Анализ аналитов с использованием частиц в качестве метки

Изобретение относится к способу детектирования и измерения одного или более аналитов в образце. Способ включает связывание одного или более аналитов в образце со светорассеивающей частицей; освещение любой частицы, связанной с аналитами, светом при условиях, которые производят рассеянный свет от частицы и при которых свет, рассеянный от одной или более частиц, может быть обнаружен человеческим глазом с увеличением менее чем в 500 раз и без электронного усиления. В качестве меры присутствия таких аналитов способ также включает детектирование света, рассеянного любыми такими частицами при определенных условиях. Технический результат - изобретение обеспечивает более легкий в осуществлении, более чувствительный и более универсальный способ обнаружения аналитов. 4 с. и 51 з.п. ф-лы, 30 ил., 22 табл.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу детектирования и измерения одного или более аналитов в образце. Способ основан на использовании некоторых частиц специфического состава, размера и формы и на детектировании и/или измерении одного или более свойств светорассеяния частицы. Детектирование и/или измерение свойств светорассеяния частиц коррелируется с присутствием и/или количеством, или с отсутствием одного или более аналитов в образце. Настоящее изобретение может применяться в той или другой форме для того, чтобы детектировать и измерять один или более аналитов в образце.

Предшествующий уровень техники

Ниже приводится описание существующих методов детектирования. Приводится также краткий обзор соответствующей области науки, благодаря которому читатель может иметь более четкое представление о заявленном изобретении. При этом не следует считать, что каждая из цитируемых предшествующих работ является прототипом данной заявки. Цитируемая литература вводится в настоящее описание посредством ссылки для того, чтобы не описывать вновь общие процедуры и методы, которые относятся к данной области техники и которые используются для осуществления настоящего изобретения. В частности, заявитель вводит те разделы цитируемых источников, которые относятся к общим методам, основанным на использовании "пары связывания", и к методам измерения рассеяния света, используемым в настоящей заявке.

Чувствительные анализы аналитов

Техника, основанная на использовании "пары связывания" (называемой также парой "лиганд-рецептор", связывающейся по принципу молекулярного распознавания, и т.п.), играет важную роль во многих применениях биомедицинских анализов, а также имеет большое значение в областях науки об окружающей среде, в ветеринарии, в фармацевтических исследованиях, в области контроля за качеством пищевых продуктов и воды и т.п. Для детекции аналитов, присутствующих в низких концентрациях (менее чем около 1 пикомоль на объем исследуемого образца), часто используют флюоресцентные, люминесцентные, хемилюминесцентные или электрохемилюминесцентные метки и методы их детекции.

Для детекции низких концентраций аналитов в целях диагностики хороший эффект дают широко используемые методы хемилюминесценции и электрохемилюминесценции. Эти методы хемилюминесценции и электрохемилюминесценции позволяют обнаруживать низкие концентрации аналитов путем амплификации ряда люминесцентных молекул или фотон-генерирующих многократных событий, что приводит затем к "усилению сигнала", позволяя обнаруживать аналиты низкой концентрации.

Кроме того, метод с использованием полимеразной цепной реакции (PCR) и другие подобные методы широко используются для амплификации ряда нуклеиновокислотных аналитов в образце. Путем добавления соответствующих ферментов и реагентов, а также использования методов термоциклизации ряд анализируемых молекул нуклеиновых кислот могут быть амплифицированы так, что этот аналит может быть обнаружен с применением наиболее известных детектирующих устройств. Высокий уровень экономической активности, направленной на разработку новых систем генерирования сигнала и детекции, а также на разработку новых типов тест-наборов и оборудования с использованием усиления сигнала и амплификации молекул аналита свидетельствует о важности и необходимости разработки чувствительных методов детекции.

Однако вышеуказанные методы усиления сигнала и амплификации молекул аналита связаны с некоторыми ограничениями, которые усложняют детекцию аналитов с применением этих методов, делают их трудоемкими для использования, требуют больших затрат времени и являются дорогостоящими. Проблемы, связанные с влиянием химических или ферментативных реакций, загрязнением окружающей среды, усложнением и многостадийностью процедур, ограниченной адаптируемостью до одной стадии "гомогенных" (без выделения) режимов, и требованием дорогостоящего и сверхточного оборудования относятся к тем областям деятельности, которые постоянно нуждаются в усовершенствовании.

Таким образом, имеется крайняя необходимость в разработке легких в применении, количественных, многоаналитных и недорогостоящих методов и устройств, которые могут быть использованы для детекции аналитов. Эти методы, тест-наборы и оборудование не должны иметь вышеуказанных недостатков и ограничений уже существующих методов усиления сигнала и амлификации молекул аналита и должны быть пригодными для использования в исследованиях, в отдельных случаях экстренной помощи {в кабинете врача, в кабинете неотложной помощи, в полевых условиях и т.п.) и в высокопроизводительных тестах.

В основу настоящего изобретения поставлена задача разработки новых средств для более легкой детекции одного или нескольких аналитов в образце, присутствующих в более низких концентрациях, чем это было возможно ранее. С помощью настоящего изобретения могут быть обнаружены низкие концентрации аналитов без необходимого ранее усиления сигнала или амплификации молекулы аналита.

Настоящее изобретение относится к сигнальной и детектирующей системе для обнаружения аналитов, при которой могут быть упрощены процедуры и уменьшено количество и типы стадий и реагентов. Настоящее изобретение относится к количественной детекции одного или множества аналитов в образце. Настоящее изобретение также относится к значительному снижению числа различных тестов и количества анализируемого материала образца. Такое снижение числа отдельных тестов приводит к снижению материальных затрат и отходов производства, особенно тех отходов медицинской промышленности, которые нуждаются в утилизации.

Методы детекции, основанные на рассеянии света, и свойства частиц, рассеивающих свет

Имеется большое количество данных, касающихся явления рассеяния света частицами; использования меток, состоящих из частиц, для диагностических анализов; и использования методов, основанных на рассеянии света, в диагностических анализах, которые обсуждаются в нижеследующем описании, ни один из которых не рассматривался ранее до подачи настоящей заявки. Указанный предшествующий уровень техники свидетельствует о новизне и ценности заявленного изобретения.

Общее исследование рассеяния света относится к очень обширной области науки. Примерно за последние сто лет или около того явлению рассеяния света были посвящены интенсивные исследования, и применение имеющейся информации о рассеянии света к различным аспектам человеческой деятельности получило широкое распространение и менялось со временем.

Классическая теория рассеяния света небольшими гомогенными и не поглощающими свет сферическими частицами, размеры которых составляют около 1/20 или менее от длины волны падающего излучения, была впервые разработана Релеем. Позже Ми разработал более общую феноменологическую теорию рассеяния света гомогенными сферическими частицами любого размера и состава. Теорию Ми применяют как к поглощающим свет, так и не поглощающим свет частицам. Исходя из теории Ми было также показано, что уравнения Рэлея могут быть легко обобщены так, что они могут быть применены для частиц, которые поглощают свет, при условии, что эти частицы являются значительно меньше, чем длина волны падающего света. Для частиц такого небольшого диаметра теория Ми и обобщенная теория Рэлея дают одинаковые результаты. Рассеяние света (упругое) может быть рассмотрено с классической или квантомеханической точки зрения. Прекрасное количественное описание может быть получено с точки зрения классической теории.

Исторические предпосылки, а также описание фундаментальной теории рассеянного света и другого электромагнитного излучения приводится в нижеследующих работах: Absorbtion and Scattering of Light By Small Particles (1983), C.F.Bohren, D.R.Huffman, John Wiley and Sons; The Scattering of Light and Other Electromagnetic Radiation (1969), M. Kerker, Academic Press.

Дополнительная известная информация, касающаяся явления рассеяния света, может быть найдена в нижеследующих публикациях.

В работе Zsigmondy, Colloids and the Ultramicroscope - A Manual of Colloid Chemistry and Ultramicroscopy 1914, John Wiley & Sons, Inc. описаны различные светорассеивающие свойства частиц золота и частиц других типов.

В работе Hunter, Foundation of Colloid Science, Vol.1, 105, 1991 описано использование оптических микроскопов, ультрамикроскопов и электронных микроскопов для наблюдения частиц.

В работе Shaw et al., Introduction to Colloid and Surface Chemistry 2nd ed., 41, 1970 описаны оптические свойства коллоидов и использование электронной микроскопии и микросколии по методу затемненного поля, например ультрамикроскопа.

В работе Stolz, SpringerTracts, Vol.130 описана методика анализа рассеяния света.

В работе Klein and Metz, 5 Photographic Science and Engineering 5-11, 1961 описан цвет коллоидных частиц серебра в желатине.

В работе Eversole and Broida, 15 Physical Review 1644-1654, 1977 описано влияние размера и формы на рассеяние света частицами различных металлов, такими как серебро, золото, и медь.

В работе Kreibig and Zacharias, 231 Z. Physik 128-143, 1970 описан поверхностно-плазменный резонанс в небольших сферических частицах серебра и частицах золота.

В работе Bloemer et al., 37 Physical Review 8015-8021, 1988 описаны оптические свойства серебряных игл субмикрометрового размера и использование этих игл, как указано в патенте США (Bloemer) 5151956, где описан поверхностно-плазменный резонанс небольших металлических частиц, используемый для поляризации света, распространяющегося в волноводе.

В работе Wiegel., 136 Zeitschrift fur Physik, Bd., 642-653, 1954 описан цвет коллоидного серебра и его использование в электронной микроскопии.

Использование частиц, рассеяния света и других методов для детекции аналитов

За последние примерно тридцать пять лет частицы металла, включая золото и серебро, использовались в качестве агентов для усиления контраста или в качестве светопоглощающих меток во многих аналитических и/или диагностических методах различного типа. Подавляющее большинство этих методов подпадает под категорию цитоиммунохимических исследований, в которых частицы золота или частицы, усиленные серебром частицы золота, используются в качестве маркеров для исследования структурных аспектов клеточной, субклеточной или тканевой организации. В этих исследованиях частицы металлов и их локализация обычно детектируются методами электронной микроскопии, включая сканирование, передачу сигнала и BEI (визуализацию посредством обратнорассеянных электронов). Эти методы имеют то преимущество, что в них для облегчения детекции частиц золота используются металлы с большой электронной плотностью или металлы с высоким атомным номером благодаря большому числу вторичных и обратнорассеянных электронов, генерируемых этими плотными металлами {см. Hayat, Immunogold-silver staining reference Page 1, and Chepters 1, 6, 15; и Hayat, Colloid Gold reference Chapters 1, 5, 7 и другие).

Имеется несколько работ, посвященных использованию золотых и усиленных серебром золотых частиц в микроскопических исследованиях света. Так, например, в 1978 золотые частицы были использованы в качестве иммунного золотого красителя для детекции с помощью оптической микроскопии. В обзоре использования золотых частиц в оптической микроскопии (см. Hayat, Immunogold-silver staining reference Page 3), опубликованном в 1995, обсуждается эта работа 1978 и представлен следующий анализ: "Geoghehan и др. (1978) были первыми, кто использовали красный или розовый цвет золей коллоидального золота в иммунологическом методе окрашивания золотом с использованием парафиновых срезов. В полимерных полутонких срезах красная окраска света, рассеянного золотыми частицами, имеющими размер до 14 нм, наблюдалась с помощью оптического микроскопа в клеточных органеллах, содержащих высокие концентрации меченых антигенов (Lucocq & Roth, 1984). Поскольку чувствительность иммунологического метода окрашивания золотом гораздо ниже по сравнению с другими иммуноцитохимическими методами, то этот метод не получил широкого применения; при этом визуализировать розоватую окраску золотого покрытия довольно трудно."

В этом параграфе имеется указание на существующую информацию о светорассеивающих свойствах золота и других металлических частиц для диагностических и аналитических исследований. В этом параграфе конкретно указывается: "В полимерных полутонких срезах красная окраска света, рассеянного золотыми частицами, имеющими размер до 14 нм, наблюдалась под оптическим микроскопом в клеточных органеллах, содержащих высокие концентрации меченых антигенов."

Однако при освещении белым светом свет, рассеиваемый золотыми частицами размером 14 нм, имеет, в основном, зеленую окраску. Поскольку под оптическом микроскопом частицы кажутся красными, то это свидетельствует о том, что наблюдаются некоторые взаимодействия, которые являются следствием не только чистого рассеяния света. Вероятно, что красный цвет, наблюдаемый при помощи оптического микроскопа, является преимущественно пропущенным, а не рассеянным светом. В случае когда золотые частицы аккумулируются в достаточном количестве в сайте-мишени в клетках, в тканевых срезах или на некоторых других поверхностях, то благодаря пропущенному свету будет наблюдаться красный цвет (см. также J.Roth (1983) Immunocytochemistry 2 стр.217; and Dewaele et al (1983) in Techniques in Immunochemstry Vol 2 p1, Eds. Bullock and Petrusz, Academic Press).

Как упоминалось в вышеприведенной цитате, очевидно, что чувствительность иммунологического метода скрашивания золотом в оптической микроскопии является более низкой, чем чувствительность других методов, и использование золотых частиц в качестве маркеров для детекции с использованием оптического микроскопа не получило широкого применения. В обзорной монографии, вышедшей в 1995, в Главе 12, стр.198 (Gao & Gao) имеется следующее описание, относящееся к настоящему обсуждению:

"Коллоидное золото благодаря своей электронно-плотной природе и свойствам вторичной электронной эмиссии первоначально использовалось только в качестве маркера для электронной микроскопии (ЭМ) (Horisberger, 1979). Прямая визуализация коллоидного золота в оптической микроскопии (ОМ) была ограничена. Размер частичек коллоидного золота слишком мал для того, чтобы он мог быть обнаружен оптическим микроскопом, хотя при использовании клеток, подвергнутых иммунологическому мечению золотыми частицами в высокой концентрации, эти клетки могут иметь красную окраску благодаря этому реагенту (Geoghehan et al., 1978; Roth, 1982; Holgate et al., 1983)".

