0,2

35,0 0,3

59,814,9

62,2+6,8

64,4+7,3

С ве кл овичный жом

17,04.0, 12

40, 0+0,23

38,0+0,11

34,110,11

39,3+0 16

44,91-0,2

44,8+0,15

О

4

6 °

58,"2+4,4

63, 7+4,5

64, 1Ф4,5 болическая ситуация в преджелудке обеспечивает лучшее использование животными питательных веществ и повыш;.— ет оплату корма (табл . 14).

Как видно из табл . 14, прирост живой массы бычков, получавших микробную добавку, увеличивается в среднем на 107., а затраты кормов (кормовых единиц и переваримого протеина) на

1 кг прироста снижаются на 9 — 9,47.

Формула и з о б р е т е н и я

Ассоциация микроорганизмов для скармливания молодняку крупного рогаФильтровальная бумага

Злаковое сено

Пшеничная солома

Травяная мука

Свекловичный жом того скота, содержащая целлюлоз ора з— рушающие микроорганизмы, о т л и ч ающа я с я тем, что, с целью

5 повышения прироста живой массы в кас j честве целлюлозоразрушающих микроорганизмов используют смесь штаммов бактерий Glostridium thermocelluloliticus ВКПИВ-4291, Rumir,ococcus albus

1ð ВКПМВ-4292 и Clo st r idium l ochhead i i

BKIIMB-4290 в соотношении (38-50):

:(19-25):(31-40) соответственно.

Коэффициент гидролиза клетчатки при соотношении Cl.thermocellulo 1 it icus, R. albus и Cl.lochheadii в асIS

1671693

Та блица 3

Субстрат

Время инкубации, сут

Уровень ЛЖК, м мол ь / 100 мл

Отношение ЛЖК, Ж

С С изо-С С изо — С

6,07 3,38

1,09 9,56

1,3 8,12

1,28 10,54

13,5 0,61

2,56 0,8

2,9 0,8

3,0 2,36

1,68

5,7

6 5

6,72

15,21

18,61

18,9

17,45

61,23

67,38

68,0

65,.3

Сено О

5,65 14,38

4,92 4,14

3,66 4,7

7,39 4,56

7,49

2,65

2,04

1,7

1,4

5)0

6,84

6,44

61,45

67, 73

68,80

63,24

11,03

18, 99

19,52

21,29

Солома 0

1,57

1,4

1,82

12,03 3,0

3,49 1,4

3,16 1,5

2,93 1,86

7,83 10,08

1,66 11,13

3, 16 6,69

1,45 18,2

57 03 10 03

6 1,84 20,48

63)08 22,41

61,0 16, 36

1,68

6,74

7,90

7,84

Свекловичныйный

24,0

19,54

22,6

14,47

7,46 3,45

2,4 1,14

2,44 1,92

2,52

7,27

6,53

6,44

49,02

61,13

64,5

62, 18

6,19 9,9

1,34 14,45

2,00 7,2

2, 18 16,81

3

6 жом

Таблица4

Активность отдельных компонентов целлюлазного комплекса, ед/100 мп

Номер штамма

ЭкзоглюкозиЭндоглюканаза по измедаза по осахариванию нению вязкости КМЦ

50 Р(0,05.

Р(0,001 .

Травяная мука 0

4

Температура культивирова— ния, С

17

38-39 37

37

С уммарная активность по фильтровальной бумаге, 7.

6,0+0,4»

15,0+1 4

1О, 7+1,3»

10,5+0,6

17) 2+1,4

7,0+1, 3

16)04 1,7

11,5+1) 3

0,8+О, 1

1)4+О) 1

1,3+О, 1

2,5+0 1

2,0 0,2

1,О+О, 1

2,0+0,2

1,8+О, 1

19.1+091%+

1, 7+0,2 И

1,5+О, 1+»

13,8+1) 1

24,0+2,1

23,0i2,1

12,3+1,3

18,0+1,5

11,8 -1, 1

Г1олярное отношение ЛЖК, 7

С од(. ржание )!ЖК, ммоль/

/100 мл!!омеp штамма

Темп .р»тура культиуксус- пропио- масляная новая ная иэовалериановая вировао нпя, С

