Фрагмент нуклеиновой кислоты - зонд для выявления и идентификации флавивирусов, переносимых комарами

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕа1УЬЛИН (1) с 12 П 15! 33 4 МВо, ьИ

ПАТЕНТУЙ@- ТСУ 1 ЩР ;:

ЬИЬЛиОтккд

ОПИСАНИЕ И3ОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМ,К СЮЗДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ЛО ИЗОИРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ННТ СССР (21) 4665914/13 (22) 23.03 89 (46) 23. 09.91. Бюл, Н 35 (71) Новосибирский институт биоорганической химии СО АН СССР (72) В,А.Шаманин, 8. И ° Злобин и А,Г.Плетнев (53) 575,224.2:577.2(048) (088.8) (54) ФРАГМЕНТ НУКЛЕИНОВЪ|Х КИСЛОТ

ЗОН/1 gfi8 BblS ВЛЕНИЧ И ИДЕНТИФИКАЦИИ

ФЛАВИВИРУСОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии, к получению генно-инженерным путем эффективных зондов,- используемых в эпидемиологии и вирусологии.для выявления и идентификации

Изобретение относится к био-.ехнологии, а именно к фрагментам нуклеиновых кислот (НК), и может быть использовано в эпидемиологии, вирусологии для выявления и идентификации вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), . вируса Западного Нила (ВЗН), вируса энцефалита долины Мюррей (ЭЦМ) и вируса э,цефалита Сен-Луи (ЭСЛ).

Созданы простые и безопасные в получении, воспроизводимые по результатам тестирования зонды для выявления и идентификации ВКЭ, ВЗН, ЭЦМ и ЭСЛ, которые значительно облегчают задачу по получению коммерчески:, тест- наборов для выявления и идентифи ка ции фга ви ви русов.

ÄSUÄÄ 1678835 А а

2 флавивирусов, Предложены простые и безопасные в получении наборы фрагментов нуклеиновых кислот длиной в 18 нуклеотидов, отличающихся один 0Т другого точечными заменами, соответствующими точечным заменам в консер, вативномм районе белка пВ 1 хара ктерными для определенного вируса. Эти фрагменты НК имеют следующие последовательности:

5 -dGCACGTTCGGCAGCACCA-3 для вируса клещевого энцефалита,,5 -dGCAACTTCTGCAGCACCA-3 для вируса

Западного Нила,,5 -dGCAGCTCCTACAACACCA-3 для вируса .энцефалита долины Мюррей;

5 -dACAGCTCCTGCAACACCA-3 для вируса энцефалита Сен-Луи. 3 табл.

Фрагмент НК представляет собой дезоксиолигонуклеотид длиной 18 звеньев, который синтезируют химическим методом с использованием в качестве исходных компонентов модифицированных (защищенных) дезоксиолигонуклеотидов. Фрагмент НК имеет следующую . нуклеотидную последовательность:

5 - dGCAGCTCCTACAACACCA-3

Этот фрагмент для выявления и идентифика ции Э 1М сконструирован на основе анализа известных нуклеотидных последовательностей геномов для ря да эталонных флавивирусов. При этом в районе гена белка nS вьявлен кон1 сервативный для всех расшифрованных з 16788 флавивирусов участок, состоящий иэ

18 нуклеотидов, который у любых двух

Флавивирусов отличается не менее, чем двумя точечными нуклеотидными заменами, и имеет следующую нуклео5 тидную последовательность у разных вирусов: BK3 (5 -3 ) UGGUGCUGCCGAACGUGC; ,ВЗН UGGUGCUGCAGAAGUUGC; ,3,gH UGGUGUUGUAGGAGQUGC ,ЭСЛ UGGUGUUGCAGQAGCUGU; где подчеркнуты позиции, отличающиеся от последовательности вируса клещевого энцефалита. Наличие точечных замен на выявленном участке обеспечивает высокую специфичность полученного зонда, комплементарного выявленной последовательности, Все эти фрагменты родственны по 26 нуклеотидному составу и отличаются один от другого несколькими точечными заменами, позволяющими достаточ но точно идентифицировать вирус при гибридизации, 25

Синтезированные фосфитамидным методом предлагаемые Фрагменты нуклеиновых кислот испытаны с целью определения возможности их использования ,в качестве зондов для выявления и ЗО идентификации как отдельных Флавивирусов, та к и Фла ви вирусов, переноси-. мых комарами. Цля испытаний используют штаммы вирусов, полученные из

Госуда рственной коллекции ви русов

Института вирусологии им.,Д, И. Ивановского и, следовательно, отличные от эталонных, полученных за рубежом.