Как было упомянуто в вышеуказанных работах, очевидно что чувствительность обнаружения коллоидного золота оптическим микроскопом достаточна низка. Для устранения этого явного недостатка был разработан метод серебряного усиления золотых частиц. В вышеупомянутом обзоре 1995 г. приводится следующее:

"Реальным крупным достижением в иммунологической технике скрашивания золотом, применяемой в оптической микроскопии, явилось использование серебряного усиления коллоидных золотых частиц (20 нм), связанных с иммуноглобулином в парафиновых срезах, толщиной 5 микрон (Holgate et al., 1983). Этот метод способствовал значительному повышению чувствительности, эффективности и точности детекции антигена при помощи оптического микроскопа. С использованием IGSS золотые частицы такого малого диаметра, как 1 нм, могут быть визуализированы в оптическом микроскопе. Тонкий срез, подвергаемый IGSS, также может наблюдаться в оптическом микроскопе, особенно с использованием фазово-контрастного или эпиполяризованного освещения (Stierhof et al., 1992)."

Метод серебряного усиления золотых частиц широко используется. Этот метод усиления позволяет преобразовывать маркерную золотую частицу в более крупную металлическую частицу или даже в более крупную структуру, размер которой составляет несколько микронов или более. Эти структуры состоят, в основном, из серебра, и такие укрупненные частицы могут быть более легко обнаружены визуально в светопольном оптическом микроскопе.

Отдельные увеличенные частицы были визуализированы с помощью конфокальной и эпиполяризоционной оптической микроскопии с использованием высокоразрешающего лазера. См. там же на стр.26 и 203.

Однако специалисты утверждают, что даже с использованием техники серебряного усиления, этот метод не позволяет достичь чувствительности и специфичности, присущих другим методам. Так, например, в публикации Vener, T.I. et al., Analytical Biochemistry 198, p.308-311 (1991) авторы обсуждают новый метод чувствительной детекции аналита, называемый "Анализом на латексную гибридизацию (LHA)". В этом методе используются крупные полимерные частицы диаметром 1,8 микрон, наполненные в высокой степени флюоресцентными молекулами красителя, которые служат в качестве метки для аналита и благодаря которым связанные аналиты могут быть обнаружены посредством флюоресцентного сигнала. Ниже приводится цитата из этой публикации:

"Для оценки метода LHA мы провели сравнение нашего метода с двумя другими непрямыми методами, в которых не используются радиоактивные метки и которые описаны в литературе. Наиболее подходящим методом для сравнения является метод серебряного усиления гибридизационного сигнала с использованием коллоидного золота, связанного со стрептавидином, поскольку этот метод относится к технике конкурентного связывания частиц. Однако этот метод не слишком чувствителен даже с использованием дополнительной стадии серебряного усиления, то есть этот метод позволяет обнаруживать лишь 8 пг ДНК λ -фага, тогда как метод LHA позволял обнаруживать 0,6 пг или 2× 10⁴ молекул ДНК λ -фага на найлоновой мембране.

В работе Stimpson et al., 92, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 6379-6383, July 1995 описан метод детекции ДНК-гибридизации в реальном масштабе времени. Авторы описывают использование корпускулярной метки на ДНК-мишени, которая действует как "светорассеивающий источник при освещении затухающей волной волновода, и лишь метка, связанная с поверхностью, генерирует сигнал... Затухающая волна, генерируемая волноводом, используется для рассеяния света корпускулярной меткой, абсорбированной на множественных "зонах захвата ДНК", находящихся на поверхности волновода. Поскольку незатухающая волна распространяется лишь на несколько сот нанометров от поверхности волновода, то несвязанная/диссоциированная метка не рассеивает свет и стадия промывки не требуется. Интенсивность сигнала является достаточной для измерения связывания с поверхностью, а десорбция светорассеивающей метки может быть исследована в реальном масштабе времени; то есть скорость ее детекции не ограничена. Характер гибридизации на данном элементе может быть оценен визуально или количественно проанализирован с использованием стандартной ПЗС-камеры с 8-битной видеосхемой ввода и регистрации кадра изображения за 1/30 долю секунды."

Эксперименты были осуществлены с использованием золотых частиц диаметром 70 нанометров и селеновых частиц диаметром 200 нанометров. Более интенсивные сигналы были получены с использованием селеновых частиц. При этом авторы указывают, что:

"Был генерирован сигнал волновода, достаточный для того, чтобы можно было различить одно основание ДНК размером 4-40 нм, а поэтому этот сигнал был сравним с системой флюоресцентного сигнала."

В этом методе были использованы волноводы и излучение света типа затухающей волны. Кроме того, этот метод является почти таким же чувствительным, как современные системы детекции, основанные на флюоресценции. При этом предпочтительными являются частицы диаметром 70 нм или более.

В патенте США 501709 (Schutt et al.) описана система иммуноанализа для детекции лигандов или партнеров, связывающихся с этими лигандами, в гетерогенном формате. Эта система основана на детекции "обратнорассеянного света затухающей волны, возникающей благодаря присутствию метки из частиц коллоидного золота, доставляемой к поверхности посредством иммунологической реакции... Расположение детектора под обратным углом выше критического угла обеспечивает более высокое отношение "сигнал-шум".

Авторы поясняют, что в описанной системе иммуноанализа используется диффузное полное внутреннее отражение, то есть распространение затухающих волн. Это указывает на то, что присутствие коллоидного золота прерывает распространение затухающей волны и приводит к получению рассеянного света, который может быть обнаружен фотоумножителем или другими световыми приемниками с получением чувствительного сигнала. Это свидетельствует о том, что важным аспектом настоящего изобретения является локализация детектора.

"Детектор является идеально расположенным в том случае, если угол, под которым он расположен, превышает критический угол, и при такой локализации обнаруживается только свет, рассеянный в обратном направлении по отношению к детектируемому источнику. Поэтому такое расположение позволяет идеально избежать детекции сверхрассеянного света в объемной жидкой среде."

Полное внутреннее отражение падающего луча используется для создания моды затухающей волны излучения, и его детекцию осуществляют на оптически прозрачной поверхности. При этом предпочтительно использовать специальное оборудование.

В патенте США 4313734 (Leuvering) описан метод детекции специфически связывающихся белков путем использования меченых компонентов, полученных путем присоединения частиц "водной дисперсии металлов, металлических соединений или полимерных сфер, покрытых металлом или металлическим соединением и имеющих диаметр, по крайней мере, 5 нм". Указывается, что этот способ является особенно подходящим для оценки иммунохимических компонентов, таких как гаптен, антигены и антитела. Указывается также, что металлические частицы были уже использованы как метки, усиливающие контрастность в электронной микроскопии, но об их использовании в иммуноанализе, по-видимому, "нигде не сообщается, и возможность его использования является неожиданной".

Иммунохимические методы с использованием золей из металлических частиц, разработанные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть не только более чувствительными, чем известные иммунологические методы, предусматривающие использование радиоактивных и ферментных меток, но можно также продемонстрировать, что благодаря использованию частиц золя различного химического состава в качестве меток эти методы способны обеспечить определение более одного иммунологического компонента в одной и той же тест-среде одновременно".

Примерами металлов являются платина, золото, серебро и медь или их соли.

"Измерение физических свойств и/или концентрации металлов и/или образованных металлсодержащих агломератов в определенной фазе реакционной смеси может быть осуществлено с использованием различных методов, которые известны по существу. Примерами таких методов являются колориметрическое определение, где предусматривается использование интенсивной окраски некоторых дисперсий, которые, кроме того, меняют свой цвет в соответствии с физикохимическими изменениями; визуальный метод, который часто применяется для качественной оценки, исходя из вышеуказанного факта, что металлические золи являются окрашенными; использование пламенной эмиссионной спектрофотометрии или другого метода плазменно-эмиссионной спектрофотометрии, который позволяет осуществлять одновременное детектирование; и высокочувствительный метод беспламенной атомно-абсорбционной спектрофотометрии."

Два или несколько аналитов, присутствующих в образце, могут быть предпочтительно обнаружены с использованием пламенной эмиссионной спектрофотометрии или другим методом плазменно-эмиссионной спектрофотометрии. Предпочтительным методом с более чувствительной детекцией является беспламенная атомно-абсорбционная спектрофотометрия.

В патенте США 5350697 (Swope et al.) описано устройство для измерения рассеянного света с использованием источника света, расположенного так, чтобы луч света, направленный на образец, падал под углом, меньшим, чем критический угол. Детектор был расположен так, что он обнаруживал рассеянный свет с внешней стороны огибающей критического угла.

В патенте США 4480042 (Craig et al.) описано использование реагентов, состоящих из частиц с высоким показателем преломления, в иммуноанализе, основанном на рассеянии света. Предпочтительные частицы состоят из полимерных материалов. Концентрацию соединений, представляющих биологический интерес, определяли путем измерения изменения степени помутнения, вызванной частичной агглютинацией, или ингибированием агглютинации. Предпочтительные частицы имеют диаметр менее 0,03 микрон. "Более короткие длины волн, такие как 340 нм, дают большую разность сигналов, чем более длинные длины волн, такие как 400 нм."

В патенте США 4851329 (Cohen et al.) и в патенте США 5286452 (Hansen) описаны методы детекции агглютинированных частиц путем анализа размера частиц, дающих оптические импульсы, или путем использования анализатора частиц светового потока. Указывается, что эти системы могут быть использованы для определения концентраций антигена или антител. Эти методы предусматривают использование сверхточной аппаратуры и специальных устройств для обработки сигнала. Предпочтительные частицы имеют диаметр от около 0,1 до 1 микрон для метода Cohen и от около 0,5 до около 7,0 микрон для метода Hansen.

В работе Okano et al., 202 Analitieal Biochemistry 120, 1992 описан гетерогенный "сандвич"-иммуноанализ с использованием микрочастиц, которые могут быть подсчитаны с помощью инвертированного оптического микроскопа. Микрочастицы имели диаметр 0,76 микрон и представляли собой карбоксилированные микрочастицы, изготовленные из акрилата.

Другие методы детектирования частиц описаны в патенте США 3975084 (Block), в патенте 3975084 (Kuroda), в патенте США 5274431 (Ford, Jr.), в патенте США 5305073 (Furuya), в патенте США 5257087 и в патенте США 5311275 (Taniguichi et al.).

В работе Geoghagan et al., 7 Immunological Communication 1-12, 1978 описано применение коллоидного золота для мечения кроличьего антитела против козьих иммуноглобулинов IgG, используемого для непрямого обнаружения других антител. Для детекции меченых частиц использовался оптический и электронный микроскоп. Золотые частицы имели средний размер 18-20 нанометров, и для их обнаружения использовалась светлопольная оптическая микроскопия. Для электронной микроскопии использовались тонкие срезы, окрашенные серебром-золотом по методу Araldite. "Аналогичные процентные соотношения поверхностно меченных клеток были определены с помощью иммунофлюоресценции и окрашивания коллоидным золотом по методу светлого поля". С помощью электронного микроскопа может быть детектировано 1-5 частиц на клетку, но авторы указывают, что:

"Такие небольшие количества метки не могут быть детектированы с помощью флюоресценции или с помощью светлопольной микроскопии и могут представлять собой неспецифически связанные или связанные посредством Fc-рецептора молекулы GAD и GAM с низким уровнем поверхностного иммуноглобулина (S.lg) на GAD- и GAM-обработанных клетках."

В патенте США 5079172 (Hari et al.) описано использование золотых частиц в реакциях антител и обнаружение этих частиц с использованием электронного микроскопа. Размер частиц составлял 15 нанометров. В предпочтительном методе используется электронная микроскопия.

В патенте США 4420558 (DeMey et al.) описано использование светлопольной оптической микроскопии для подсчета клеток, меченных антителами, которые, в свою очередь, были помечены золотом. В этом методе используется оптический микроскоп в светлопольном устройстве с увеличением 500 х или более, где для подсчета негативных по пероксидазе и меченных золотом клеток используются масляно-иммерсионные линзы. Визуализация меченых поверхностей основана на агрегирующих свойствах золотых частиц, которые при определенных условиях подвергаются экстенсивному скоплению, и эти очаги скопления ("пэтчи") на клеточной поверхности могут быть выявлены с использованием описанного метода. Было установлено, что оптимальные результаты могут быть получены с использованием золотых частиц размером 40 нанометров.

В патенте США 4446238 (De Mey et al.) описан аналогичный иммуноцитохимический метод с использованием светлопольной оптической микроскопии для определения локализации в гистологических срезах меченных коллоидным золотом иммуноглобулинов в виде маркера красного цвета. Этот метод иммунологического окрашивания золотом (IGS) авторы описывают следующим образом:

"В обеих процедурах конечным продуктом является аккумуляция большого числа золотых гранул на антигенсодержащих участках, в результате чего продуцируется типичная рыжеватая окраска золей коллоидного золота."

В патенте США 4752567 {DeBrabander et al.) описан метод обнаружения отдельных металлических частиц, имеющих диаметр менее чем 200 нм, с использованием светлопольной или эпиполяризационной микроскопии и контрастного усиления с помощью видеокамеры. Авторы изобретения сообщают:

"Обычно в вышеупомянутых процедурах используемые металлические частицы имеют диаметр от около 10 до около 100 нм. Это значительно ниже предела разрешения светопольной микроскопии, которое обычно составляет около 200 нм. Поэтому совершенно очевидно, что все до сих пор известные визуальные методы с использованием оптического микроскопа ограничены в своем применении детекции иммобилизованных агрегатов металлических частиц. Отдельные частицы могут наблюдаться лишь с помощью ультрамикроскопической техники, а в частности, с помощью электронной микроскопии.

Неожиданно было обнаружено, что отдельные металлические частицы диаметром менее чем 200 нм могут быть сделаны отчетливо видимыми с помощью оптической микроскопии по методу светлого поля или эпиполяризационной микроскопии в видимой части спектра при условии, что полученное изображение может быть подвергнуто электронному контрастному усилению."