26,2 4,Ч

23,6

13,83

11,64

12,23

17,86

13 6

16,8

2,08

1,62

1,25

0,21

0,36

0,39

38-39

Таблица 6 рН питательной среды

Суммарная акАктивность отдельных компонентов целлюлазного комплекса, ед/100 мп

Номер штамма тивность по

Ьильтроваль— ной бумаге, 7

Эндоглюка — Экзоглюконазная зидазная

4,3+0,2

9, 6+!), 6»»

5, 1)-О 3»"

4,93:0,2»

9,8+0 7

5,410,6 9,5<-0,6

26,5+2, 1

19,5+1, 7

4, 3+0, 4»"

5 8+0,5»"

5,8+0,5»»

2,6+О, 1»»

3,8+0,2

3,5+0,2 б,l) 7i0

8,0

9,0

+ РсО 05.

РсО,О .

37 ! 1

37

17

37

17

17

17

37!

37

37

2,1

2,9

2,4

6,5

7,?

6,8

2,4

5 б

4,!

48,9

52,8

56,0

77,57

81,23

78,4

48,68

68 0

53,08

8,85

14,65

9,83

6,33

4,72

6,98

31,57

17,2

27,9

1,1+0,1

1,1+0,1

1, 1+0,1

2,6+0,1

4,0 .0,2

7,0)-0,5

7,0+0,4

6,0+0,4

4,3+0,2

4,5 0,3

4,0+0,2

3,5+0,3

3,?+0,2

6,78

3,52

5,65

1,86

2,32

",09

1,68

1,0

1,89

9,8Й0,5

12,0+О, 7

10,4+0,6

11,4+0,8

14,2+0,4

10,6+0,3

2! 0 1,

21, 0+1, 2

17,0 1, 1

9,6+0,8

14,4+0,6

10,3+0 5

9,8+О, 7

14,211, 1

Т а б л и и а 5 валериа- капрононовая ая

7,38

3,44

3,75

0,2

0,23

0,21

0,20

0,33

1671693

Таблица 7

Номер штамма

Иолярное отношение ЛЖК, 7 рН среОбщее содержание

JINK, ммол ь/

/100 мл ды до инкубации уксус— пропио- масля- изовале- валериакапроновая ная новая ная риановая новая

1,62

0,38

0,34

0,65

0,07

5,0

7,0

9,0

Та блица 8

Группа животных

Показатель

1 (контрольная) 2 (опыт ..ая) 29,8(0,85

Общее количество микроорганизмов, млрд/мл

Количество бактерий, гидролизующих различные углеводы, млн,/мл: целлюлоза ксилан

25,5+0,54

25,31-1,3

6,4+0 23

4,88+0,29

3,5+О, 16

14, 9+0,45

6,98+0,4

3,5410,14

3,0+О, 12 пектин крахмал

Ферментативная активность микроорганизмов: целлобиогидролазная, ед./100 мл целлюло з олитиче ская, 7. пектинэстеразная, ед/мл амилолитическая, мг

