Способ получения никотинамидадениндинуклеотида (над)

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к способу получения никотинамидадениндинуклеотида (НАД). Цель изобретения - повышение выхода НАД и сокращение продолжительности процесса Культуру Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872 выращивают на первой стадии на питательной среде при дробном внесении источников азота и фосфора Поверхностно-активное вещество вносят в количестве, составляющем 5-7% от количества биомассы. На стадии биосинтеза после введения в среду предшественников НАД культивирование осуществляют при рН 6,5- 7,0 до достижения максимального количества в среде целевого продукта. Выход НАД 5,7-6,5 мг/мл. Продолжительность процесса 60-72 ч

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

21) 4724460/13 (22) 02,07.89 (46) 23.11.91, Бюл. ¹ 43 (71) Институт биохимии им. А.Н, Баха и Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энэимологии (72) Н.M. Баздырева, B.ß. Быховский, А.П.

Баранаускайте, P.Ê. Вайткявичюс и А.К.

Вайткявичюс (53) 577.15(088,8) (56) Патент Франции ¹ 1560257, кл. С 12 P 19/36, опублик, 1969. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИКОТИНАМИДАДЕ Н ИНДИНУКЛ ЕОТИДА (НАД) (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения никотиИзобретение относится к биотехнологии, к области получения биологически активных веществ с помощью микроорганизмов.

Целью изобретения является повышение выхода НАД и сокращение продолжительности процесса.

Процесс получения НАД методом глубинной ферментации можно рассматривать как двухстадийный. На первой стадии происходит накопление биомассы, а на второй, которая начинается после внесения в среду

ПАВ и предшественников, размножение культуры прекращается и происходит синтез НАД. В качестве продуцента используют культуру Brevibacterium ammoniagenes

АТСС 6872, которую выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, магния, кальция, стимуляторы

„„ Ы„„1693057 А1 (st)s С 12 Р 19/36//(С 12 P 19/36, С 12 R 1:13) намидадениндинуклеотида (НАД). Цель изобретения — повышение выхода НАД и сокращение продолжительности процесса.

Культуру Brevibacterium ammoniagenes

АТСС 6872 выращивают на первой стадии на питательной среде при дробном внесении источников азота и фосфора. Поверхностно-активное вещество вносят в количестве, составляющем 5-7% от количества биомассы. На стадии биосинтеза после введения в среду предшественников НАД культивирование осуществляют при рН 6,5—

7,0 до достижения максимального количества в среде целевого продукта. Выход НАД

5,7 — 6,5 мг/мл. Продолжительность процесса 60-72 ч, роста, При этом источники углерода и азота вносят дробно по мере их исчерпания в пи- в тательной среде. Культивирование ведут до О накопления биомассы не менее 12 мг/мл (по сухому весу), после чего вносят ПАВ и предшественники биосинтеэа НАД. ПАВ вносят в количестве, составляющем 5-7% от количества биомассы. Было установлено, что выход НАД в сильной степени зависит от, 4 соотношения ПАВ и биомассы. Отклонение от указанного интервала приводит к резкому снижению выхода НАД. Дальнейшее культивирование ведут для биосин1еэа

НАД, поддерживая рН в среде в пределах

6,5 — 7,0, в течение 36 — 42 ч до достижения максимального количества НАД в среде.

Вне укаэанного интервала рН выход НАД значительно ниже. Культивирование в предлагаемых условиях позволяет стабильно

1693057

Концентрация биомассы составляет к этому времени 18 мг/мл, поэтому ЦПХ вносят в количестве 1,26 Mr/ìë, что соответствует

7;0% от количества биомассы, Культивирование продолжают в течение еще 40 ч и при этом выход НАД достигает 6,5 мг/мл.

Пример 4. Способ осуществляют согласно примеру 1, но исходное содержание глюкозы в питательной среде составляет 7%, а мочевины — 0,45%. Через 30 ч роста

10 в среду вносят оставшееся количество глюкозы и мочевины (3 и 0,15% соответственно), никотиновую кислоту и аденозин по 2 мг/мл и цетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ) в количестве 0,9 мг/мл, Это количество ЦТАБ выбрано, исходя из того, что в момент его внесения концентрация биомассы в среде была 17 мг/мл. Культивирование продолжают еще 42 ч и получают НАД 6,2 мг/мл.

Таким образом, способ позволяет увеличить выход НАД на 185 — 225% и сократить

20 динуклеотида (HA4, предусматривающий стадию культивирования продуцента

BrevibacterIum ammoniagenes ATCC 6872 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, магния, кальция, и стадию биосинтеза НАД в присутствии поверхностно-активного вещества и предшественников НАД, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода НАД и сокращения продолжительности процесса, источники углерода и азота на стадии культивирования вносят дробно по мере исчерпания их в питательной среде и культивирование ведут до накопления биомассы в количестве 12-18 мг/мл среды, а биосинтез НАД осуществляют при рН 6,5 — 7,0 и содержании поверхностно-активного вещества в среде 5 — 7% от количества накопленной биомассы.

Составитель О.Скородумова

Редактор О,Юрковецкая Техред М.Моргентал Корректор Э.Лончакова

Заказ 4052 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 получать высокий выход НАД (5,7 — 6,5 мг/мл), Пример 1, Культуру Brevibacterium

ammoniagenes АТСС 6872 выращивают при

g8 — 32 С в аэробных условиях на питательной среде следующего состава, %: глюкоза

10, КН2Р04 1; К2НРО< 1; MgSOq 7Н20 1;

CaCIz 0,01; дрожжевой экстракт 1, мочевина

0,6; биотин 3 мкг % Глюкозу, мочевину и биотин в виде водных растворов стерилизуют по.отделы асти и вносят в среду перед посевом, Для посева используют 10% жидкого инокулята, полученного при выращивании культуры на среде, содержащей, %: глюкоза 2; пептон 1; дрожжевой экстракт 1;

NaCi 0,3; биотин 3 мкг%. Через 24 ч роста вносят в культуральную жидкость цетилпиридинийхлорид(ЦПХ) в количестве 1 мг/мл, никотинамид и аденин по 2 мг/мл, Культивирование продолжают еще 72 ч для достижения максимального выхода НАД, составляющего 2 мг/мл, Пример 2. Способ осуществляют согласно примеру 1, но перед посевом вносят все количество биотина (3 мкг%) и половину заданного количества глюкозы и мочевины (5 и 0,3% соответственно), При выращивании продуцента по мере исчерпания глюкозы в питательной среде добавляют остальное количество глюкозы и мочевины в два приема (через 12 и 20 ч от начала культивирования), После 24 ч роста биомасса достигла 15 мг/мл (по сухому весу), В это время вносят ЦПХ s количестве

0,75 мг/мл, что соответствует 5,0% от количества биомассы, затем добавляют аденин и никотинамид по 2 мг/мл каждого. Культивирование продолжают в течение еще 36 ч, поддерживая рН в среде в интервале 6,5—

7,0 с помощью 10%-ного NaOH или 10%-ного NH40H, Выход НАД достигает 5,7 мг/мл, Пример 3, Способ осуществляют согласно примеру 1, но ЦПХ и предшественники вносят после 30 ч роста продуцента, время процесса с 96 до 60 — 72 ч.

Формула изобретения

25 Способ получения никотинамидаденин