В последующих главах авторы сообщают:

"По сравнению с существующими диагностическими методами, основанными на иммуноанализах с использованием зольных частиц, настоящий метод имеет большую чувствительность. Действительно, существующие методы основаны, главным образом, на поглощении или рассеянии света массой абсорбированных или суспендированных металлических частиц. Очевидно, что для наблюдения окраски, например, на среде для блоттинга, необходимо присутствие огромного числа частиц. В противоположность этому настоящий метод позволяет наблюдать и подсчитывать отдельные частицы. Поэтому рассматриваемый метод будет способствовать значительному облегчению проявления диагностических блотов в тех случаях, где, например, существующие визуальные или колориметрические методы являются слишком низкочувствительными, например для диагностики гепатита."

В работе Schafer et al., 352 Nature, 444-448, 1991 описано использование частиц золота размером в несколько нанометров, которые могут наблюдаться с использованием дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии с видеоусилением. Были использованы частицы размером 40 нанометров.

В работе DeBrabander et al., 6 Cell Motolity and the Cytoskeleton, 1050113, 1986 (и в патенте США 4752567) описано использование субмикроскопических золотых частиц и светопольного контрастного видеоусиления. В частности, клетки наблюдались с помощью светлопольной контрастной микроскопии с видеоусилением и с использованием золотых частиц диаметров 5-40 нанометров. Авторы также сообщают:

"отдельные золотые частицы, имеющие размер менее чем ±100 нанометров и абсорбированные на стекле или клетках или введенные путем микроинъекции в клетки, не обнаруживаются оптическим микроскопом. Однако они легко визуализируются с использованием видеокамеры для электронного контрастного усиления."

Авторы описывают использование эпи-освещения поляризованным светом или использование "более легкого и явно более чувствительного метода" с применением пропускаемого светлопольного освещения монохроматическим светом и с использованием простой камеры. Авторы указывают, что золотые частицы могут быть легко детектированы с помощью фазово-контрастной микроскопии.

"В отличие от методов, которые могут быть осуществлены с использованием более крупных золотых частиц (обычно 20-40 нм), даже плотные скопления 5-нанометровых золотых частиц, например на таких структурах, как микротрубочки, не видны под оптическим микроскопом. Они не продуцируют детектируемой красной окраски. Недавно эта проблема была решена путем физического увеличения с использованием солей серебра, которые увеличивают размер частиц с продуцированием легко заметной черной окраски.

Нами был описан способ определения локализации лигандов почти на молекулярном уровне. Этот способ является новым, поскольку он впервые позволяет достичь указанной цели с помощью оптического микроскопа и с использованием отдельных дискретных маркеров, которые явно отличаются от фоновых структур. Поскольку этот способ может быть применен даже к живым клеткам, то он может быть использован для прослеживания динамического поведения отдельных белков. Это обусловлено тем, что указанный способ объединяет два хорошо разработанных метода: мечение золотом и видеомикроскопию. Большинство из этих применений может быть осуществлено с использованием недорогостоящей видеоаппаратуры, стоимость которой меньше, чем стоимость хороших масляно-иммерсионных 100 х-объективов. Кроме того, объединение этих современных цифровых преобразований изображения дает много дополнительных возможностей. Некоторые из дополнительных преимуществ заслуживают внимания. Поскольку метка состоит из отдельных дискретных маркеров, то их подсчет как вручную, так и автоматически (с помощью компьютера) является легким и надежным. Небольшой размер маркера минимизирует проблемы, связанные с пенетрацией и диффузией. Возможность изменять заряд маркера почти по желанию способствует снижению неспецифического связывания при любом конкретном применении."

Этот способ определяется авторами как "нанокорпускулярная видеоультрамикроскопия или коротковолновая нановидеоультрамикроскопия." Аналогичная технология описана Geerts et al., 151, Nature, 765-766, 1991.

Предыдущие дискуссии, касающиеся методов, основанных на рассеянии света и использовании рассеивающих свет частиц, и методов диагностики явно показали пределы современных методов детекции аналитов, а также новизну и важное значение настоящего изобретения. Целью настоящего изобретения является не только устранение имеющихся в настоящее время ограничений и недостатков диагностических анализов, основанных на рассеянии света, но также и устранение ограничений и недостатков других методов, не использующих световое рассеяние, таких как метод усиления сигнала и амплификации молекул аналита. Описанное здесь настоящее изобретение является более простым в применении, имеет большую чувствительность детекции и позволяет измерять аналиты, имеющие концентрации в более широком диапазоне, чем это было возможно ранее. Настоящее изобретение может быть широко применено к большинству типов образцов и схем анализа в качестве системы генерирования сигнала и системы для детекции аналита.

Изобретение представляет способ для детектирования одного или более аналитов в образце посредством связывания этих аналитов по меньшей мере с одной детектируемой светорассеивающей частицей с размером меньшим, чем длина волны света от осветителя. Эта частица освещается световым лучом при условиях, когда луч света, рассеянный частицей, может быть обнаружен человеческим глазом с увеличением менее 500 крат. Свет, который рассеян от частицы, затем детектируется при этих условиях в качестве меры присутствия одного или более аналитов.

Заявитель с удивлением определил, что просто гарантируя соответствующее освещение и гарантируя максимальное детектирование специфического рассеянного света, можно получить в результате чрезвычайно чувствительный способ. Способ светового освещения и детектирования назван заявителем как "DLASLPD" (прямое освещение, направленное под таким углом, чтобы детектировался только свет, рассеянный частицами).

Способ и связанное с ним устройство предназначены для максимального детектирования только рассеянного света от частиц, и, таким образом, он во много раз более чувствительный, чем использование флюорофоров или использование таких частиц в других описанных выше способах. Такие частицы могут детектироваться с использованием микроскопа с низким увеличением (с увеличением в диапазоне 2-500 раз, например 10-100 раз) без необходимости какого-либо электронного усиления сигнала. Кроме того, обеспечиваются способы, в которых вообще не нужен микроскоп или система отображения, а предпочтительнее детектируется одно или более свойств светорассеяния жидкого или твердофазного образца, через который рассеивается свет. Эти свойства светорассеяния могут использоваться для определения присутствия, отсутствия или количества аналита, присутствующего в любом конкретном образце.

Источник света вообще не должен выполняться каким-либо особенным образом (например, поляризованный, или лазерный, или с высокой интенсивностью), но необходимо только, чтобы он был направлен так, чтобы можно было детектировать рассеянный свет от частиц. Для того чтобы гарантировать уменьшение неспецифического рассеяния света, может использоваться пространственная фильтрация. Такая фильтрация может быть добавлена посредством других приборных компонентов и камер для образцов, которые уменьшают посторонний свет.

Прямое освещение может быть немонохроматическим или монохроматическим, непрерывным или импульсным и когерентным или некогерентным светом. Оно не должно быть поляризованным и может генерироваться из источника света малой мощности, например светодиод или 12-ваттная лампочка накаливания, или что-то подобное. Свет является не мгновенным светом, как описано выше автором Stimpson. Свет направляется на образец, который может содержать частицы, под таким углом, что сам по себе прямой свет не будет наблюдаться детектором, если он не является светом, рассеянным частицами. Способ и устройство отличаются от вышеописанных автором Swope тем, что такое рассеяние может наблюдаться глазом в пределах критического угла, предпочтительно в пределах угла освещения. Однако он также может детектироваться под углом больше критического и вне огибающей интенсивности прямого направления рассеянного света. При использовании вместе с устройством изображения, т.е. с микроскопом, настоящий способ предпочтительно использует детектор, перпендикулярный плоскости образца.

В отличие от диагностической техники, которая была описана в разделе "уровень техники изобретения", заявитель обнаружил, что специфические типы частиц могут детектироваться и измеряться при очень низких концентрациях, с высокой степенью определенности и в широком диапазоне концентраций с помощью более удобных и менее дорогостоящих способов и устройств. Изобретение обеспечивает детектирование аналитов с большим удобством использования, большей чувствительностью, большей определенностью и менее дорогостоящее, чем известные способы детектирования аналитов.

Способами теоретического моделирования и физического экспериментирования заявитель определил, что покрытые металлоподобные частицы имеют подобные свойства светорассеяния по сравнению с непокрытыми металлоподобными частицами, оба типа которых имеют превосходные свойства светорассеяния по сравнению с неметаллоподобными частицами. Под "металлоподобными" частицами подразумевается любая частица или субстанция, подобная частице, которая составлена из металла, металлических соединений, металлических окисей, полупроводников (ПП), сверхпроводников, или частица, которая составлена из смешанного состава, содержащего по меньшей мере 0.1 вес.% металла, металлического соединения, окиси металла, полупроводника или сверхпроводящего материала. Под "покрытой" частицей подразумевается, что частица имеет на своей поверхности слой дополнительного материала. Слой нужен для химической стабилизации частицы в среде различных образцов и/или для связи специфических аналитов с молекулярным распознающим средством. Такие покрытия представляют собой, например, неорганические и/или органические соединения, полимеры, протеины, пептиды, гормоны, антитела, нуклеиновые кислоты, рецепторы и т.п. Под "неметаллоподобными" частицами подразумеваются частицы, которые не составлены из металла, металлических соединений, сверхпроводника, металлических окисей, полупроводника или смешанных составов, которые не состоят по меньшей мере на 0.1 вес.% из металла, металлического соединения, металлической окиси, сверхпроводника или полупроводникового материала.

Заявитель также определил следующее:

(1) один или более аналитов в образце могут детектироваться и измеряться посредством детектирования и/или измерения одного или более специфических свойств светорассеяния металлоподобных частиц. Эти свойства светорассеяния включают: интенсивность, длину волны, цвет, поляризацию, угловую зависимость и RIFSLIW (отдельные ротационные флюктуации в интенсивности и длинах волн рассеянного света) рассеянного света. Одно или более из этих свойств рассеянного частицами света может использоваться, чтобы обеспечить информацию относительно аналитов в образце;

(2) варьируя размер и/или форму и/или состав металлоподобной частицы в различных комбинациях, можно регулировать одно или более свойств светорассеяния с целью генерации более легко обнаружимых и измеряемых сигналов светорассеяния;

(3) освещение и детектирование металлоподобных частиц определенного размера, формы и состава по методу DLASLPD обеспечивает высокочувствительный и удобный способ детектирования и измерения металлоподобных частиц по их свойствам светорассеяния. Способ обеспечивает детектирование единичной частицы посредством удобного и недорогого устройства;

(4) способы DLASLPD могут использоваться с помощью подсчета частиц и/или измерения интегральной интенсивности света, чтобы обеспечить детектирование и измерение частиц в широком диапазоне концентраций;

(5) использование способов повышения показателя преломления обеспечивает повышение свойств светорассеяния частиц и/или уменьшает неспецифический световой фон;

(6) использование способов DLASLPD повышения контраста изображения может обеспечивать более чувствительное детектирование во многих различных типах образцов и типах диагностического анализа;

(7) для чувствительного детектирования аналитов на маленькой площади твердой фазы, такой, как обычно используются в форматах микроматрицы и элемента матрицы, некоторые типы металлоподобных частиц более предпочтительны для использования, чем другие. Металлоподобные частицы в форматах микроматрицы и элемента матрицы можно наиболее легко и дешево детектировать с использованием способов DLASLPD. Такие частицы в этих форматах могут также детектироваться способами лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, микроскопии по методу светлого поля или микроскопии в поляризованном отраженном свете, контрастной микроскопии в отраженном свете и микроскопии по методу интерференционного контраста. Однако эти способы и устройства не такие удобные и дешевые, как детектирование способами и устройством DLASLPD; и

(8) могут быть сконструированы соответствующие требованиям устройства и типы частиц для специфических испытательных комплектов. Эти различные испытательные комплекты и соответствующее устройство применимы для прикладных целей потребителя, мобильного использования в полевых условиях, пунктов оказания помощи, таких как медицинское учреждение, клиника, пункт скорой помощи и т.п., научно-исследовательских лабораторий и централизованных испытаний с высокой пропускной способностью. Вышеупомянутые аспекты настоящего изобретения обеспечивают детектирование одного или более аналитов во многих различных типах образцов и типах диагностического анализа.

Как будет обсуждаться более подробно далее, имеется много вариаций типов частиц, источников света и механизмов детектирования света. Кроме того, много вариаций можно осуществить на типах используемых частиц.

В предпочтительных вариантах воплощения частица имеет размер, состав и форму, подходящие для генерации специфического сигнала(-ов) рассеяния света специфической длины волны, цвета(-ов), поляризации, угловой зависимости и RIFSLIW рассеянного света, который можно детектировать средством фотодетектора или обнаруживать глазом; детектирование включает способы подсчета частиц и/или измерение интенсивности рассеянного света в виде измерения концентрации частиц; частица формируется из металлоподобных материалов или из смешанных составов, включающих неметаллоподобные материалы, частицы имеют сферическую, овальную или асимметричную форму (под асимметричной формой подразумевается явно не сферическая форма); частицы покрываются связующими агентами, полимерами, реактивными химическими группами, молекулами основного материала, неорганическими и органическими соединениями; используется изменение свойств светорассеяния, когда две или более частиц приводятся в тесный контакт друг с другом в форматах анализа; используются реагенты частиц, состоящие из металлоподобного материала и покрытые молекулами основного материала, адаптированного для связи со связующим агентом; используются типы анализа, в которых две или большее количество частиц помещаются достаточно близко друг к другу так, чтобы свойство светорассеяния двух или более частиц могло различаться от отдельных частиц; используются типы анализа, в которых две или более частицы, которые поддерживаются вплотную друг к другу, побуждаются отделяться так, чтобы свойство светорассеяния любой из частиц изменилось; используются типы анализа, в которых две или более частиц связаны между собой одним или более молекулярными взаимодействиями так, что когда молекулярное взаимодействие разрывается, то одна или более частиц освобождается от молекулярного взаимодействия; используются типы анализа, в которых усиленное детектирование аналитов выполняется посредством поперечной связи двух или более частиц между собой посредством использования химических или биологических агентов сшивания; частицы составляются из дополнительных материалов с целью позволить им ориентироваться в электрическом, магнитном или связанном электромагнитном поле (ЭМП); частицы присоединяются к другим частицам с магнитными или сегнетоэлектрическими свойствами; и луч света от осветителя имеет длину волны, выбранную с целью снизить уровень фона по сравнению с другими длинами волны.