Все испытанные фрагменты позволяют выявлять и идентифицировать соответствующие вирусы.

П р и и е р 1. Синтез дезоксиолиг онуклеотидов - фрагментов НК.

HK синтезируют в количестве 1-10

onYè÷åcêèõ единиц на автоматическом синтезаторе фосфитамидным методом .. используя в ка честве мономеров 5 -О-диметокситритил-N-ацил-3 -(Р-метилдиизопропиламид)фосфаты нуклеозидов,, Чистоту полученных HK проверяют электрофореэом в 20 0-ном денатурируюшем полиакриламидном геле. Все синтезированные фрагменты HK были не менее

8Я-ной чис готы„ Структуру синтезированных фрагментов подтверждают ана,лизом по Максаму-Гилберту, Пример 2. Испытание полученных фрагментов в качестве зондов

35 для выявления и идентификации флавивирусов, Вирусы. В работе используют вирусы, полученные иэ Государственной коллекции вирусов при Институте вирусологии им. Д,И,Ивановского. В ка-. честве вирусного материала используют мозг зараженных мышей. белых беспородных мышей массой 6 - 8 г заражают в мозг 0,03 мл вируссодержащей суспензии,содержащей около 6,0 1р ЛД

Животных забивают при появлении клинических симптомов заболевания на

4-7 сут от момента заражения. Мозг препарируют и хранят при -40 C. В качестве образцов для анализа берут суммарную РНК мозга.

Выделение суммарной PHK мозга.

Суммарную PHK выделяют экстракцией горячим кислым Фенолом (60 С, рН 5,2) в присутствии додецилсульфата натрия (5, 0-1, О мас,/объем) с последующим спиртовым осаждением. Осадок PHK собирают центрифугированием 30 мин при 6000 об/мин. Осадок растворяют в 7,54-ном Формальдегиде - 10 мМ

Фосфата натрия, рН 7, О, и определяют концентрацию РНК спектрофотометрически, принимая 1 о.е, А о=40 мкг

РНК:

Иммобилизация РНК на нитроцеллю= лоэных фильтрах, РНК денатурируют прогревом в 7,54-ном растворе Формальдегида 15 мин при 56 С, эате;-. добавляют раствор 20 >SSC (3„,0 М натрий хлорид — 0,3 М натрий центра . > рН 7,0) до концентрации 10 г ЯБС и образцы PHK наносят на нитроцеплюлозные Фильтры. Фильтры сушат при комнатной температуре 15-30 мин, а затем в вакуумном сушильном шкафу ч. при 80 С.

Мечение олигонуклеотидов. Слигонуклеотиды метят с помощью полинуклеотидкиназы Т в присутствии - Р-Дтф (1000 Ки/ммоль) до удельной активности 500-1006 Ки/ммоль олигонуклеотида.

Гибридизация. Нитроцеллюлозные фильтры с иммобилизованными препаратами PHK инкубируют в гибридизационной смеси состава: 6 t SSC, 2,5х раствор Денхарта, 0,54 (масса/объем) ,додецилсульфат натрия, 206 мкг/мл денатурированной и Фрагментированной

ДНК быка при 65 С в течение 1 ч.

Затеи добавляют Р-меченый олигонуклеотид (0,2-9,5 пмоль/мл) и гибрири-

)- Д 7

Обозначение

Ви рус

ВКЭ

ОГЛ

Киасанурская лесная болезнь

Негиши

КЛБ

Нег

Лак

Лангат

Повассан

Пов

Шотпа кдс ки и э н цефаi oèèåëèr овец

ШЭО зуют 6 18 ч при 45 С. Радиоактивность, связавшуюся с фильтрами, выя вля ют ра диоа втог рафи ей на ректг еновскую пленку с усиливающим экраном или просчетом радиоактивности на жидкостном сцинтилляционном счетчике, Положитель«ыми принимались сигналы, превышающие уровень фона огрицательного контроля в 2-3 раза.

