Рекомбинантная плазмидная днк pga9, кодирующая синтез белка, обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека первого типа, способ ее конструирования , и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент белка, обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека первого типа

 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии. Цель изобретения состоит в повышении выхода целевого продукта. В плазмиду pG30 введен EcoW-ЕсоЖ-фрагмент ДНК плазмиды рАК25, содержащий раг-локус, обеспечивающий стабильное наследование гибридной плазмиды pGA9, которая имеет размер 7,9 т.п.н. Плазмида pGAQ имеет уникальные сайты рестрикции: BamHI, Sail, определяет устойчивость к ампициллину и канамицину, неконьюгативна, кодирует синтез белка, обладающего .антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека первого типа ( ВИЧ 1). Плазмиду- pGA9 вводят в штамм Е.соИ НВ101 с помощью транс«|>&ормации, получают штамм, обеспечивающий синтез белка в количестве 650-750 мкг/мл белка, N-концевая часть которого представлена полноразмерной бета-галактозидазой, а С-конец - Бирусспецифической последовательностью продукта гена gag, обладающего антигенными свойствами ВИЧ 1. 3 с.п.ф-лы.(Лс

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4775380/ i 3 (22) 27.12.89 (46) 30.01.92. Бюл. ¹ 4 (71) Инс итут вирусологии им. Д,И.Ивановского и Институт молекулярной генетики АН

СССР (72) М.M.Ãàðàåâ, А.Ф.Бобков, M.P.Áoáêoâà, E.ВКазеннова и M.Н.Колот (53) 57 .224.2,557.2.048(088,8) (56) Proc. Мат. АсаО Sci USA, 1983, v. 80,. р. 1830-1834.

Авторское свидетельство СССР № 1396605,кл. С 12 N 15/00, 1986. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК

PGA9, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ БЕЛКА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИГЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА

ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО ТИПА, СПОСОБ ЕЕ

КОНСТРУИРОВАНИЯ, И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCkERICHIA C0LI — .ПРОДУЦЕНТ

БЕЛКА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИГЕННЫМИ

СВОЙСТВАМИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО ТИПА

Изобретение относится к медицине и биотехнологии.

Известна рекомбинантная плаэмидная

ДНК pG71, содержащая фрагмент гена gag, кодирующий белок р24, и обеспечивающая синтез в бактериях E.coil гибридного белка, N — концевая часть которого представлена полноразмерной бета-галактоэидаэой, а Сконец — вирусспецифической аминокислотной последовательностью, Основным недостатком pG71 является ее нестабильность в клетках E.coll, вследствие этого при культивировании штамма несущего плазмиду р671 в среде без

»5U 1708848 А1 (Я)5 С 12 N 15/48, 15/70 (57) Изобретение относится к медицине и биотехнологии. Цель изобретения состоит в повышении выхода целевого продукта. В плазмиду pG30 введен EcoR1-Есор-фрагмент ДНК плазмиды рАК25, содержащий раг-локус, обеспечивающий стабильное наследование гибридной плазмиды pGA9, которая имеет размер 7,9 т.п.н. Плаэмида

pGA9 имеет уникальные сайты рестрикции:

Вал. Н1, SaI1. определяет устойчивость к ампициллину и канамицину, нвконъюгативна, кодирует синтез белка, обладающего внтигенными свойствами вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ 1).

Плазмиду- pGA9 вводят в штамм Е.соП

НВ101 с помощью трансформации, получают штамм, обеспечивающий синтез белка в количестве 650 — 750 мкг/мл белка, N-концевая часть которого представлена полноразмерной бета-галактозидазой, а С-конец— вирусспецифической последовательностью продукта гена gag, обладающего антигенными свойствами ВИЧ 1. 3 с.п,ф-лы. использования антибиотика ампициллина, использование которого экономически неоправдано, большая часть клеток теряет плазмиду, а также способность продуцировать гибридный белок, что приводит к резкому снижению выхода конечного продукта.

Известна рекомбинантная плазмида, детерминирующая синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами

ВИЧ 1.