В других вариантах воплощения свет от осветителя является непрерывным или импульсным; свет от осветителя является когерентным или некогерентным; свет от осветителя является поляризованным или неполяризованным; для освещения образца используются две или более различные длины волны либо из одного источника света, либо из двух или более различных источников света, и детектируются сигналы рассеянного света.

В других вариантах воплощения способ включает использование множества различных частиц, каждая из которых имеет одно или более свойств рассеяния света, которые могут детектироваться средством фотодетектора или глазом; и/или используется множество различных длин волн света на шаге детектирования или освещения; используются способы повышения показателя преломления с целью снижения неспецифического светового фона; детектор помещают под углами, находящимися за пределами огибающей прямого направления света, рассеянного образцом; используются способы пространственной фильтрации, оптические фильтры, такие как ограничивающие фильтры, и/или используются фильтры с узкой полосой пропускания на шаге детектирования с целью снижения неспецифического фонового света.

В других вариантах воплощения перед детектированием частицу увеличивают в размере посредством автометаллографии; из луча света от осветителя отфильтровывают инфракрасное излучение; аналит находится в сыворотке; перед детектированием частицы выпускаются в раствор; перед детектированием частицы концентрируются в маленьком объеме или на участке твердой фазы; частицы детектируются посредством зависящей от времени связи с поверхностью или посредством прохождения частиц мимо детектора или набора детекторов; многочисленные аналиты детектируются на твердой фазе в микроматрице; микроматрица покрывается жидкостью или сухая; отдельные или многочисленные аналиты детектируются на поверхности клетки, лизате клетки или препарате хромосомы; луч света от осветителя представляет собой немонохроматический белый свет или монохроматический свет; аналит присутствует в растворе или твердой фазе или находится на предметном стекле или на планшете для микротитрования или другом пластмассовом контейнере; частица представляет собой золотую или серебряную частицу, имеющую размер между 1 и 500 нм, предпочтительно между 10 и 200 нм; шаг детектирования не содержит усиление рассеянного света электронным средством и луч света от осветителя направляется на частицу призмой или другой оптической системой.

Дополнительно, детектирование может включать наблюдение частицы через объектив по меньшей мере с 10-кратным увеличением; используется способ DLASLPD повышения контраста изображения; используется волоконно-оптическое освещение и детектирование; используются следующие способы микроскопии: микроскопия по методу светлого поля, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, контрастная микроскопия в отраженном свете и микроскопия по методу интерференционного контраста; выполняется детектирование и очистка комбинаторных синтезированных молекул; частицы и/или специализированные покрытия используются в качестве твердофазных синтетических подложек для комбинаторных или других синтезированных молекул; используются специально разработанные камеры для образцов; используются неотражающие покрытия на оптических компонентах и камерах для образцов; используется устройство для полевых условий, медицинского учреждения, клиник и больничных блоков и специфические типы частиц обеспечиваются в соответствующих испытательных комплектах.

Высокая чувствительность и удобство системы генерации сигнала и детектирования настоящего изобретения означает, что специалист может с помощью недорогого средства детектировать и измерять один или более аналитов в образце при чрезвычайно низких концентрациях без необходимости использования способов усиления сигнала (метки) или молекулы мишени аналита.

Широкий диапазон сигналов специфического светорассеяния от различных типов частиц в настоящем изобретении означает, что специалист может детектировать и измерять с высокой степенью определенности один или более аналитов в образце.

Высокая оптическая разрешающая способность двух или более различных типов частиц в настоящем изобретении означает, что возможно очень простое детектирование многих аналитов (то есть два или более различных аналитов) в образце без потребности в сложном устройстве.

Специалисты должны признать, что заявитель раскрыл новейшие способы и устройство с широкой применимостью. Настоящее изобретение может применяться в том или другом виде к большинству ситуаций, в которых желательно использовать систему генерации и детектирования сигнала как часть системы анализа для количественного определения и/или детектирования присутствия или отсутствия анализа. Такие аналиты включают промышленные и фармацевтические соединения всех типов, протеины, пептиды, гормоны, нуклеиновые кислоты, липиды и углеводы, а также биологические клетки и организмы всех видов. Тот или другой вариант воплощения настоящего изобретения может быть приспособлен к большинству типов анализа, которые обычно используются в диагностическом анализе всех видов. Например, они включают гетерогенные и гомогенные форматы анализа, которые бывают типа сандвича, типа скопления, косвенного или прямого типа и т.п. Образцы могут быть типа жидкой фазы, твердой фазы или смешанной фазой.

Другие признаки и достоинства изобретения будут очевидны из следующего описания предпочтительных вариантов воплощения и из формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

В дальнейшем изобретение поясняется описанием конкретных вариантов его воплощения со ссылками на сопровождающие чертежи, на которых:

фиг.1 иллюстрирует освещение образца снизу. L - линза; D - диаметр линзы; О - участок на поверхности S, подлежащий детектированию; С - конус, показывающий углы, под которыми линза L собирает свет; LB - луч света от осветителя;

фиг.2 иллюстрирует угол собирания линзы. D – диаметр линзы; f - фокусное расстояние; О - детектируемый участок; Θ _H - плоский половинный угол собирающего конуса;

фиг.3 изображает диаграмму, которая определяет углы, используемые для описания отражения и преломления на поверхности. S - поверхность; ni и nt - показатели преломления среды, из которой падает свет, и среды поверхности соответственно; RFRB и FLB - преломленный и отраженный световые лучи соответственно; IB - падающий световой луч; Θ i, Θ r и Θ t - углы падения, отражения и преломлении светового луча;

фиг.4А, 4Б и 4В изображают графики отражения света для ni<nt, взятые из различной литературы;

фиг.5А и 5Б изображают графики отражения света для ni>nt, взятые из различной литературы;

фиг.6 иллюстрирует преломление и отражение, происходящие при освещении частиц на сухой поверхности в воздухе;

фиг.7 изображает график зависимости угла Θ i2 от угла Θ i1 для n₂=1.5 и n₁=1 (см. фиг.6);

фиг.8 иллюстрирует угловое распределение света, рассеянного артефактами поверхности и частицами; пунктирные линии представляют свет, рассеянный частицей; сплошная линия со стрелкой изображает падающий луч белого света и один луч света, рассеянного поверхностными артефактами, и круг изображает огибающую интенсивностей для света, рассеянного в прямом направлении;

фиг.9 изображает образец в тонкой пленке воды, которая находится на предметном стекле и покрыта покровным стеклом. Луч освещения проходит четыре поверхности раздела сред; S1 (из воздуха в стекло); S2 (из стекла в воду); S3 (из воды в стекло); S4 (из стекла в воздух). Частицы находятся в точке О на поверхности S2 или свободно перемещаются над поверхностью S2. Падающий свет попадает на поверхность S1;

фиг.10 изображает освещение образца сверху. L - линза; С - собирающий конус;

фиг.11 изображает освещение с использованием устройства призмы (освещение снизу). S1 - поверхность призмы в месте падения света; S2 и S3 - нижняя и верхняя поверхности части пластмассовой подложки соответственно;

фиг.12А, 12Б, 12В, 12Г и 12Д представляет срезанную призму (12А), равнобочную призму (12Б), самодельную призму (12В и 12Г) и плосковыпуклую линзу соответственно;

фиг.13 изображает луч света от осветителя, видимый с блоком родаминовой пластмассы;

фиг.14 изображает поверхность и связанные с ней плоскости для целей описания фигуры 15; S1 - твердая подложка, оптически прозрачная или непрозрачная; SP1 - 3-мерное пространство над плоскостью поверхности S1; SP2 - 3-мерное пространство под плоскостью поверхности S1. Светорассеивающие частицы или материал находятся в пространстве SP1 на поверхности S1 или вблизи нее;

фиг.15 обобщает различные способы освещения и детектирования DLASLPD;

фиг.16 изображает экспериментально измеренный спектр интенсивности рассеянного света в зависимости от длины волны падающего света для покрытой и непокрытой золотой частицы диаметром 100 нм;

фиг.17, 18 и 19 изображают различные конструкции камер для образцов, предназначенных для снижения неспецифического светового фона. В этих камерах для образцов можно испытывать как жидкие, так и зафиксированные образцы. На фиг.17 S1 - поверхность камеры для образца, на которую падает световой луч; S2 - поверхность, которая содержит светорассеивающий материал (для зафиксированных образцов). S3 - другая скошенная поверхность; поверхности S1 и S3 - скошены под углами приблизительно от 20 градусов до 70 градусов в зависимости от угла освещения, лицевая сторона поверхности S1 должна быть наклонена под таким углом, чтобы световой луч падал на S1 под углом 0 градусов относительно перпендикуляра; S4 - оптически прозрачная поверхность с окошком или без него; S5 - противоположная сторона поверхности S2. Если камера закрытая, то есть поверхность S4 сплошная без окошка, то маленькое окошко располагают на одной из поверхностей для введения образца и при необходимости для промывки;

фиг.18 изображает конструкцию, подобную фиг.17, за исключением того, что скошенные стороны заменены закругленными сторонами. Все остальное аналогично конструкции из фиг.17;

фиг.19: S1 - плоская скошенная оптически прозрачная поверхность камеры для образца, на которую падает световой луч. Лицевая сторона поверхности S1 должна быть наклонена под таким углом, чтобы световой луч падал на S1 под углом 0 градусов; S2 - поверхность, которая содержит светорассеивающий материал, если материал зафиксирован; S3 - другая изогнутая или скошенная поверхность. S4 - оптически прозрачная поверхность для закрытой камеры образца; в другом случае S4 имеет окошко разных размеров и форм для введения и промывки образца и для детектирования; S5 - противоположная сторона поверхности S2. Если камера закрытая, то требуется маленькое окошко на одной из поверхностей для введения и/или промывки образца;

фиг.20 изображает систему координат, которая используется для описания взаимодействия частиц с поляризованным светом. Свет распространяется вдоль оси y и поляризован в направлении оси z. D - детектор интенсивности рассеянного света; γ - направление наблюдения; Θ и φ - полярный и азимутальный угол соответственно;

фиг.21 изображает оптическую схему прибора для анализа жидких образцов. Свет лампы накаливания или разрядной лампы фокусируется системой линз, представленной линзой L1, на входную щель монохроматора; монохроматический свет, выходящий из монохроматора, собирается линзой L2 и фокусируется линзой L3 на центр прозрачной кюветы с образцом (ST); кювета с образцом содержит жидкий раствор флюоресцентных молекул или суспензию светорассеивающих частиц; кювета с образцом находится под таким углом или наклонена так, чтобы свет, отраженный от стенок, был преломлен вниз и в сторону от фотодетектора; свет, рассеянный или испускаемый образцом, собирается линзой L4, которая формирует на плоскости М увеличенное изображение кюветы образца и жидкого содержимого; в плоскости М размещается маленькая апертура, которая выборочно пропускает свет, испускаемый или рассеянный жидкостью в центре кюветы, чтобы он попал в фотодетектор, но загораживает фотодетектор от света, отраженного или рассеянного от боковых стенок кюветы для образца; увеличенное изображение центра жидкого содержимого на плоскости М смещается с оптической оси линзы L4 действием показателя преломления стенки наклонной кюветы для образца, через которую детектируется испускаемый или рассеянный свет; фотодетектор и апертура помещаются с одной стороны оптической оси линзы L4 так, чтобы смещенное изображение жидкого центра попадало на апертуру и фотодетектор; обеспечиваются штативы (H1 и Н2) для оптических фильтров и/или поляризаторов, вводимых в оптический путь света от осветителя и рассеянного света; перед фотодетектором помещается оптический затвор. Если фотодетектор имеет маленькую светочувствительную область, то линза L5 используется для фокусировки света, проходящего через апертуру плоскости М, на светочувствительную область. Если монохроматический свет не требуется, то монохроматор можно легко убрать и свет из лампы накаливания или разрядной лампы может направляться непосредственно линзами L1, L2 и L3 на центр контейнера для образца;

фиг.22, 23 и 24 вкратце излагают способы использования светорассеивающих частиц и специфических способов DLASLPD, которые приводят к специфическим испытательным комплектам и устройству;

фиг.25 вкратце излагает процесс разработки устройства и анализа;

фиг.26А, Б, В, Г, Д и Е изображают расчетную интенсивность рассеянного света как функцию параметра длины волны падающего света для сферических частиц диаметром 10 нм из золота, серебра, алюминия, меди, селена и полистирола соответственно. l_к является длиной волны; C_sca - сечение рассеяния света;

фиг.27А, Б, В, Г, Д и Е изображают расчетную интенсивность рассеянного света как функцию длины волны падающего света для золотых частиц различных размеров. А, Б, В, Г, Д и Е соответствуют сферическим золотым частицам диаметром 10, 20, 40, 60, 80 и 100 нм соответственно. REL CSCA - относительное сечение рассеяния света; WAVE, NM - длина волны в нанометрах;

фиг.28 изображает схематический вид сферической покрытой частицы; (1) - покрытие из полимера, связующего агента или из другого вещества на поверхности частицы; (2) - ядро частицы;

фиг.29А, Б и В изображают схематический вид УСРЧ, MLSP (управляемая светорассеивающая частица) частиц смешанного состава; А (1) - магнитный или сегнетоэлектрический материал ядра, покрытый желательным светорассеивающим материалом (2); Б изображает (4) ядро светорассеивающего материала, покрытое магнитным или сегнетоэлектрическим материалом (3); В изображает смесь (5) светорассеивающего материала (6) с магнитным или сегнетоэлектрическим материалом;

фиг.30А, Б и В изображают двухмерную, четырехмерную структуру частиц и структуру более высокого порядка соответственно, для ориентируемых УСРЧ частиц; (1) - светорассеивающие детектируемые частицы и (2) - магнитные или сегнетоэлектрические частицы; линия (3) - химическая, ионная или другая связь, которая связывает частицы между собой в структуре из многих частиц.