В табл.1 приведены флавивирусы, и=.пользованные в экспериментах по гибридизации. Результаты представ, лен::.I в табл,2, Как видно из резуль-. татов., зонд, комплементарный геномной РНК ВКЭ, реагирует в наибольшей степени с вирусом клещевого энцефалита штамм Софьин. Реакция =-энда с друг:.ми вирусами незначительна и ке превышает,gi (вирус Негиши) о1 уровня реакции с гомологичным вирусс м, Аналогичная высокая специфич,ос» была получена дпя других зондов: 3h -33, который реагировал преимущественно с ВЗН, ЗЦМ-34, который реагиро вал преимущественно с вирусом дол -:.",: Мюррей, СЛЕ-35„ который реагировал преимущественно с вирусом

-".::.:гользование предлагаемого фрагмента к уклеиновых кислот для выяв:><.к,.-,;:.,; идентификации ВКЭ обеспечиа:; .r следующие преимущества: имею...".:еся в настоящее время автоматическ::= "с и;:к";гезаторы опигонуклеотидов позяю-. просто и быстро получать лю-. бые Фоагменты НК длиной до 30-70 ку)а:eor÷äoâ, при получении зонда ис ключа rcR работа с вирусами, ооес печизается возможность полу ения зондов практически в любых необходимых. количестeax., в отличие от моноклональ"- кых антител возможен контроль зонда путем проверки его химической структуры, в отличие от мококлональных антител возможно прогнозирование спе-. цифи: ности зонда, появляется возможность решекия задачи по получению коммер:-,еских тест †набор для выявления и идентификации большого числа

Фла з .с ви русов, 7 имп/ .: : ь

rc3x cooT Bere ьэ кко) . уров(нь гиориди зации с д",„. гиии вирусами варьировалл кезка ительно и ке превышал 5 9 и 6,6 "ь (в .рус Негиш,: . в первом и втором опытах относительно çrалонного штамма ВКЭ.

Формула изобретения

Фрагмент нуклеиновых кислот зонд для выявления и идентификации флавивирусов размером 18 нуклеотидов, кодирующих консервативный „часток белка nSg флавивирусов, синтезированный химически с использованием в качестве мономеров модифицированных защищенных дезоксинуклеозидов, со следующими нуклеотидными последовательностями."

5 -dGCACGTTCGGCAGCACCA — 3 для вируса клещевого энцефалита, 5 -dGCA-АСТТСТССАССАССА-3 для вируса

Западкого Нила .

5 -аССАССТССТАСААСАЖСА-3 для вируса

"-нцефалита долины Мюррей

5 -dACAGCTCCTGCAACACCA-3 для вируса энцефалита Сен-Луи.

Табли ца 1

Комплекс клещевого энцефалита

Ви рус клещевого энцеФалита, шарами

Софьин

Омская геморрагическая лихорадка

Высок. !6 воспроизводииость предла гаемо"o метода иллюстрируют данные

r-8áë„3, где представлены резу:::.ьтаты повторных экспериментов с двумя *:-.:pe а ратами зонда, Оба препа рата высокоспецис:;;,. о реагируют с ВКЭ с близки; .;:ч;:::.ем гибридизации (3758 и

Вирус Западного

Нила

Энцефалит долины

Июррей

83Н

Подгруппа японского энцефалита

1678835

Продолжение табл. 1

Энцефалит Сен-Луи

ЭСЛ

5 Контроль"

О 9

Вирус японского энцефалита

У ровен ь гибриди за ции ука за н в процентах относительно ВКЭ. "Контроль - PHK нормального мозга

1О,мыши.

ВЯЭ

Подгруппа Денге.,Вирус Денге::.2:

Ден

° »«п к wì. Еп °

Таблица 3

Табли ца 2

Гибридизация, имп/мин (3), по опыту

Вирус (5

Вирус

ВК3

0f J1

Комплекс

КЛ6

Нег

Лан

Пов

Подгруппа

ВЭН

ЭДИ

СЛЕ

ВЯЭ японского энцефалита

g0 Контроль""

1,2

1 5

1,2

33 (0,9) 42 (1 г) Ф

Гибридизация приведена в количестве радиоактивности (имп/мин) и в

З5 i.ïðoцентах относительно ВКЭ.

""Контроль - РНК нормального мозга мыши.

Подгруппа Денге

Ден

Составитель E.Êóçíåöoâà

Редактор H. Козлова Техред д,олийнык Корректор Н.Ревская

За каз 3990 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. Й/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,)03

ВКЗ

ОГЛ

КЛБ

Нег

Лан

Пов

ШЭО клещевого эн4ефалита

2 0

1 0

5,9

1,9

2,1

2,2

3758 (100) 77 (2 О) 37 (1,0) 222 (5,9) (1,9) 80 (2,1) 83 (2,2) 3533 (100)

95 (2,7)

35 (1,0)

233 (6,6)

48 (1,4)

74 (2, 1)

107 (3,0)