Однако даже в присутствии селективного маркера отмечается высокий уровень нестабильности данной конструкции в клетках бактерий E.coll, что приводит к существен1708848 ному уменьшению выхода конечного продукта — рекомбинантного белка, содер>кащего вирусспецифиче:"кие последовательности, Цель изобретения — повышение уровня синтеза целевого продукта.

Для этого из плаэмиды рАК25 выделяют

Есо>п — фрагмент ДНК, содержащий ген устойчивости к канамицину и раг-участок, определяющий стабильное наследование плазмид Со!Е1-типа, и вводят в состав плазмиды pG30. Полученную плазмиду вводят Б штамм Е.соИ НВ101 с помощью трансформации. Таким образом получают искомый штамм НВ101 pGA9, содержащий стабильно наследуемую плазмиду, обеспечивающую высокий уровень синтеза гибридного белка, N-концевая часть которого представлена полноразмерной бета-галактозидазой, а С-конец — вирусспецифической последовательностью продукта гена gag, обладающего антигенными свойствами ВИЧ 1, Плаэмида имеет размер 7,9 т.п.н., состоит из EcoR1 — фрагмента плазмиды pG30 размером 6,45 т.п,н. с геном бета-лактомазы, гибридным геном бета-галактозидаза— областью ori и EcoR1 — фрагмента плазмиды рК25, размером 1,45 т.п.н., содер>кащаго ген устойчивости к канамицину и раг-участок ColA, уникальные сайты рестрикции

BarnH1, SaI1.

Плаэмида определяет устой сивость кле ток Е.соИ 13101 к ампициллину и канамицину и синтез в них гибридного белка с. вирусспецифическими последовательностями. Плаэмида неконьюгативна, Штамм характеризуется следующил1и признаками.

Морфологичзские признаки. Клетки прямые палочковидной формы 1,2 х 1,6 х 2.0 мкм подвижные с nep!1TpNõèanüными жгутиками, грамотрицательные, неспсрсобраэующие, Культуральные признаки, Клетки хорошо растут на простых питательных средах.

При росте на мясо-пептонном агара колонии гладкие круглые прижаты блестящие серые край ровный мутные.

При росте на жидких средах: мясо-пептон ном бульон с, (=бул ьо е образуют ровную интенсивную муть.

Физико-биохимические признаки, Клетки растут в пределах от 4 дс 45 С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5, В качестве источника углерода используют глюкозу, фруктозу. Не усваивают ацетат. Нитраты восстанавливают до нитритов, Желатину не разжи>кают. Индол не образуют, Уреазная

aKTMBHocTb не обнаруживается, 30

35 дяной б че в течение 3 мин, Полученный лизат центрифугируют (20 ООО g, 30 мин 4 С) и ДНК из супернатанта осаждают равным объемом изопропанола. Образовавшийся осадок собирают центрифугированием (12000 g 20 мин, 2 С) и ресуспендируют в 5 мл 10 мМ трис-HCI (рН 8,0) буфера.

Окончательную очистку плазмидной ДНК проводят методом равновестного центрифугирования в градиенте плотности CsCI c бро,истым этидием, 1 мкг ДНК плазмиды pIJR290 инкубируют с эндонулеазой рестрикции Hind Iil (10 единиц) в буфере, содержащем 50 мМ трисHCI, pH 8,0. 50 мМ NaCi, 10 мМ М9С32,, 1 MM

2-маркаптоэтанола, Реакцию проводят 1 ч при 37 С. Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза.

Препарат индивидуального Hind 1И фрагмента генома ВИЧ I размером 627 н.п. с координат= ìè 631 — 1258 н.п. выделяют из смеси Hind ill фрагментов ДНК плаэмиды

pG71. Выделение индивидуального фрагмента осуществляют методом электроэлюции из 1,5% агарозного геля.

Ссединение смеси фрагментов ДНК плазмиды pUR290 (0,5 мкг) и Hind Ill фрагментов ВИЧ 1 иэ плазмиды pG71 проводят с полтющью ДНК-лигазы фага Т4 (30000 единиц/мл) из расчета 1 мкл фермента на 5 мкг

ДНК в течение 10 ч при 12"С, Устойчивость к антибиотикам. Клетки устойчивы к ампициллину и канамицину.

