Способ приготовления эритроцитарного диагностикума для иммуноанализа

 

Изобретение относится к области иммунобиотехнологии. а конкретно к инженерной иммунохимии, и может быть использовано в производстве иммунодиагностических тест-систем для определения антигенов и антител. Целью изобретения является повышение чувствительности иммуноаналиэа. Поставленную цель достигают путем ковалентной иммобилизации аналит-специфичных иммунореагентов на эритроцитах, активированных мета-периодатом натрия в присутствии высокомолекулярного декстрана. Это позволяет увеличить чувствительность определения антигена и антител в 8-16 раз по сравнению с известными способами. 2 табл. СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

<я)з G 01 N 33/556

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

rlo изОБРетениям и ОткРытиям

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ V

Ф

О

О (21) 4758670/13 (22) 14.08.89 (46) 07.01.92, Бюл. М 1 (71) Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения АН СССР (72) Д, Ю.Плаксин (53) 579.861(088.8) (56) 1. Coombs R.R.À. Assays utilizing red cells

as markers. — Immunoassays for the 80 /Ed.

А.ЧоИег. MTP Press, Lancaster, 1981, р, 1734.

2. Плаксин Д.Ю. и др, Диагностическая тест-система для выявления менингококкового антигена методом эритроиммуноадсорбции и стандартных вариантах РНГА и

РПГА. Журн. микробиол„1986. М 9, с. 82 — 86.

3. Asslmeh S.N.. Johnson P.М. А

haemagglutinatlon method for detection of

rheumatoid factor using preserved erytrocytes

covalently coated with human Ig G. — Immunol.

meth., 1980, v. 34, М 3, р. 205-215, Изобретение относится к области иммунобиотехнологии, а именно к инженерной иммунохимии. и может быть использовано в производстве иммунодиагностических тест-систем для определения антигенов и антител.

Известны иммуноаналитические методы, которые основаны на применении стереоспецифичных определяемому лиганду афинных реагентов. меченных эритроцитами (реакции непрямой и пассивной гемагглютинации — РНГА и РПГА, зритроиммуноадсорбция — ЭрИА (1) и (2), Ковалентная иммобилизация иммунореагентов на эритроцитах позволяет

„,!Ж„„1704090 А1 (54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ИММУНОАНАЛИЗА (57) Изобретение относится к области иммунобиотехнологии, а конкретно к инженерной иммунохимии. и может быть использовано в производстве иммунодивгностических тест-систем для определения антигенов и антител. Целью изобретения является повышение чувствительности иммуноаналиэа. Поставленную цель достигают путем ковалентной иммобилизации аналит-специфичных иммунореагентов на эритроцитах, активированных мета-периодатом натрия в присутствии высокомолекулярного декстрана. Это позволяет увеличить чувствительность определения антигена и антител в 8-16 раэ по сравнению с известными способами. 2 табл. получать высокоактивные и стабильные зритроцитарные диагностикумы. Наиболее эффективными являются двухэтапные методы конъюгирования, предполагающие предварительную активацию эритроцитов (! этап) с последующей иммобилизацией на их поверхности интактных антигенов. антител и других иммунореактивных соединений (tl этап).

Двухэтапные методы гарантируют сокранность функциональной активности меченых эритроцитами иммунореагентов.

Активация может осуществляться путем прямой химической модификации пептидных или углеводных групп мембраны зрит1704090 роцитов в реакционноспособные группы, либо внедрением экзогенных реактивных ðónn в процессе обработки эритроцитов гомо- и гетеробифункциональными реагентами. В известных способах избирательно активируется либо пептидные (чаще первичные аинные), либо углеводные (чаще гидроуксильные) группы мембраны эритроцитов. Соответственно этому антигены и антитела иммобилизируются либо на белковых порциях интегральных и периферических гликопротеинов, либо на полисахаридах гликокаликса активированной поверхности эритроцитов. Поэтому известные способы не позволяют ковалентно связывать специфичные аналиту иммунореагенты на 100 теоретически функционально активной в отношении химической модификации площади мембраны эритроцитов, т.е. достигать максимально возможной плотности их ковапентной иммобилизации, Чувствительность иммуноаналитических методов с эритроцитарными диагностикумами прямым образом зависит от плотности иммобилизации специфичных аналиту иммунореагентов на поверхности эритроцитов и является теоретически максимальной при максимальной плотности их иммобилизации.