В описании используются следующие сокращения:

E-ENR - испускаемое электромагнитное излучение;

I-EMR - падающее электромагнитное излучение;

ЭМП - электромагнитное поле ПП (SC) - полупроводник;

сек (Sec) - секунда;

Qf - квантовый выход флюоресценции;

I_abs - поглощение падающего света (число фотонов, поглощаемых в секунду);

I₀ - интенсивность падающего света (фотонов в секунду);

М - молярность (моль на литр);

мл (ml) - миллилитр;

мМ (mМ) - миллимоль;

г (g) - грамм;

мг (mg) - миллиграмм;

мм (mm) - миллиметр;

мкл (μ l) - микролитр;

pI - изоэлектрическая точка;

Е или е - молярный десятиричный коэффициент экстинкции (М^-1см^-1);

С - молярная концентрация (М);

X - оптическая длина пути (см);

I_f - интенсивность флюоресценции (фотонов в секунду);

S_eff - эффективность рассеяния частицы;

C_abs - сечение поглощения (см²);

A_CSR - коэффициент сечения поглощения частицы по площади физического сечения частицы;

C_sca - сечение рассеяния (см²);

s_csr - коэффициент сечения рассеяния частицы по площади физического сечения частицы;

а - радиус частицы;

C_ext - сечение экстинкции рассеяния частицы (см²);

I - число фотонов в секунду, которые выходят из раствора после прохождения через толщину Х раствора;

N - концентрация частиц (частиц/см);

t - помутнение суспензии;

I_s - интенсивность рассеяния (фотонов/секунду);

n₂ - показатель преломления материала;

n₂Rel - реальная составляющая n₂;

n₂Im - мнимая составляющая n₂;

n₁ - показатель преломления среды;

m - отношение показателя преломления материала частицы к показателю преломления среды;

I₀ - длина волны падающего света (нм);

RI - коэффициент преломления;

Refmed - показатель преломления среды (n₁);

е_m - диэлектрическая постоянная среды;

n_m - показатель преломления среды;

а - определяет поляризуемость покрытой частицы;

нм (nm) - нанометр;

см (cm) - сантиметр;

мкм (μ ) - микрон.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение представляет способ для детектирования и измерения одного или более аналитов в образце. Способ основан на использовании некоторых специфических типов частиц с определенным составом, размером и формой и на детектировании и/или измерении одного или более свойств светорассеяния частиц.

Настоящее изобретение более удобное, имеет большую чувствительность и определенность и способно к детектированию и измерению в более широком диапазоне концентраций аналита(-ов), чем было возможно ранее. Настоящее изобретение имеет много преимуществ по сравнению с использованием способов усиления сигналов и увеличения аналитов, представляющих интерес (например, хемилюминесценция и цепная реакция полимеразы (PCR)), способов флюоресцентных меток и флюоресценции и известных способов анализа на основе частиц и рассеяния света. Способ разносторонний и имеет широкое применение к области диагностики, а также в других областях. Способ может использоваться в большинстве, если не во всех, стандартных типах анализа по методу пар связывания, таких как иммунологический анализ и нуклеиновокислотный анализ и т.п. для образцов в жидкой фазе, смешанной фазе, твердой фазе и форматах анализа микроматрицы твердой фазы.

Заявитель не просто иллюстрируют широкую применимость явными иллюстрациями каждого определенного практического использования конкретного вида изобретения, а скорее описывает ключевые элементы и соображения с тем, чтобы обычный специалист реализовал это изобретение, чтобы приспособить его к большинству, если не ко всем, потребностям детектирования аналитов. Такое практическое использование приводит к специфическому устройству и испытательным комплектам.

Раскрытие, представленное здесь, позволяет обычному специалисту практически применять настоящее изобретение во многих различных формах, чтобы достичь желательной способности аналита или детектирования частиц удовлетворять требованиям большинства, если не всех, типов образцов, типов аналитов, типов диагностического анализа и типов устройств. Настоящее изобретение настолько разностороннее, что оно может быть практически применяться для детектирования одного или более аналитов в полевых условиях (далеко от лаборатории) или в маленькой медицинской или аналитической лаборатории, при уходе за лежачим больным, в реанимации, в специализированных больничных блоках (таких как пункт кардиологической помощи, при интенсивной терапии, в травмапунктах и т.п.), в исследовательской лаборатории, или способно обрабатывать много образцов в день. Различные типы недорогого устройства и испытательных комплектов могут быть изготовлены путем реализации изобретения в том или другом виде, чтобы удовлетворять специфическим потребностям аналитической диагностики.

Имеются несколько аспектов изобретения, которые при реализации в различных комбинациях друг с другом определяют возможности детектирования аналитов для специфического практического применения изобретения. Два из этих аспектов представляют собой: (1) - использование специфических типов, частиц, которые обладают хорошими свойствами детектирования и измерения в рассеянном свете в определенном формате анализа и типе образца, и (2) - использование специфических типов частиц с предпочтительным способом DLASLPD освещения и детектирования. В некоторых применениях также используются способы повышения показателя преломления и способы DLASLPD повышения контраста изображения.

Определение полезных свойств светорассеяния металлоподобных частиц

Следующая глава обеспечивает информацию, полезную для полного понимания требуемого изобретения. Эти формулы полезны в практическом применении и оптимизации изобретения, но не признаются как прототипы заявленного изобретения.

При разработке новейшей системы генерации и детектирования сигналов для детектирования аналитов настоящего изобретения мы обнаружили, что нужно разрабатывать новые формулы, которые позволили нам оценивать различные неотъемлемые свойства светорассеяния различных типов частиц в терминах параметров флюоресценции. Это позволило нам изучать спектры квантового выхода - Qf, флюоресценции и возбуждения, зависимость испускаемой интенсивности света от угла наблюдения и состояния поляризации испускаемого света (они определены ниже). Эти новейшие формулы позволяют специалисту выбирать специфические параметры частиц, такие как состав, размер и форма, чтобы реализовать желаемое свойство(-ва) светорассеяния, которое может быть детектировано и измерено при использовании в диагностическом анализе или любом другом применении. Уравнения 1-7 представлены как информация уровня техники с тем, чтобы читатель понял новые формулировки уравнений 8-15. Это не должно восприниматься как допущение того, что любая из формул или описанных параметров светорассеяния уровня техники относится к формуле изобретения.

Заявитель разработал аналитический способ, основанный на некоторых модификациях известных в уровне техники теорий рассеяния света Рэлея и Ми, для оценки множества различных типов частиц с различными параметрами: размер, форма, состав и однородность для того, чтобы определить то, какие специфические конфигурации параметров частиц приводят к желательным сигналам светорассеяния, которые легко детектируются и измеряются в аналитическом и диагностическом анализе.

Определение параметров флюоресценции

Для флюоресцентных материалов интенсивность флюоресценции определяется произведением числа фотонов, которые поглощаются за секунду, и доли поглощенных фотонов, которые переизлучаются в виде света (Qf), как показано уравнением 1:

где I₀(λ ) - интенсивность падающего света (фотонов/ сек), λ - длина волны, e(λ ) - молярный десятиричный коэффициент экстинкции, выраженный в единицах М^-1см^-1 на длине волны λ , С - молярная концентрация (в единицах М) флюорофора и х - оптическая длина пути в см.

Интегральная интенсивность флюоресценции I(λ _f) (сумма фотонов, испускаемых во всех направлениях за секунду) на длине волны излучения λ _f и длине волны возбуждения λ _е дается выражением (для низких концентраций флюорофора)

Оценка полноценности флюоресцентного соединения в применении анализа в терминах перечисленных параметров - известная процедура. Использование флюоресцентных молекул и флюоресцентных методов ограничивается фотостабильностью флюоресцентной молекулы и способностью детектирования сигнала специфического флюоресцентного излучения в образцах с высокими уровнями неспецифической флюоресценции, фосфоресценции и рассеянного света. Для чувствительного детектирования флюоресцентных молекул или другого флюоресцентного вещества типа частиц, составленных из молекул флюоресцентного красителя, требуется более тонкая аппаратура.

Определение параметров рассеяния света.

Сечение (Cabs) поглощения частиц

Рассмотрим частицу, которая освещается монохроматическим лучом света с длиной волны λ . Сечение (C_abs) поглощения частицы определяется как площадь (обычно выражаемая в единицах измерения см² или мкм²), окружающая частицу так, что любой фотон, падающий на эту площадь, будет необратимо поглощаться частицей. Значение C_abs зависит от размера частицы, состава, формы и однородности. Оно также зависит от длины волны света, и зависимость сечения C_abs от длины волны дает чистый спектр поглощения частицы. Зависимость C_abs от параметра длины волны для любой сферической частицы с однородным составом может быть рассчитана с помощью теорией Ми или Рэлея. В нашей терминологии C_abs относится с необратимому поглощению света. Природа C_abs может быть лучше понята в следующей главе, где мы определяем сечение экстинкции C_ext.

Относительное сечение поглощения A_csr

Относительное сечение поглощения A_csr определяется как отношение сечения поглощения C_abs частицы к площади физического сечения частицы π а², где а - радиус частицы, то есть A_csr=C_abs/π a² обеспечивает меру способности частицы к необратимому поглощению фотонов, падающих на площадь, окружающую частицу. A_csr может иметь значения в диапазоне от 0 до 6 в зависимости от состава, формы и размера частицы и длины волны света. Значение больше единицы означает, что частица должна достичь размера сверх физических размеров, чтобы притягивать к себе фотоны и поглощать их. В физической литературе A_csr называется коэффициентом эффективности поглощения частицы. Эта спецификация вводит в заблуждение, поскольку A_csr может иметь значения более 1, нехарактерные для эффективности.

Сечение (C_sca) рассеяния света частицей

Имеется конечная вероятность того, что фотон света, поглощенный (под словом поглощенный здесь подразумевается обратимое и необратимое поглощение) рассеивающей частицей, переизлучается на той же самой длине волны, что и поглощенный фотон (с точки зрения квантовой механики). Переизлучаемый фотон может испускаться в направлениях, отличающихся от направления падающего фотона. То есть падающие фотоны рассеиваются посредством поглощения и переизлучения. Сечение рассеяния частицы (С_sса) на длине волны падающего света определяется как площадь, окружающая частицу так, что каждый фотон, который падает на ту площадь, рассеивается (который поглощается и затем переизлучается с точки зрения квантовой механики). Величина C_sca обычно выражается в единицах измерения см² или мкм² и зависит от состава, формы, размера и однородности частицы и длины волны. График светорассеяния C_sca от длины волны может быть рассчитан для любой сферической частицы однородного состава, используя теорию Ми или Рэлея.

Отношение сечения C_sca рассеяния к площади физического или геометрического сечения (С_sсr) частицы

Отношение сечения C_sca рассеяния частицы к площади физического или геометрического сечения частицы π а² (где а - сферический радиус частицы) обеспечивает меру способности частицы притягивать, поглощать и переизлучать фотоны с площади, окружающей частицу. То есть S_csr=C_sca/π a². В физической литературе S_car называется коэффициентом эффективности рассеяния.

Экспериментальные и теоретические результаты показывают, что значение C_csr может лежать в диапазоне от 1 до 5 или больше в зависимости от состава частицы, формы, однородности, размера и длины волны света. Значение S_csr больше единицы означает, что частица должна достичь размера сверх физических размеров, чтобы притягивать к себе фотоны и поглощать их и потом переизлучать их. Это возможно, потому что электрическое взаимодействие частицы с электромагнитной волной фотона может происходить на расстояниях, больших, чем радиус частицы. Вообще, S_csr увеличивается с размером частицы. Для маленьких частиц (менее 40 нм) S_csr меньше единицы, в то время как для больших частиц S_csr составляет больше единицы и может достигать значения пять для больших частиц.

Сечение (C_ext) экстинкции частицы

Сечение экстинкции C_ext светорассеивающей частицы определяется как сумма сечения рассеяния (C_sca) и сечения поглощения (С_abs) частицы.

C_ext обычно выражается в единицах см² или мкм².

Сечение экстинкции C_ext любой частицы может быть легко измерено на любой данной длине волны в обычном абсорбционном спектрометре. Допустим I₀ (фотонов/сек) - интенсивность светового луча, падающего на суспензию частиц, которые имеют концентрацию N частиц/см³. Величина Х (см) - толщина раствора и I (фотонов/сек) - количество света, которое выходит из раствора после прохождения расстояния х. Интенсивность связана с сечением экстинкции C_ext выражением:

Это выражение показывает простую зависимость параметров от длины волны λ . Предполагается, что фотодетектор расположен так, что он не детектирует рассеянный свет.

Когда частицы чистые рассеиватели, то есть не поглощают необратимо любой свет, тогда C_ext=С_sca и вышеупомянутое уравнение запишется как

где τ =N C_sca является помутнением суспензии.

Молярный десятиричный коэффициент экстинкции

В области химии интенсивность, с которой вещество в растворе поглощает свет на данной длине волны, выражается в терминах молярной десятиричной экстинкции е, которая имеет единицы измерения М^-1см^-1 (М означает моль/литр). Этот коэффициент связан с экспериментально определенным поглощением света выражением

Формулы, выведенные заявителем для изучения параметров светорассеяния частицы

Заявитель теперь кратко представляет свои собственные теоретические способы. Специалист может использовать следующие способы для оценки, модификации и регулирования специфических параметров частиц, таких как состав, размер, форма и однородность, с целью получения одного или более желаемых свойств светорассеяния, которые легко детектируются и измеряются. Должны учитываться типы образцов, диагностические форматы и ограничения средства устройства. Например, в одном применении многоаналитное детектирование может выполняться на твердофазном образце, который имеет высокий неспецифический световой фон на испытательном устройстве с высокой пропускной способностью, в то время как в другом применении детектирование единичного аналита в растворе выполняется в медицинском учреждении.