Пример 1. Конструирование плазмиды pGA9.

5 Фрагмент ДНК, содержащий ген устойчивости к канамицину, и par-участок ColA выделяют из плазмиды рАК25. Для этого рАК25 подвергают гидролиэу рестриктазой

Е,соВ1, инкубируя 20 мкг ДН К рАК25 с 20 ад. l0 фермента в присутствии 50 мМ NaCI, 10 мМ

MgCIg 10 мМ трис-HCI, pH 7,5, 1 мМ ДТТ в течение 2 ч г. ри 37 C с последующим прогреванием при 75 С в течение 15 мин. Далее гидролизованную ДНК разделяют в 0,8%

15 агарозном геле и выделяют нужный фрагмент ДНК, используя бумагу ДЕ 81.

В качестве вектора используют плазмиду pG30, полученную следующим образом.

Клетки бактерий Е.coli НВ101, содержа20 щие плаэмидную ДНК р JR290 выращивают в 200 мл бульона до титра х 10 клеток/мл. Клетки осаждают центрифугированием (5 000 g, 5 мин, 4 С) и ресуспендируют в 35 мл -раствора. содержащего 8% сахаро25 зы, 0,5% тритона Х-100, 50 MM ЗДТА, рН 8,0 и 0 мМ трис-HCI, рН 8,0. Далее добавляют

?.5 мл свежеприготовленного раствора лизсцима "- концентрациеи 10 мг/мл быстро перемашивают и нагревают на кипящей во1708848

Полученную смесь плазмид используют для трансформации клеток Е.coll НВ101.

Трансформацию проводят следующим образом: 0,1 мл суспенэии клеток E.coll

НВ101 вносят в 20 мл питательного L-бульона и выращивают до титра 3 х 10 клетокв мл, Клетки собирают центрифугированием (5 000 g 10 мин 0 С), суспендируют в 10 мл

75 мМ раствора CaClz и выдерживают

30 мин при 0 С. Клетки повторно центрифугируют (5000 g 10 мин 4 С), затем ресуспендируют в 1 мл 75 MM CaCIz (О С) и 100 мкл такой суспензии использу от цля трансформации. Смесь соединенных фраг лентов ДНК инкубируют с компетентными клетками (обработанными CaCIz) в течение

l ч при 0 С и 3 мин при 42 С. После двадцатикратного разбавления L-бульоном трансформированные клетки подращивак,т

1,5 ч и высевают на агаризованну о среду L-бульона с ампициллином (30 мкг/мл).

Плазмидну.о ДНК, выделенную из ампициллин-устойчивых колоний, выросших через

36 ч при 37 С, анализируют с помощью электрофореза, Отбирают плазмидную

ДНК большей чем векторная плазмида молекулярной массы и анализируют ее с помощью фермента Hind Ill. Рекомбинантную плазмиду, содержащую удвоенный Hind ill фраг лент области gag ВИЧ 1 в пря:лой ориентации называют pG30. 1 мкг ДИК pG30 подвергают неполному гидролизу рес риктазой EcoR1 в течение 20 мин при 37 С в инкубационной среде, укаэанной выше.

К 0,2 мкг ДНК pG30, обработанной рестриктазой, добавляют 2 мкг EcoR1фрагмента рАК25, содержащего ген устойчивости к канамицину, и раг-участок

CoiA, 50 единиц, ДНК-лигазы и инкубируют смесь 16 ч при 12 С в присутствии 50 мМ

NaCI, 10 мМ MgCiz, 10 мМ трис-HCi, pH 7,5;

1 мМ ДТТ,5 мМ АТФ, Конечный объем смеси составляет 10 мкл.

