Способ генетической трансформации растений

 

Изобретение относится к генетике, биотехнологии и может быть использовано вселекции культивируемых растений. Цель изобретения - увеличение эффективности трансформации. Способ заключается в том, что определенные гены переносят в геном растенмя посредством вектора на основе Ti-плазмиды. содержащей маркерный ген (устойчивость к антибиотику), причем опыление проводят после нанесения плазмидной ДНК в растворе сахарозы, борной кислоты и Са(ЫОз)2, а отбор трансформантов проводят на еелективных средах, в частности среде Кнопа. содержащей канамицин. Способ позволяет быстро и эффективно получать и отбирать трансформанты. Частота трансформации составляет 0.6-1.45%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С 12 N 15/87

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4760883/13 (22) 12.10.89 (46) 30.01.92. Бюч. М 4 (7 1) Институт экологической генетики АН МССР (72) Ю.В.Чесноков, В,К.Бурилков, Н.А.Виконская и А.Б.Король (53) 663.18(088.8) (56) Appl. Microbiol Blotechnol, 1985, v.21, р.336.

Biotechnoiogy апб Ecology of Pollen, l986, р.р. 59-76.

Procid. Net. Acad Sci, 1986, ч.83, р.715720, (54) СПОСОБ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ РАСТЕНИЙ (57) Изобретение относится к генетике, биотехнологии и может быть использовано в

Изобретение относится к генетике, биотехнологии и может быть использовано в селекции культивируемых растений.

Известен способ генетической транс формации растений, включающий проведение микроиньекции чужеродной ДНК в протопласты растений.

Известен также способ, согласно которому экзогеннуа ДНК вводят в протопласты растений методом электропорации.

Однако указанные способы мало пригодны для многих однодбльных растений, в частности злаковых, Применение данных способов затруднено тем, что для злаковых обычно сложно получить растение из протопластов.

Известен также способ генетической трансформации, предусматривающий использование бактерий Agrobacterium,., ЯЦ,, 1708849 А1 селекции культивирчемых растений. Цель изобретения — увеличение эффективности трансформации. Способ заключается в том, что определенные гены переносят в геном растения посредством вектора на основе

Ti-плазмидь., содержащей маркерный ген (устойчивость к антибиотику). причем опыление проводят после нанесения плазмидной ДНК в растворе сахарозы, борной кислоты и Са(ИОз)2, а отбор трансформантов проводят на селективных средах, в частности среде Кно па, содержащей канамицин. Способ позволяет быстро и эффективно получать и отбирать трансформанты. Частота трансформации составляет

0,6 — 1,45 .

tumefaciens для переноса генов с помощью векторов, основанных на Ti-плазмиде.

° агеаЪ

Такой способ практически неприемлем для однодольных растений, поскольку

Алове1ас!епэ не обладает вирулентностью по отношению к ним.

Ж

Известен способ генетической транс- О© формации растений, например табака, за- Ф ключающийся в том, что пыльцу О проращивают на среде, содержащей экзогенную ДНК е аиде Tl-пааамиды. Пророс- ) а шую пыльцу наносят на рыльце пестика.

Затем клетки ткани анализируют на нопалинсинтетазную активность, на основе чего судят о генетической трансформации.

Известен также способ генетической трансформации растений, согласно которому рыльца растений инкубируют в присутствии ДНК плазмиды, содержащей ген устойчивости к антибиотикам, в частности к

1708849 канамицину, Методом электропорации вводят плазмидную ДНК в пыльцевые зерна растений, затем растение опыляют и селекцию трансформантов в полученном потомстве проводят по устойчивости к канамицину.

Однако известные способы неприемлемы для растений, у которых жизнеспособность пыльцы в значительной степени зависит от времени хранения, например кукурузы и других злаковых.

Наиболее близким к предлагаемому является способ, заключающийся в том, что с растений кукурузы собирают пыльцу, готовят пасту из смеси: пыльца, раствор сахарозы, экзогенная ДНК, Экэогенную ДНК выделяют иэ линий кукурузы, содержащих в себе маркерные гены окраски эпидермиса семян. Приготовленную смесь наносят на рыльца пестиков растений. Частоту трансформации оценивают по частоте появления на початках окрашенных зерен, Недостатки этого способа заключаются в том, что трансформация носит невекторный характер; отсутствует легко селектируемый мар-. керный ген, чаличие которого позволило бы быстро и эффективно отобрать трансформанты; отсутствует возможность получения достаточного количества семян, необходимых для анализа, ввиду их слабой эавязываемости.