Главный интерес заявителя состоял в оптимизации типов частиц для использования в аналитическом и диагностическом анализе. В большинстве этих применений частицы должны быть покрыты макромолекулярным веществом типа полимера, протеина или чего-то подобного для того, чтобы придать различным средам подходящую химическую стабильность. Этот прием известен в технике. Заявитель также располагает связующие агенты типа антител, рецепторов, пептидов и т.п. на поверхности частицы так, чтобы покрытая частица могла использоваться в аналитическом или диагностическом формате. В некоторых применениях связующий агент выполняет двойную функцию, состоящую в том, что он стабилизирует частицу в растворе и обеспечивает распознавание специфической связующей составляющей для связи с аналитом. Покрытие частиц протеинами типа антител известно в технике. Однако заявителя заинтересовало измерение одного или более специфических параметров сигналов светорассеяния различных типов частиц, которые в некоторых случаях имели подобный размер и/или форму и/или состав, и было непонятно, почему была возможна такая оптическая разрешающая способность одного или более специфических свойств светорассеяния покрытых частиц.

Посредством физического экспериментирования и теоретического моделирования заявитель определил, что присутствие тонких покрытий связующих агентов, оптически не поглощающих полимеров (в видимой области спектра) или других материалов на поверхности частицы заметно не изменяет свойства светорассеяния, характерные для того типа частицы, которая не покрыта этими типами материалов. Под "тонким покрытием" подразумевается монослой (монослои) с различным количеством и составом вышеупомянутых материалов, покрывающих поверхность частицы.

Заявитель определил, что молярный десятиричный коэффициент экстинкции может быть определен на любой длине волны для суспензии покрытой или непокрытой частицы посредством измерения ее поглощения на этой длине волны. Молярный десятиричный коэффициент экстинкции на этой длине волны можно затем вычислить с помощью уравнения (7) и следующего выражения, которое преобразует концентрацию частицы из размерности N (частиц/см³) в размерность С (М). Величина М означает моль/литр.

Молярный десятиричный коэффициент экстинкции может быть связан с сечением C_ext экстинкции (или наоборот) выражением:

или

С помощью уравнений (9) или (10) мы можем вычислить е из C_ext.

Как описано выше, из уровня техники известно, что для частиц сечение (C_ext) экстинкции равно сумме сечения (C_sca) рассеяния и сечения (C_abs) поглощения. Коэффициент экстинкции е отображает потерю фотонов падающего луча света за счет необратимого поглощения, а также за счет рассеяния (поглощение и переизлучение). Заявитель определил, что молярный десятиричный коэффициент экстинкции частицы, оцененный экспериментально или вычислением из сечения экстинкции, может использоваться для сравнения поглощающей способности частицы, например, с поглощающей способностью флюорофора, как показано в дальнейшем.

Эффективность рассеяния света (S_eff)

Заявитель определил, что эффективность светорассеяния S_eff может быть определена для покрытой или непокрытой частицы по аналогии с эффективностью флюоресценции Qf как доля тех поглощенных частицей фотонов (обратимое плюс необратимое поглощение), которые переизлучаются в виде рассеянного света. Математически заявитель определяет эффективность рассеяния выражением

Для частиц, которые являются чистыми рассеивателями, то есть частицы составлены из материала, который не поглощает фотоны необратимо, а только поглощает и переизлучает фотоны, C_abs равно нулю и S_eff равно единице. Маленькие частицы полистирола ведут себя как чистые рассеиватели света в видимой области спектра и S_eff равно 1 для этих частиц. Для частиц, составленных из материалов, которые обратимо и необратимо поглощают фотоны, S_eff меньше единицы. Золотые частицы проявляют последний тип поведения в видимой области спектра.

Интенсивность света, рассеянного частицей

Заявитель определил, что интенсивность света, рассеянного покрытой или непокрытой частицей, может определяться произведением числа фотонов, которые поглощаются за секунду (обратимо и необратимо), и доли поглощенных фотонов, которые переизлучаются (с точки зрения квантовой механики). Измерения интенсивности рассеяния света обычно выполняются в разбавленных растворах, где количество поглощенного света, I_abs (фотоны, поглощенные за секунду) дается выражением

I₀ - интенсивность падающего света (фотоны/сек), е - молярный десятиричный коэффициент экстинкции частиц в терминах М^-1см^-1, С - молярная концентрация частиц и х- оптическая длина пути в см.

Заявитель также понимает, что полная интенсивность рассеянного света I_s - это интенсивность, интегрированная по всем углам светорассеяния, которая тогда дается отношением

где I₀₍λ ₎ является интенсивностью падающего света. Это уравнение сопоставимо с уравнением (2) для флюорофора.

Заметим, что, когда выражения для е и S_eff в терминах C_sca и C_ext вставляются в вышеупомянутое уравнение, результат показывает, что интенсивность рассеянного света прямо пропорциональна и полностью определяется величиной сечения (C_sca) рассеяния. Это означает, что относительные интенсивности рассеяния различных частиц можно прогнозировать из их сечений рассеяния.

Специфические свойства светорассеяния частиц

Заявитель теперь коротко резюмирует некоторых из наиболее важных свойств светорассеяния, которые могут использоваться для детектирования аналитов в образцах различного типа с использованием множества различных типов анализа. Измеренные свойства светорассеяния, которые детектируются, представляют собой одно или более из следующих: интенсивность, длина волны, цвет, поляризация, угловая зависимость и RIFSLIW (отдельные ротационные флюктуации в интенсивности и/или длинах волн рассеянного света) рассеянного света.

Покрытые и непокрытые металлоподобные частицы имеют схожие свойства светорассеяния и имеют превосходные свойства светорассеяния по сравнению с неметаллоподобными частицами. Кроме того, заявитель определил, что относительно легко регулировать типы свойств светорассеяния в металлоподобных частицах, варьируя в том или ином виде: размер, форму, состав и однородность, так что специфические неотъемлемые признаки светорассеяния могут быть измерены для металлоподобной частицы в различных типах образцов.

Металлоподобные частицы могут детектироваться до чрезвычайно высокой чувствительности. Отдельные частицы легко детектируются до предела единичной частицы с использованием способов DLASLDP освещения и детектирования и недорогого и удобного устройства.

Один или более типов металлоподобных частиц детектируются в образце путем измерения их цвета под белым светом или подобным широкополосным освещением с помощью способов типа DLASLDP освещения и детектирования. Например, явно сферические золотые частицы (например, покрытые связующим агентом, связанные с аналитом, выпущенные в раствор или связанные с твердой фазой) диаметром 40, 60 и 80 нм и серебряная частица диаметром приблизительно 30 нм могут легко детектироваться и количественно определяться в образце путем распознавания каждого типа частицы по их соответствующему уникальному цвету рассеянного света и/или путем измерения интенсивности. Это может быть выполнено на твердой фазе, такой как лунка планшета для микротитрования, или элемент микроматрицы, или в растворе. Измерение в растворе более распространено, потому что частицы пространственно не различаются, как в формате твердой фазы. Например, можно детектировать различные типы частиц в растворе, заставляя протекать раствор мимо ряда детекторов, каждый из которых настроен так, чтобы измерять различные длины волн или диапазон цветов и измерять интенсивности на различных длинах волн. Альтернативно, чтобы детектировать различные типы частиц, можно использовать ряд различных длин волн освещения и/или детектирования с или без проточной системы.

В случае твердофазных аналитических применений можно детектировать очень широкий диапазон концентраций металлоподобных частиц путем переключения с режима подсчета частиц на режим измерений интегральной интенсивности света в зависимости от концентрации частиц. Частицы можно детектировать от очень низких до очень высоких плотностей частиц на единицу площади.

В других применениях анализа частицы, которые связаны с твердой подложкой, такой как гранула, или с поверхностью, такой как дно лунки для микротитрования или с чем-то подобным, могут быть выпущены в раствор посредством регулировки показателя рН, ионной силы или других жидких свойств. Могут быть добавлены жидкости с более высоким показателем преломления, и тогда свойства светорассеяния частиц измеряются в растворе. Подобным образом частицы в растворе могут быть сконцентрированы различными средствами в маленький объем или площадь перед измерением свойств светорассеяния. Снова перед измерением могут быть добавлены жидкости с более высоким показателем преломления.

И теоретическая оценка и физическое экспериментирование показывают, что для сферических частиц любого состава диаметром приблизительно до 120 нм и несколько больше большая доля света, рассеянного частицей, излучается вне огибающей интенсивностей прямого направления рассеянного света (см. фиг.8). Заявитель определил, что детектирование и измерение рассеянного света под углами вне огибающей интенсивностей прямого направления рассеянного света обеспечивает существенное уменьшение неспецифического рассеянного света от светового луча и других составных частей светорассеяния и детектируемых объектов. Это значительно увеличивает отношение "сигнал специфического рассеяния света/неспецифическое рассеяние света" для многих образцов.

Интенсивность света, рассеянного частицей в различных направлениях, и состояние поляризации рассеянного света зависят от длины волны и состояния поляризации падающего света и от размера, формы и однородности частицы. Ниже мы резюмируем некоторые из наиболее важных фактов, имеющих отношение к интенсивности и состоянию поляризации света, испускаемого в различных направлениях частицами некоторых типов.

Меньшие частицы сферической формы (под меньшими подразумевается 1/20 от длины волны света или меньше) ведут себя как изотропные дипольные рассеиватели или излучатели, то есть свет в высокой степени поляризован. Это сильно отличается от флюоресцентных молекул, которые обычно ведут себя как линейные дипольные излучатели. Например, когда такие частицы освещаются неполяризованным светом, свет, рассеянный в направлении φ =0, Θ =90 (см. фиг.20), линейно поляризован на сто процентов (Р=1). Это свойство обеспечивает возможность более определенного и более чувствительного детектирования аналитов посредством измерения свойств светорассеяния по сравнению с флюоресцентными молекулами в образцах многих различных типов.

Для больших частиц (>1/20 длины волны света) имеются некоторые диапазоны размеров частиц, где степень поляризации света Р уменьшается и по мере увеличения размера становится зависящей от длины волны. По мере того как частицы становятся очень большими, степень поляризации приближается к 0 для направления Θ =0, φ =90° . Оказывается, что имеются некоторые диапазоны размеров, где изменения поляризации наибольшие, то есть падение степени поляризации в зависимости от размера максимально. Те области, где падение изменяется, используются в некоторых аналитических применениях, например типы анализа - агглютинация (слипание) или агрегация (скопление), чтобы детектировать и измерять один или более аналитов в образце.

Для больших сферических частиц в некоторых диапазонах размеров, например диаметром приблизительно от 200 нм до 1.2 микрон, интенсивность света колеблется (для монохроматического падающего света) между относительными значениями от 1 до 0, по мере изменения угла φ от 90° до -90° для Θ =0 (см. фиг.20). То есть если рассматривать рассеянный свет в горизонтальной плоскости (Θ =0), то интенсивность света колеблется от яркого до темного по мере того, как глаз перемещается от угла φ =90° до φ =-90° . Для освещения белым светом свет изменяет цвет по мере того как глаз перемещается от φ =90° до φ =-90° . То есть частицы ведут себя как дифракционные решетки. Такие свойства светорассеяния очень полезно детектировать с большей определенностью и с большей чувствительностью для одного или более аналитов в многих различных типах образцов.

Маленькие несферические частицы ведут себя до некоторой степени как линейные дипольные рассеиватели с поглощательным и излучательным моментами по продольной оси частицы. При условиях освещения и детектирования DLASLPD в обычном оптическом микроскопе заявитель наблюдал следующее. Когда свет от осветителя линейно поляризован, несферические частицы мерцают при вращении. Частицы наиболее интенсивны, когда их ориентация такова, что их продольная ось ориентируется в направлении поляризации, и интенсивность минимальна, когда момент перпендикулярен этому направлению. Напротив, маленькие сферические частицы не мерцают при освещении поляризованным светом. Для несферических частиц некоторого состава цвет рассеянного света (при освещении белым светом) изменяется со степенью асимметрии. По мере увеличения асимметрии цвет сдвигается в длинноволновую область. Например, заявитель наблюдал, что асимметричные серебряные частицы изменяют цвет по мере вращения частиц в растворе при рассмотрении с обычным оптическим микроскопом при условиях, подобных DLASLPD. Это свойство, названное заявителем "RIFSLIW " (отдельные ротационные флюктуации в интенсивности и длинах волн рассеянного света), используются во многих различных аспектах настоящего изобретения для более определенного и более чувствительного детектирования и/или измерения одного или более анализов или частиц в образце.

Заявитель также определил, что некоторые смешанные составы частиц, сделанных от металлоподобных материалов, и составы неметаллоподобных и металлоподобных материалов обеспечивают дополнительные свойства светорассеяния и/или дополнительные физические свойства. Эти свойства включают способность управлять частицами путем прикладывания электромагнитного поля. Это свойство частиц может использоваться многими различными способами с практическим применением одного или более аспектов этого изобретения. Заявитель теперь обеспечивает дальнейшие иллюстративные обсуждения свойств светорассеяния, зависящих от частиц, и использования этих свойств для детектирования одного или более аналитов в образце.

Будет полезно сначала описать настоящее изобретение в терминах свойств светорассеяния однородных, сферических частиц различных размеров и составов. Однако, как может понять специалист, основные аспекты изобретения также применимы к несферическим частицам. Кроме того, будет полезно описать настоящее изобретение в терминах длин волн падающего света в диапазоне 300 - 700 нм. Однако основные аспекты изобретения одинаково применимы также к электромагнитному излучению по существу всех длин волн. Под "светом" подразумевается ультрафиолетовая, видимая, ближняя инфракрасная, инфракрасная области и микроволновые частоты электромагнитного излучения. Для описания настоящего изобретения будет также полезно использовать частицы полистирола, чтобы представить неметаллоподобные частицы различных типов. Другие неметаллоподобные типы частиц включают частицы, составленные из стекла и многих других полимерных составов. Такие частицы имеют в грубом приближении подобные характеристики светорассеяния по сравнению с частицами полистирола.