К лигирован ному препарату ДН К добавляют 100 мкл компетен-.ных клеток Е.соП

НВ101 и инкубируют, к, к описано выше, после чего клетки оазводят в 20 раз (= бульоном и инкубируют с аэрацией 1 ч при

37 С. Клетки высевают на чашки Петри с

1,50/ -ным 1=агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина и канамицина. Из трансформантов выделяют плазмидную ДНК и используют ее для рестрикционного анализа, Рестрикционный анализ плазмидной

ДНК показывает наличие в них фрагментов, соответствующих Е,coR1-фрагменту рАК25 и pG30, Для окончательного выбора нужной плазмиды проводят анализ способности выбранньх плазмид синтезировать гибрид5

40 нее белки молекулярной массы 165 кД. содержащие вирусспецифические последовательности области дад.

Пример 2. Определение уровня синтеза гибридного белка.

2 мл суспензии клеток Е.coll НВ101, содержащих плазмиду pGA9, выросших в течение ночи из отдельной колонии до концентрации 2 х 10 клеток/мл в L-бульоне., содержащем 30 мкг/м л ампициллина и

100 мкг/мл качамицина, осаждают центрифугированием и ресуспендируют в 200 мкл буфера, содержащего 50 MM трис-HCI, рН

7,8; 2,5 Я, дсдецилсульфата натрия, 10 глицерина, 0,7 меркантоэтанола и 0,1 бромфенолового синего. Полученные препараты кипятят 5 мин на водяной бане и 20 мкл анализируют методом электрофореза.

Лизаты бактерий, содержащих плазмиду

pGA9, содержат дополнительный белок с мол,м. 165 кД. Антигенную активность этого белка определяют с помощью метода иммуноблотинга. Полученный гибридный белок обладает антигенной активностью ВИЧ t.

Уровень синтеза гибридного белка составляет не менее 207» от тотального клеточного белка, т,е. 1 л клеточной суспензии позволяет получить 650-750 мг белка, обладающего антигенными свойствами ВИЧ 1.

Синтеэируемый белок представляет собой гибридный полипептид, состоящий из 1452 аминокислотных остатков (ак), представленных 1023 ак бета-галактозидаэы, 8 ак, кодируемых полилинкерной последовательностью векторной плазмиды

pUR290, 418 ак кодируемых фрагментов

ВИЧ 1 и 3 ак кодируемых полилинкерной последовательностью вектора pUR290.

Таким образом, изобретение позволяет повысить уровень синтеза целевого продукта за счет того, что все клетки в популяции содержат плазмиду, а также снизить себестоимость продукта, так как отпадает необходимость использования антибиотика для стабилизации плазмиды при выращивании штамма-продуцента.

Формула изобретения

1, Рекомбинантная плазмидная ДНК

pGA9, кодирующая синтез белка, обладающего антигенными свойствами вируса иммунодефицита человека первого типа, размером 7,9 т.п.н., содержащая Есойl—

EcoR1 — фрагмент плазмиды pG30 размером

6,45 т.п.н.; EcoR1 — EcoR1 — фрагмент плазмиды рАК25 размером 1,45 т.п.н.; уникальные сайты рестрикции BamH1, Sal1; генетические маркеры; AI — ген устойчивости к ампициллину; Km — ген устойчивости к канамицину; gag-ген, обеспечивающий син1708848

Составитель Т.Забойкина

Техред М.Моргентал Корректор A.Осауленко

Редактор A.Äîëèíè÷

Заказ 403 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 тез гибридного белка размером 1452 ак, состоящего из 1023 ак бета-галактозидазы, 8 ак, кодируемых полилинкерной последовательностью векторной плазмиды pUR290, 418 ак, кодируемых фрагментами гена gag

ВИЧ 1 и 3 ак, кодируемых полилинкером

pUR290.

2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pGA9, заключающийся в том, что выделяют EcoR1-EeoR1— фрагмент ДНК плазмиды рАК25, содержащий ген устойчивости к канамицину и parучасток Со1А, лигируют его с ДН К плазмиды р630, полученной путем гидролиза EcoR1, лигазной смесью трансформируют клетки

Е.соИ НВ101, с помощью рестрикционного

5 анализа и анализа способности определять синтез целевого продукта отбирают клоны, несущие плазмиду р6А9.

3.Штамм бактерий Escherlchla соП ГКВ

10 pGA9-gag — продуцент белка. обладающего антигенными свойствами вируса иммкунодефицита человека первого типа.