Наиболее близким к предлагаемому является способ приготовления эритроцитарных диагностикумов для иммуноанализа, заключающийся в следующем: 50 взвесь форл1эпинизированнь|х эритроцитов барана обрабатывают 0,001 М мета-периодатом натрия в 0,02 М ацетатном буфере рН 4,9 при+ 4 С в течение 30 мин. Активированные эритроциты отмывают 0,05 M фосфатным пуф=-„зм (ФБР) рН 8,5, и используют для кэнъюгирования с иммуногпсбупином G человека. 1 ил1муноглобулин G (l0 мг/мл) в

ФБР инкубируют с активированными эритроцитами 2 ч при 22 С, после чего добавляют борогидрид натрия до конечной концентрации 0,01 и инкубируют еще 1 ч при+ 4 j а темноте. Готовый эритроцитарный диагностикум (иммуноглобулин G,ìeченный эритроцитами) используют (после отмывки забуферными фосфатэми (0.15 M растоором хлорида натрия рН 7,2, ЭФР в

РПГП для определения ревматоидного фактора (3). !

1ьвестный способ основан на прямой химической модификации парных гидроксильных групп гексозных и пентозных колец мембранных углеводов эритроцитов за счет их окисления анионами мета-периодата в реактивные альдегидные группы. Koasпентная связь образуется в виде оснований

Шиффра с участием альдегидных групп активированных полисахаридов эритроцитов и первичных аминогрупп иммобилизуемых

IgG с последующей стабилизацией в алкиламинные связи восстановлением борогидридом натрия. IgG ковалентно связываются на полисахаридах гликокаликса, но не на белках мембраны активированных эритроцитов. В результате IgG иммобилиэируются с немаксимальной плотностью, так как избирательный характер ковалентного связывания не позволяет конъюгировать их с

100 (, теоретической площади мембраны эритроцитов.

Недостатком известного способа является низкая чувствительность иммуноанвлиза с приготовленным диагностикумом, которая является следствием немаксимальной плотности иммобилизации аналит-специфичного иммунореагента (IgG) на поверхности зритроцитарной метки. Кроме того, при обработке эритроцитов очень низкой концентрацией мета-периодата натрия (0,001 M) происходит неполная активация полисахаридов гликокаликса.

В то же время прототип не допускает увеличения концентрации анионов метапериодата, так как в более высоких концентрациях он активно окисляет гемовые пигменты. что ведет к обесцвечиванию активируемых эритроцитов (при этом существенно снижается контрастность метки).

Целью изобретения является повышение чувствительности иммуноанапиза.

Поставленная цель достигается путем ковалентной иммобилизации аналит-специфичных иммунореагентов на эритроцитах, активированных мета-периодатом натрия в смеси с высокомолекулярным декстраном.

При активации, которую проводят в щелочных условиях (рН 9,6) при комнатной температуре (22 С) в течение 20 мин. происходит одноврел ечная модификация как полисахаридов гликокаликса эритроцитов, так и находящихся в растворе молекул декстрана. Активированный высокомолекулярный декстран представляет собой образующийся In situ в процессе активации полиьалентный гомо-полифункциональный реагент (по характеру реактивных группполиальдегид), рН активации coot cтствуат рН конъюгирования. поэтому молекулы альдегиддекстрана за время активации ковалентно связываются с аминогруппами интегральных и периферических белков мембраны зритроцитов, экспонируя в раствор большое количество свободных реактивных альдегидных групп.

Таким образом. активированной становится максимум (100 (,) георетической пло1704090 щади поверхности эритроцитов. Ковалентное связывание активированного декстрана создает выгодные пространственные условия для дальнейшей иммобилизации лиганд-специфичных иммунореагентов на 5 некотором удалении от поверхности мембраны эритроцитов (спейсерный эффект), что увеличивает степень свободы их реагирования с определяемыми лигандами, Кроме того. отличие от известного способа состоит в 10 применении в 20 раз большей концентрации мета-периодата натрия (0,002 М, а 0.001

М в известном способе, которая обеспечивает более полную активацию мембранных полисахаридов эритроцитов, при этом не 15 наблюдаеся уменьшение их контрастности.

Пример 1. Активация эритроцитов. К

1 мл 50 -ной взвеси формалинизированных эритроцитов барабана в 0,05 M карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) рН 9,6, 20 добавляют 3 мл 10 -ного декстрана т-500 в

КББ и 1 мл 0,1 М раствора мета-периодата натрия (х.ч,). Смесь инкубируют, интенсивно перемешивая встряхиванием 20 мин при

22 С. Активированные эритроциты отмыва- 25 ют центрифугированием 5 раз в КББ.

Иммобилиэация иммунореагентов.