Относительные интенсивности рассеянного света, полученного от различных частиц, освещенных с одинаковой интенсивностью и длинами волны падающего света, могут непосредственно сравниваться путем сравнения их сечений рассеяния C_sca. Чем выше C_sca, тем больше рассеивающая способность (интенсивность светорассеяния) частицы. В следующих разделах мы используем слова "рассеивающая способность" для обозначения C_sca или интенсивности светорассеяния.

Мы вычислили светорассеивающие способности маленьких сферических частиц, находящихся в воде, идентичных по размеру, но разных по составу, для падающего света с длинами волн в диапазоне длин волн от 300 до 700 нанометров (нм). В этих вычислениях мы использовали значения показателя преломления в вакууме в зависимости от длины волны, сведенных в таблицу в стандартных справочниках для различных веществ.

Для некоторых составов частиц светорассеивающая способность уменьшается непрерывно от 300 до 700 нм, в то время как для других составов рассеивающая способность в зависимости от длины волны проявляет пики или полосы. Когда эти пики или полосы находятся в видимой области спектра, то свет, рассеянный частицами, окрашивается, если падающий свет - белый.

Для иллюстрации мы показываем в некоторых из следующих таблиц результаты различного сравнения свойств светорассеяния для различных типов частиц диаметром 10 нм. Общие тенденции, касающиеся относительных интенсивностей и длин волн рассеянного света, которые демонстрируются для этих частиц диаметром 10 нм, в основном такие же, как для больших частиц приблизительно до 100 нм. Например, вычисления таблицы 1 были выполнены с частицами диаметром десять нанометров. Однако для маленьких частиц (менее 1/20 длины волны света) форма зависимости интенсивности светорассеяния от длины волны не изменяется с увеличением размера частицы до тех пор, пока размеры частиц остаются в пределах размеров маленьких частиц. Очевидный эффект увеличения размера частицы состоит в увеличении амплитуды графика зависимости. Из теоретической физики рассеяния света хорошо известно, что рассеивающая способность маленьких частиц увеличивается в шестой степени радиуса. Специалист может вычислять относительную рассеивающую способность любой маленькой частицы диаметром d из значения, полученного для частицы диаметром 10 нм, путем умножения рассеивающей способности частицы диаметром 10 нм на множитель (d/10)⁶, где d - в нм. Этот способ может использоваться специалистом для определения применимости некоторых размеров частиц в различных применениях диагностического анализа, в которых интенсивность рассеянного света частицы используется для детектирования присутствия аналита.

Из нашего теоретического и физического экспериментирования мы с удивлением обнаружили, что эти общие зависимости также применимы к большим частицам вне предела Рэлея, то есть для частиц с диаметрами приблизительно более 30 нм.

Таблица 1 представляет расчетные значения C_sca (светорассеивающая способность) и их соответствующие приблизительные длины волн в видимом диапазоне, где частицы рассеивают свет более интенсивно. Данные таблицы 1 дают основание полагать, что металлоподобные частицы намного более мощные рассеиватели света чем, например, частицы полистирола.

Фиг.26 изображают выбранные расчетные графики зависимости интенсивности светорассеяния от длины волны для некоторых типов сферических частиц диаметром 10 нм. Маленькие частицы, составленные из золота или серебра, проявляют очень четкие пики рассеяния и поглощения в видимой области длин волн, в то время как медные частицы проявляют маленький пик рассеяния и поглощения в этой области. Максимумы рассеянного света для золота и серебра имеются на длинах волн приблизительно 530 нм и 380 нм соответственно. Даже если длины волн падающего света сильно удалены от максимумов светорассеяния, светорассеивающая способность золота, серебра и других металлоподобных частиц намного больше способности неметаллоподобных частиц полистирола подобного размера.

Таблица 2 представляет расчетные значения светорассеивающей способности (C_sca) для металлоподобных частиц и полистирола (неметаллоподобного) диаметром 10 нм, когда длина волны падающего света (освещение) была смещена в сторону намного больших длин волн. Во многих различных применениях аналитического и диагностического анализа предпочтительно работать в более длинноволновой области. Таблица 2 показывает, что специалист может использовать длины волн освещения в более длинноволновой области и что металлоподобные частицы намного превосходят неметаллоподобные частицы, такие, как например полистирол, для применений к аналитическим или диагностическим способам. Например, при длине волны падающего света 700 нм, т.е. длине волны, далекой от максимума светорассеяния, составляющей 530 нм для золотых частиц, данные дают основание полагать, что интенсивность рассеянного света золотой частицы приблизительно в 220 раз больше, чем частицы полистирола подобного размера и формы. Мы экспериментально наблюдали, что действительно светорассеивающая способность (интенсивность) металлоподобных частиц намного больше, чем неметаллоподобных частиц во всей видимой области спектра.

Эти результаты указывают, что металлоподобные частицы имеют намного большую светорассеивающую способность, чем неметаллоподобные частицы сопоставимого размера и формы и широко применимы в качестве аналитических и диагностических индикаторов для использования в большинстве областей, где желательно использовать систему генерации и детектирования сигнала. Например, в любом анализе, разработанном с целью детектирования присутствия или отсутствия вещества аналита посредством детектирования рассеянного света от частиц.

Таблица 1

Вычисленные значения (C_sca) сферических частиц диаметром десять нанометров различного состава, находящихся в воде

Состав частиц	Длины волн (нм)(а)	Максимальное Csca (см2)	Относительное Csca
Полистирол	300	1.32× 10-17	1
Селен	300	8.6× 10-16	~65
Алюминий	300	1.95× 10-15	~148
Медь	300	7.8× 10-16	~59
Золото	530(б)	1.24× 10-15	~94
Серебро	380(б)	1.1× 10-14	~833

(а) Длина волны падающего света, которая используется и на которой встречается максимальное значение в видимом диапазоне электромагнитного спектра (300-700 нм).

(б) Некоторые частицы проявляют пики в некоторых областях. См. фиг.27.

Таблица 2

Расчетные значения (C_sca) при длине волны освещения 700 нм для сферических частиц диаметром десять нанометров различного состава, находящихся в воде

Состав частиц	Длина волны падающего света (нм)	Максимальное Csca (см2)	Относительное Csca
Полистирол	700	~3.1× 10-19	1
Селен	700	~1.4× 10-17	~45
Алюминий	700	1.4× 10-17	~45
Медь	700	4.7× 10-17	~152
Золото	700	7× 10-l7	~225

Таблица 3 показывает сравнение молярных десятиричных коэффициентов экстинкции (e), вычисленных и экспериментально измеренных для сферических золотых частиц различного диаметра.

Мы вычислили значения e на длине волны максимального значения, используя предварительно описанные выражения. Измеренные значения е были получены путем измерения оптического поглощения в стандартном спектрофотометре на расчетной длине волны максимального поглощения. Согласие между расчетными и экспериментально измеренными значениями е хотя и не точное, но в то же время достаточно хорошее. Приблизительно удвоенные разности, полученные между наблюдаемыми и расчетными результатами, могут отражать погрешности в заявленных диаметрах золотых частиц. Детали экспериментальных способов приводятся в разделе примеров.

Таблица 3

Расчетные и измеренные молярные десятиричные коэффициенты экстинкции и длины волн максимального поглощения для золотых частиц различного размера, находящихся в воде

	Расчетные(б)	Измеренные(б)
Диаметр частицы а,б	е (М-1см-1)	Длина волны в максимуме поглощения	е (М-1см-1)	Длина волны в максимуме поглощения
10 нм	1.8× 108	~530 нм	2.3× 108	~525 нм
16 нм	9× 108	~530 нм	5.2× 108	~522 нм
20 нм	1.8× 109	~528 нм	1.2× 109	~525 нм
40 нм	1.6× 1010	~532 нм	8.5× 109	~528 нм
60 нм	5.6× 1010	~542 нм	2.6× 1010	~547 нм
80 нм	1.1× 1011	~550 нм	5.8× 1010	~555 нм
100 нм	1.6× l011	~574 нм	9.2× 1010	~575 нм

(а) Обозначает точный диаметр частицы для расчетных значений.

(б) Обозначает приблизительный диаметр золотых частиц, используемых для измерений. Фактические диаметры были незначительно выше или незначительно ниже указанных диаметров.

На длинах волн падающего света видимого диапазона светорассеивающая способность (то есть C_sca) металлоподобных частиц намного больше, чем для сопоставимых неметаллоподобных частиц типа полистирола. Другое важное различие между свойствами светорассеяния металлоподобных и неметаллоподобных частиц состоит в том, что для металлоподобных частиц зависимость интенсивности рассеянного света от длины волны падающего света для металлоподобных частиц того же состава, но изменяющегося размера может быть очень различна. Это отличается от неметаллоподобных частиц, для которых в диапазонах диаметров приблизительно от 10 нм до нескольких сотен нанометров зависимость, по существу, одинаковая. Эти отличия чрезвычайно полезны для более определенного и более чувствительного детектирования металлоподобных частиц в различных образцах. Длина волны падающего света, на которой проявляется максимальное светорассеяние (C_sca) для частиц различного диаметра из серебра, золота, меди и алюминия, представлена в таблице 4.

Фиг.16 изображает экспериментально измеренную интенсивность рассеянного света в зависимости от длины волны падающего света для явно сферических золотых частиц диаметром 100 нм, покрытых соединением полиэтилена (молекулярный вес = 20000) и без соединения полиэтилена. Данные показывают, что зависящие от длины волны свойства интенсивности светорассеяния покрытых и непокрытых золотых частиц диаметром 100 нм очень схожи.

Фиг.27 изображает спектры интенсивности рассеянного света в зависимости от длин волн падающего света для сферических золотых частиц изменяющегося диаметра. По мере увеличения размера золотых частиц, длины волн пика интенсивности рассеянного света смещаются в более длинноволновую область. Мы непосредственно наблюдали эти свойства светорассеяния для покрытых или непокрытых золотых частиц с диаметрами 40, 60 80, 100 нм, и они проявляются как зеленые, желто-зеленые, оранжевые и оранжево-красные частицы при освещении источником белого света в растворе или в оптическом микроскопе с использованием способов освещения DLASLPD. Маленькие сферические серебряные частицы кажутся синими. Таким образом, металлоподобные частицы, покрытые различными типами связующих веществ, могут использоваться многочисленными способами в анализе аналитического типа. Цветовые свойства рассеянного света различных типов металлоподобных частиц обеспечивают возможность многоаналитного визуального детектирования. Например, сферические золотые частицы диаметром 40, 60, 80 и 100 нм и серебряные частицы диаметром 20 нм, каждая из которых покрыта связующим веществом различного типа, могут использоваться в том же самом образце, чтобы детектировать в нем пять различных аналитов. В одном формате могут быть обнаружены и визуализированы пять различных типов рецепторов поверхности клетки или других поверхностных образований, находящихся на поверхности клетки. Детектирование цвета рассеянного света по-разному покрытых частиц, которые привязаны к поверхности клетки, при условиях DLASLPD с оптическим микроскопом с освещением белым светом, делает это возможным. Число и типы аналитов идентифицируются по числу зеленых, желтых, оранжевых, красных и синих детектируемых частиц. Аналогично, хромосомный и генетический анализ, например, на месте гибридизации и т.п. также может быть выполнен с использованием вышеописанного способа, в котором различные типы металлоподобных частиц используются в качестве "окраски хромосомы" для идентификации различных типов нуклеиново-кислотных последовательностей, нуклеиново-кислотных связующих протеинов и других подобных аналитов в образце посредством цвета света, рассеянного от различных типов металлоподобных частиц. Эти примеры представлены в качестве иллюстративных примеров, и специалисту должно быть понятно, что цвет рассеянного света от различных типов металлоподобных частиц может использоваться во многих различных типах анализа для одноаналитного или многоаналитного детектирования.

Таким образом, регулировка размеров некоторых типов сферических металлоподобных частиц - приемлемый способ увеличить их обнаружимость в различных образцах, используя цвет и/или другие свойства их рассеянного света. С использованием источника белого света два или более различных типов частиц легко обнаружимы до очень низких концентраций.

Таблица 5 изображает, что небольшие увеличения размера золотой частицы приводят в результате к большому увеличению светорассеивающей способности частицы (С_sса). Длина волны падающего света для максимума С_sса значительно увеличивается с размером частицы и величина интенсивности рассеянного света значительно увеличивается. Например, длина волны падающего света для максимума C_sca составляет около 535 нм, 575 нм и 635 нм для золотых частиц диаметром 40 нм, 100 нм и 140 нм соответственно. При освещении белым светом золотые частицы диаметром 40 нм сильно и преимущественно рассеивают свет на длине волны около 535 нм, и частицы кажутся зелеными, в то время как частицы диаметром 100 нм кажутся оранжево-красными и частицы диаметром 140 нм кажутся красного цвета. Это дополнительно показывает, что при освещении белым светом некоторые металлоподобные частицы идентичного состава, но различного размера могут различаться друг от друга в одном образце по цвету рассеянного света. Относительная величина интенсивности рассеянного света может быть измерена и может использоваться вместе с цветом или зависимостью длины волны рассеянного света для детектирования различных частиц в одном образце с большей определенностью и чувствительностью даже в образцах с высоким не специфическим световым фоном.

Наоборот, что касается неметаллоподобных частиц, они не обладают этими специфическими типами свойств светорассеяния и, таким образом, в большинстве типов сред образцов неметаллические частицы труднее детектировать по сравнению с металлоподобными частицами.