Цель изобретения — увеличение эффективности трансформации, Способ включает обработку рыльца пестика растений смесью пыльцы и экзогенной ДНК в растворе сахарозы, использование вектора на основе Т1-плазмид., например, серии PGV, содержащих маркерный ген устойчивости к антибиотикам, при этом плазмиду смешивают с раствором сахароэы, борной кислотой и Са(МОз)2, причем смесь сразу же наносят на рыльце пестика и немедленно производят опыление, а отбор трансформированных растений проводят путем проращивания на среде Кнопа, г/л:

Са(ИОз)г ОЯ; KHzP0< 0,2; М90п х 7Н20 0,2;

КИОз 0,2; РеРО4 0,1, содержащей канамицин в концентрации 250-400 мкг/мл.

Готовят смеси следующего состава: 0,40,5 М сахарозы; 0,017-0,020% борной кислоты; 0,038-0,042% Са(НОз)2; рН 5.5-58;

40-100 мкг/мл плазмидной ДНК(например, РОЧ1501), содержащей ген устойчивости к канамицину.

П р и и е р 1, В смесь, включающую 0,4

М сахарозы, 0,018% борной кислоты, 0,04%

Са(МОз)г, (рН 5,5-5,8), непосредственно пе5

40 ред нанесением на рыльце пестиков вводят плазмйдную ДХ К {PG V 1501), содержащую ген устойчивости к канамицину, в количестве 70 мкг/мл. На каждый початок кукурузы линии Из (предварительно изолированный) сразу же наносят 200 мкл смеси, после чего немедленно опыляют его же пыльцой. После созревания семена проращивают на среде

Кнопа. Затем 1-2-дневные проростки переносят на среду Кнопа, содержащую канамицин в концентрации 400 мкг/мл. Через

10-14 сут. растения, прошедшие отбор на этой среде, переносят в грунт в условиях климокамеры (20 люкс — 16 ч, температура днем 28 1 C, ночи 19 1 С) и доращивают для пересадки в открытый грунт.

Часть растений на стадии проростков анализируют методом блотгибридизации по

Саузерну для доказательства интеграции в геном растения интересующего гена.

Частота трансформантов, полученных при использовании предлагаемого способа, составляет около 0,6%.

Пример 2, B смесь, содержащую 0,45

М сахароэы, 0,017% борной кислоты, 0,038% Са(ИОз)2, рН 5,5-5,8, вносят плазмидную ДНК, содержащую ген устойчивости к канамицину. Смесь наносят на рыльце пестика томата и немедленно опыляют. Созревшие семена проращивают на среде

Кнопа с канамицином (100 мкг/мл). При использовании сорта томата "Факел" частота трансформации составляет 1,45%.

B прототипе на один ген частота трансформации составляет около 0,3%, т,е. полученная в результате использования предлагаемого способа частота трансформации в 2 раза превосходит полученную в известном способе. Анализ трансформантов методом блот-гибридизации по Сауэерну показал, что ген устойчивости к канамицину встроился в растительный геном.

Таким образом, оценка следующих поколений предполагаемых трансформантов отбором на селективных средах и методом блот-гибридизации показывает эффективность данного метода трансформации.

Способ позволяет быстро и эффективно получать и отбирать трансформанты. Способ позволяет также сократить время между сбором пыльцы, приготовлением смеси. и опылением растений, что не вызывает ощутимого воздействия физических факторов и нуклеаз на ДН К, пыльцу и пыльцевые трубки (механические разрывы, деградация и др.).

Способ может быть использован для целенаправленной трансформации генома растений.

1708849

Формула изобретения

Составитель В,Бурилков

Редактор Л.Павлова Техред М.Моргентал КоРРектоР М,Щароши

Заказ 403 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.; 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент *, г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Способ генетической трансформации растений, включающий смешивание экзогенной ДНКс пыльцой растения, нанесение полученной смеси на рыльце пестика в растворе сахарозы, отбор трансгенных растений, отличающийся тем, что, с целью увеличения эффективности трансформации, в качестве экзогенной ДНК используют вектор на основе Ti-плазмиды, несущей устойчивость к антибиотикам и встроенный ген, смешиваниес пыльцой проводят в растворе 0,4-0,5 М сахарозы, 0,017-0,020$

5 борной кислоты, 0,038-0,042Я, Са(МОф, рН

5,5-5,8, после нанесения на рыльце пестика немедленно проводят опыление, а отбор трансгенных растений проводят путем проращивания на среде Кнопа, содержащей ка10 намицин в концентрации 250-400 мкгlмл.

Способ генетической трансформации растений Способ генетической трансформации растений Способ генетической трансформации растений 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к получению трансгенных растений, в частности трансгенных растений кукурузы, и может быть использовано в сельском хозяйстве

Изобретение относится к дендримерным полимерным конъюгатам, содержащим по крайней мере один плотный звездчатый полимер, ассоциированный по крайней мере с одной единицей по крайней мере одного биологического модификатора ответа

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины, иммунологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности и молекулярной фармакологии

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано в биотехнологической промышленности

Изобретение относится к способу детектирования и измерения одного или более аналитов в образце

Изобретение относится к биотехнологии

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в медицине и в фармацевтической промышленности
Наверх