0.5 мл 507(,-ной взвеси активированных эритроцитов смешивают с 2 мг специфич- 30 ного определяемому лиганду иммунореагента в 2 мл КББ. Инкубируют 1 ч при 22 С и постоянном перемешивании и затем, после добавления борогидрида натрия (х.ч.), до конечной концентрации 0,02 еще 1 ч 35 при 4 С в темноте.

Взвесь готового эритроцитарного диагностикума отмывают в ЗФР с 0,05 твина-20 и хранят в том же растворе с

0.02 ь азида натрия. 40

Результаты экспериментального сравнения известного способа представлены в табл. 1.

Пример 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но варьируются условия коньюгации: концентрация декстрана, концентрация периодата, время активации, рН, Чувствительность определения столбнячного анатоксина в ЭрИА с полученными диагностикумами приведена в табл. 2.

Таким образом, чувствительность иммуноанализов с эритроцитарными диагностикумами, приготовленными предлагаемым способом. в 8/16 раз выше чувствительности, достижимой в известном способе.

Кроме того, способ позволяет в 2 раза сократить время приготовления эритроцитарных иммунодиагностикумов— конъюгирование (иммобилизация иммунореагентов на эритроцитах) длится 1 ч против 2 ч в известном способе, и в! 0 раз уменьшить концентрации иммобилизируемых иммунореагентов.

Формула изобретения

Способ приготовления эритроцитарного диагностикума для иммуноанализа, включающий обработку формалинизированных эритроцитов периодатом с последующей инкубацией с иммунореагентом и восстановлением боргидридом натрия, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности иммуноанализа. обработку периодатом проводят при рН 8.5 — 9.6 в присутствии 8-12 об,g декстрана с мол.м.

40 — 500 килодальтон при 20-25 С в течение

10 — 30 мин, при этом периодат используют в концентрации 0.01-0,04 М.

1704090

«5

z о

Р е

Ф

Ф о о о

00 о

Со

1

В

Ф «5

X

CL с

3 3

«о

О о

v о с

tD

И

5 с

ClI

CD о

I

Х

О.

Е

Е

Л о о д

Л с

IФ

Щ

l с««5 а*

Е

CL с

CO о

Ф

«5

z о и

Ф ь

Ф

«5

g 2

Е

CL с

5 с

z о Д

Ф

X o

«

Y о <5о а

О Д 5 е Д с-05В«5 i«S

2 с- З

z z оо

z т0

SOP

0 с,< .".

«5

CL

Ф

1 ID вд

S с v е о

5 I»

0 Ф о д

o. m

Ф о е о

S

Iz

«:

<

S с

° 5

Е е с

CL

C о х <

<Т

1 е

5 а, о z

=5сz а л-е о а Е

5 с с

Е C

ОО ш

< счо -о сч с с

ou z шш

coco z ооо с сч сч с" с с

Е Е с

ОО Е шш

C«l IC<

- ЫЪ

e) cv с с

Е с

ОО q

ШШ (р< z

-оо с0 «

00с с х оое

mz3 сО

h o д д с So

<с 5 ,оФО

z а с о Е.С

<

У

<о

С Ф о z

<0 о ф и

C о

4I с

<5 о д

< х

Ю о х

<<) Ф

<е) с л< ох„ аао

Ф с

lO e с с <о

3 о с о

О о. о м

X

IZ

Ф х

З

Z л

X а

Ol

X

l» к

X е а о

IX о

CL х

«5 о

Z з в в

Щ

2i

Z о с с

IS

Z ъ

I5 т

Iz

Е

l» щ х ае в

Ф

М о

CL

Ф о д о л

< Е

Е

Е 5

S х

z z

Л 5 ьv z

X m

:Г а Z о

Ф

< ш

< ш

С

Ф

X е о ® х с

5 Ф х о х

Z I-<

Ф аФх д о

Еос

30о р < д о

ОФХ

5 0 х Ф

bzX оде

O.ID Ф ова

ФО а О

0 5Ф

S*Е

l" oo

«5 " b

o a.z де*

5 хе

ID е д 1.

C д Z

S л Е

<»

<««

55а

h g) Z е с

C zа с*е р Е

h cLo

*5" с лдпя одо ое л е с

o ciao

ZeC о. v

Е с

Е »

Ф 4 Ф

Ф Ф Ф

1704090

Таблица 2

Составитель Д.Папковский

Техред М.Моргентал Корректор С,Шевкун

Редактор Н.Бобкова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

Заказ 60 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35. Раушская наб.. 4/5