Концентрация. сахаров в содержимом рубца, мг/1ОО мл

Концентрация ЛЖК, ммоль/100 мл

10,4 .0, 32

19, 084-0, 63

12, 1+0,48

24, 84+ 1,85

0,43+0, 03

65,9+0,26

О, 3 7 -0, 03

63,3+0,67

44,6+1,08

41,8 1,03

8,9Ю,05

8,6+0,36

Молярные соотношения ЛЖК, Х уксусная пропионовая изомасляная

74, 5 74-1, 09

12, 10 0, 10

9,95 0,29

65,07+1,31

1 7 у 80+1,24

0,59+0,09

17,34+1,47 масляная

37

17

37

17

37

17

1,9

2,2

1,6

6,7

7,4

6,8

2,1

4,9

2,8

58, 92

52,48

52,06

93,46

90, 76

79,23

63, 08

71,94

58,64

13,9

27,93

26,58

1,69

1,93

10,63

14,84

11,42

19,74

7,16

10,81

9,35

0,87

3,23

7,52

21,36

14,21

17,95

17,42

7,51

6,65

3,0

2,15

2,32

0 50

2,22

3,39

0,98

0,89

4,13

0,64

1,28

0,23

0,22

0,21

0,28

Продолжение табл. 8

Группа животш>Гх

Показатель

1 (контрольная) 2 (опытная) 1,96+0,15

3,19+ ),78

6,67

1 61+0,17

1, 3530 2-

6,97 изовалериаиовая валериановая рИ

П р и м е. ч а н и е. Достоверность разницы показана в сравнении с контролем: а — P(0,05; b — Р(0,01;

ñ1 — P(Э,001.

Таблица 9

Пока3атель

Группа животных

1 (контрольная) 2 (опытная) 70, 0 -0, 2

59,441, 1

71,7 0,8

66,2+1,32

49,9+3,13

67,912,32

93,2+1, 75

97,3+О, 7 с калом с мочой переварилось усвоено

Е от принятого

7. от переваренного

П р и м е ч а н и е. Достоверность разницы показана в сравнении с контролем: а — Р(0,05.

Таблиц а 10

Группа животных

Показатель

Контрольная Опытная

Живая масса бычков, кг при постановке на

162,3+9,0

199,3+12,0

159, 7+6,3

206,5210 2 опыт

46,8 3,4

851+?0,5

126

37,0+3, 1

675+24

100 массы затрачено: кормов»гс единиц, кг переваримого про5, 14

4,07

605

477 теина, г

Коэффициенты перева— римости, 7.: сухого вещества сырой клетчатки сырого протеина

Баланс азота, г/голову /сут: принято с кормом выделено в конце опыта

Прирост живой массы: валовой, кг среднесуточный, г

7 к контролю !

1а 1 кг прироста живой

30,41-4,18

14,9+3,57

62, 8+0,91

47,9+5,4

51,3+5 5

76,3+5,5

27,5+0,2

8,34.1,6

69,8+0 4

61,511, 11

63,2+1,9

88, 1 -3,3

26!

67!693

Та бл ица 11

Показатель

1 (контроль) 2 (30 мл) 3 (60 мл) Общее количество микроорганизмов, млрд/мл 23)0 0)56

Число простейших, тыс,/hUI 237) 3139,8

Количество бактерий, гидролизующих разные углеводы, млн/мл: целлюлозу ксилан

33, 1+О, 17

396,2+36,4

30)9 0)66

520,6+41,0

21)8+1) 7

13) 02 0,63

16,59 3) 1

5,57+0, 7

28,9+0)86

13)96+2, 13

19,9+2,04

5,87+ )) 3

16, 26+1, 06

8,46+0, 82

12, 5+1, 43

4,53ФО)38 пектин

13,25+! ) 4

12,25+1,2

8,494-1,4

31, 52+ 1, 99

56,6+0,65

30, 17+0) 9

58)04-1,28

23,00+0,46

55,0+0)96

27,04.1) 0?

9 0+0 34

36,8+2,04

8,8+0,4

31, 7+3, 7

10,2+3, 1

72,4+0,32

12, 9+0) 62

0,4+0,001

12,6<-0,36

7! ) 2+0) 63

12)3 0)69

15) 9-0) 33

69, 6 0, 46

15, 8+0) 64

13,9+О) 75

0,4+0 06

0,34.0,04 масляная иэовалериановая

0)8+0)02

1, 1 7т0) 21

0,5&0 01 валериановая капроновая

П р и м е ч а н и е. Достоверность разницы показана в сравнении с 1 группой а — P(0,05; б — P(0,02; в — Р(0) 01; r — P<0,001.

Таблица!2

Группа животных (доза препарата)

1 (контроль) 2 (100 мл) 3 (60 мл) Показатель.в °

Общее количество микроорга- низмов, млрд/мл 23)2 0)45

Количество простейших, тыс,/мл 280,75 6)7

Количество бактерий, гидролизующих различные углеводы, млн/мл:

29) 5+0) 82

27,3 -1)09 )

395,0+13,6

302)5+17)5

18,5 1) 62а 18 7+! 36

12,2+0,16г 6 79+0

10, 76+1,86

3,44+ 17 целлюлоза ксилан крахмал

Ферментативная активность микроорганизмов: целлобиогидролазная, мг/100 мл целлюлозолитическая, Ж амилолитическая, мг

Концентрация сахаров, мг/100 мл

Концентрацчя ЛЖК, ммоль/100 мл

Молярные соотношения, ЛЖК, 7: уксусная пр опионовая изомасляная

Группа животных (доза препарата) 1671693

Продолжение табл.l2

Группа животных (доэа препарата) (Показатель

9,22+2,77

16,8+2, 1

7, 35+9,92

12,212, 8

11,8+1, 36

15,96+1, 7 пектин

26, 19+2,0

24,26 И, 7

2 7, 99 .2, 09

11,65+0 48

40, 5+0, 51

8,634-1,57

43,241 6

12, О+О, 97

54, 1+О, 96

43,0»0,04

7, 13+0,68

43,3+6,07

9,0+0,34

36,5+1,57

8, Н 0,71

63,2+0,67

17,6+0,32

180083

1,2 0,03

63,2+0,64

18,3t0,48

15,210,46

1, 74 0,27

1, ОТО, 08

0,6+0,03

7,48i0) 17 масляная изовалериановая валериановая капроновая

7,3 710,06 рН

П р и м е ч а н и е. Достоверность разницы показана в сравнении с 1 группой: а - P(0,05; б - P(0,02; в — Р(0,01; r — P(0,001.

Т а б л и ц а 13

Показатель

Группа животных (Х период

Доза получаемой добавки, мл

Среднесуточный прирост:

60

100

100

112 г

% к контролю

Затраты на 1 кг прироста: кормовых единиц, кг . к контролю перенаримого протеина, r

4,21

100

4,24

100, 7

3,77

89,5

416

419

372

100, 7 8914

II период

100

, к контролю

Доза получаемой добавки, мл

100

60 крахмал

Ферментативная активность микроорганизмов: целлюлоэолитическая, % целлобиогидролазная, мг/1ОЧ мл амилолитическая, мг

Концентрация сахаров, мг/100 мл

Концентрация ЛЖК, ммоль/100 мп

Молярные соотношения ЛЖК, : уксусная пропионовая изомасляная

1 (контроль) 2 (100 мп) 3 (60 мл) 54,5+0,48

20,45+0,16

20) 3+0,20

2, 8+О, 26

1,4500, 06

0,5é0,03

7,8+0,06

1671693

Продолжение табл. 13

Группа животных

Показатель

2 Э

Среднесуточный прирост:

965+20

112,6

85 7+13

100

- 885+1

103, 3

7 к контролю

Затраты на 1 кг прироста: кормовых единиц, кг

7. к контролю переваримого протеина, r

Е к контролю

5,6

88,9

6,3

100

6,1

96,8

614 563

96,7 88,7

100

Р <0,05 °

Таблица14

ОПХ "Ермолино"

Колхоз им ° Маршала Жукова

Показатель

Контроль Опыт Контроль Опыт

Количество животных

Продолжительность апробации, дни

Живая масса, кг: в начале опыта

24

80

120

120

257,3

345,6

249,0

346, 1

224,8

279,2

226,0

285,8 в конце опыта

Прирост массы: валовый, к г среднесуточный, г

На 1 кг прироста затрачено:

88,3

735,8

97,1

809+

54,4

611

59,8

674

7,9 7,8

90, 8 100

8,7

100 кормовых единиц, кг

Ж к контролю переварнмого протеина, г

7 к контролю

791

100

900 916

90,9 100

90,6

Р(0,05.

Составитель Т.Полянская

Редактор И.Дербак Техред М.Дидык Корректор И.Эрдейи

Заказ 2803 Тираж 364 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101