Таблица 4

Расчетная длина волны падающего света в видимой области, на которой наблюдается максимум C_sca в воде

Материал частицы	Диаметр частицы	Длина волны падающего света, на которой наблюдается максимум Csca
Серебро	10	~380 нм
	40 нм	~400 нм
	100 нм	~475 нм
Золото	10 нм	~528 нм
	40 нм	~535 нм
	100 нм	~575 нм
	140 нм	~635 нм
Медь	100 нм	~610нм
	150 нм	~644 нм
Алюминий	100 нм	~377 нм
Селен	130 нм	~660 нм
	200 нм	~702 нм

Таблица 5

Расчетные значения характеристик светорассеяния сферических золотых частиц различных размеров

Диаметр частицы (нм)	Длина волны в максимуме Csca (нм)	Максимум Csca (см2)	Расчетная относительная рассеивающая способность
10	~528	1.26× 10-13	1
20	~525	8.4× 10-14	67.5
30	~530	1.03× 10-12	817
40	~535	6× 10-12	4.8× 103
60	~545	6.3× 10-11	5× 104
80	~555	2.3× 10-10	1.8× 105
100	~575	4.6× 10-10	3.6× 105
120	~605	6.9× 10-10	5.5× 105
140	~635	8.8× 10-10	7× 105
160	~665	1× 10-9	7.9× 105
200	~567	1.4× 10-9	1.1× 106
300	~670	2.9× 10-9	2.3× 106
600	~600	1.01× 10-8	8× 106
1000	~620	2.5× 10-8	1.8× 107
1000	~670	2.5× 10-8	1.8× 107

Относительные светорассеивающие способности частиц одинаковой формы и размера, но различного состава могут непосредственно сравниваться экспериментально путем сравнения интенсивностей светорассеяния под прямыми углами к направлению падающего света. Мы экспериментально сравнили относительные рассеивающие способности золотых и полистироловых частиц подобного размера и формы, используя светорассеивающий прибор, который мы построили, разработанный для измерения рассеянного света под прямыми углами к направлению падающего света и который описан в другом месте.

Таблица 6 показывает, что экспериментально измеренная рассеивающая способность частицы, составленной из золота, намного больше рассеивающей способности частицы, составленной из полистирола, когда оба типа частиц сравниваются на той же самой длине волны падающего света в видимой области. Экспериментально измеренные значения таблицы 6 в два - три раза ниже, чем расчетные значения. Большая часть этой разности может быть приписана приблизительно вдвое более низким значениям, полученным для экспериментально измеренных молярных десятиричных коэффициентов экстинкции золотых частиц относительно расчетных значений (см. таблицу 3). Кроме того, имеется некоторый уровень неопределенности в размерах частиц (например, что касается препарата частиц полистирола диаметром 21±1.5 нм, фактический размер мог бы быть приблизительно на 1.5 нм больше или меньше). Эта неопределенность делает количественные значения менее определенными как для полистирола, так и для золотых частиц, но не изменяет основное заключение, касающееся относительных рассеивающих способностей. Даже при самом высоком уровне неопределенности таблица 6 показывает, что, как минимум, рассеивающая способность золотой частицы в 100-200 раз больше рассеивающей способности частицы полистирола сопоставимого размера и формы.

Таблица 7 сравнивает относительную светорассеивающую способность сферических золотых и полистироловых частиц подобного размера и формы на различных длинах волн видимой области. Таблица 7 показывает, что даже на длинах волн освещения, далеких от длины волны максимальной интенсивности светорассеяния, светорассеивающая способность золотой частицы намного больше способности частицы из полистирола сопоставимого размера и формы. Эти экспериментальные результаты согласуются с нашими расчетными результатами (см. таблицу 2).

Таблица 8 показывает, что экспериментально определенная светорассеивающая способность сферических золотых частиц намного больше, чем у сопоставимых частиц полистирола при использовании условий освещения белым светом от лампы накаливания.

В целом, согласие между нашими расчетными и экспериментально определенными результатами, представленными здесь, достаточно хорошее. Это подтверждают расчетные результаты, а также использование процесса вычисления для идентификации потенциально полезных материалов и составов частицы и для оценки применимости свойств светорассеяния таких частиц. Для освещения можно использовать большинство типов источников света, которые производят немонохроматический и/или монохроматический свет, непрерывный и/или импульсный свет, когерентный или некогерентный свет. Наши результаты показывают, что от металлоподобных частиц могут быть получены более специфические и более интенсивные сигналы светорассеяния по сравнению с неметаллоподобными частицами сопоставимого размера и формы. Наши результаты показывают, что настоящее изобретение обеспечивает средство для детектирования меньших количеств частиц и для более определенного детектирования меньших и больших количеств частиц, чем было возможно ранее.

Таблица 6

Вычисленные и измеренные относительные рассеивающие способности в воде полистироловых и золотых частиц подобного размера и формы на длине волны падающего света, при которой наблюдается максимум рассеяния для золотых частиц

Состав частиц	Размер частиц (б)	Длина волны падающего света	Относительная рассеивающая способность (а) расчетная измеренная
PST	21±1.5 нм	~525 нм	1	1
Золото	19.8±<1.9 нм	~525 нм	~664	~220
PST	32±1.3 нм	~527 нм	1	1
Золото	29.5±<3.5 нм	~527 нм	~663	~318
PST	41±1.8 нм	~530 нм	1	1
Золото	39.5±<6 нм	~530 нм	~985	~461
PST	83±2.7 нм	~560 нм	1	1
Золото	76.4±15 нм	~560 нм	~708	~211

(а) Расчетная для совершенно сферических частиц

(б) Размеры частиц, измеренные изготовителем. Изготовленные частицы являются сферическими, но не совершенно сферическими. Это будет незначительно влиять на количественные аспекты этого сравнения.

(в) РSТ-полистирол

Таблица 7

Измеренная относительная рассеивающая способность в воде полистироловых и золотых частиц подобного размера и формы на длине волны падающего света, далекой от полосы поглощения золотой частицы

Состав частиц	Размер частиц(а)	Длина волны падающего света	Длина волны максимального рассеяния в видимой области	Относительная рассеивающая способность
непосредственное рассеяние	(в)поправка на размер частиц
PST(б)	41.1±1.8 нм	~530 нм	~300 нм	1	1
		~460 нм		1	1
~400 нм	1	1
Золото	39.9±<6 нм	~530 нм	~530 нм	~317	~443
		~460 нм		~96	~113
~400 нм	~80	~94
PST	83±2.7 нм	~560 нм	~300 нм	1	1
		~430 нм		1	1
~380 нм	1	1
Золото	76.4±<15 нм	~560 нм	~560 нм	~251	~412
		~430 нм		~36	~55
~380 нм	~27	~41

(а) Размер частиц, измеренный изготовителем

(б) PST-полистирол

(в) Корректировка относительных значений светорассеяния для золотых частиц для любой разности в размерах между полистироловыми и золотыми частицами с использованием зависимости, в которой рассеивающая способность увеличивается как шестая степень радиуса. Исправленные числа являются хорошей аппроксимацией, хотя не очень точной в этих диапазонах размеров.

Таблица 8

Измеренная относительная рассеивающая способность в воде, освещенной светом, полистироловых (PST) и золотых частиц подобного размера и состава

(а) Состав частиц	(б) Размер частиц	Относительная рассеивающая способность при одинаковой концентрации	(в)Относительная рассеивающая способность с поправкой на размер частицы
PST	21 нм	1	1
Золото	19.8 нм	~40	~58
PST	38 нм	1	1
Золото	39.9 нм	~212	~158
PST	37.9 нм	1	1
Золото	39.9 нм	~105	~77
PST	59 нм	1	1
Золото	59.6 нм	~100	~94
PST	79 нм	1	1
Золото	76.4 нм	~108	~132

(а) частицы полистирола, полученные от компании Dynamics, Inc., Portland, Oregon or Duke Scientific, Inc., Palo Alto, CA. В то время как золотые частицы были получены от компании Goldmark Biologicals, Phillipsburg, N.J., дистрибьютор для British Biocell LTD., Cardiff, UK.

(б) Диаметр частиц представлен изготовителями.

(в) Выполненные с использованием зависимости, по которой рассеивающая способность увеличивается приблизительно как шестая степень радиуса частицы.

Мощность генерации света частицей по сравнению с флюоресценцией

Флюоресценция в настоящее время используется во многих видах анализа, разработанных для детектирования присутствия или отсутствия вещества аналита.

Флюоресцеин - одно из наиболее изученных и наиболее широко распространенных флюоресцентных соединений. Было проведено много исследований с целью обнаружения как можно меньшего количества молекул флюоресцеина. Флюоресцеин имеет высокий молярный десятиричный коэффициент экстинкции (около 6× 10⁴ М^-1см^-1) и имеет очень высокий флюоресцентный квантовый выход, приблизительно 0.8.

Таблица 9 сравнивает расчетную мощность генерации сигнала некоторых частиц с флюоресцеином. Очевидно, отдельная золотая или серебряная частица - намного более интенсивный источник света, чем отдельная флюоресцентная молекула. При идеальных условиях и использовании соответствующих оптических фильтров хороший флюорометр может детектировать флюоресцеин при более низкой концентрации - приблизительно от 10^-10 до 10^-11 М. Сравнение, представленное в таблице 9, показывает, что тот же флюорометр мог бы детектировать более низкую концентрацию золотых частиц диаметром 60 нм, приблизительно от 10^-15 до 10^-16 М. Мы проверили эти наблюдения экспериментально.

Таблица 9 показывает, что полный выход рассеянного света от отдельной золотой частицы диаметром 60 нм эквивалентен световому выходу приблизительно от 350000 молекул флюоресцеина. В то время как одна молекула флюоресцеина не может непосредственно визуализироваться в оптическом микроскопе, мы способны непосредственно визуализировать единичные металлоподобные частицы во многих различных типах образцов и типах анализа. Свет направляется на образец под таким углом, что свет, рассеянный от частицы, максимально визуализируется или измеряется глазом или фотодетектором. Это широко применимый способ освещения и детектирования, который мы разработали в том или другом виде для использования в аналитических и диагностических применениях, называется DLASLPD (прямое освещение, направленное под таким углом, чтобы детектировался только свет, рассеянный частицами). Эти способы подробно описаны в другом месте. Это обеспечивает возможность детектирования единичных частиц и количественного определения таких частиц посредством способов подсчета частиц, включая анализ изображения, фотонно-корреляционную спектроскопию, оптическую микроскопию и другие способы. Наоборот, только очень большие частицы полистирола можно увидеть в оптическом микроскопе, используя методы DLASLPD.

Таблица 10 представляет результаты, сравнивающие экспериментально измеренную относительную мощность генерации сигнала золотых частиц и частиц флюоресцеина различных размеров, с использованием освещения белым светов. Эти результаты подобны представленным в таблице 8 и показывают, что мощность генерации света у золотой частицы намного больше, чем у молекулы флюоресцеина. Например, золотые частицы диаметром 39.9 и 59.6 нм испускают свет с интенсивностью, эквивалентной интенсивности, получаемой приблизительно от 2× 10⁴ и 2.3× 10⁵ молекул флюоресцеина соответственно, при освещении белым светом.

Рассеянный свет, испускаемый золотыми частицами, освещенными белым светом, составлен из всех длин волн, имеющихся в падающем белом свете, но эффективность светорассеяния на любой конкретной длине волны изменяется так, что одна или более полос длин волн рассеянного света рассеиваются более интенсивно. Фактический состав длин волн и кривая зависимости длины волны рассеянного света от интенсивности рассеянного света, полученные при использовании падающего белого света, зависят от ряда переменных, которые включают тип используемого источника света и способ детектирования света.

Результаты таблицы 10 были получены с раскаленным источником света или цветовой температуры 2800 Кельвина, и свет проходил через простой фильтр, чтобы снизить инфракрасную составляющую перед прохождением через образец. Интенсивность рассеянного света была измерена с помощью стандартного фотоэлектронного умножителя. Результаты таблицы 10 не были скорректированы на свойства фотоумножителя или источника света. Любая из таких поправок не затронула бы выводы обсуждаемого здесь.

Таблица 9

Расчетная относительная мощность генерации сигнала частиц флюоресцеина и сферических частиц различных составов и размеров

Состав частиц	Диаметр частиц	Объем частиц (мкм3)	Число молекул флюоресцеина, необходимых для наблюдения полной интенсивности света от одной частицы(а)
Полистирол	10 нм	5.23× 10-7	~0.07
	20 нм	4.2× 10-6	~5
	40 нм	3.35× 10-5	~280
	60 нм	1.13× 10-4	~2800
100 нм	5.23× 10-4	~42000
Серебро	10 нм	5.23× 10-7	~46
	20 нм	4.2× 10-6	~3500
	40 нм	3.35× 10-5	~150000
	60 нм	1.13× 10-4	~770000
100 нм	5.23× 10-4	~2300000
Золото	10 нм	5.23× 10-7	~7
	20 нм	4.2× 10-6	~455
	40 нм	3.35× 10-5	~35000
	60 нм	1.13× 10-4	~350000
100 нм	5.23× 10-4	~3100000

 ^(а) Флюоресцеин и частица освещаются с одинаковой интенсивностью света на тех длинах волн, которые генерируют максимальный флюоресцентный сигнал или сигнал светорассеяния. Для полистирола используемая длина волны падающего света была 300 нм, в то время как длина волны падающего света, используемая для каждой золотой или серебряной частицы, была длиной волны в максимуме C_sca для частиц различных размеров.

В таблице 11 представлены результаты измерения относительных мощностей генерации сигнала флюоресцеина и явно сферических золотых частиц различного размера при освещении падающим монохроматическим светом. Образец флюоресцеина освещался монохроматическим светом с длиной волны (490 нм), а результирующий испускаемый свет не был монохроматическим или поляризованным и имел спектральные характеристики эмиссии флюоресцеина. Сферические золотые частицы различных размеров освещались монохроматическим светом на длине волны падающего света, на которой проявляется максимум рассеяния падающего света, и результирующий рассеянный свет был либо полностью, либо частично поляризован в зависимости от размера частицы.

Таблица 10

Измеренная относительная мощность сигнала генерации флюоресцеина по сравнению с золотыми частицами при освещении белым светом^(а)

Источник сигнала	Диаметр частицы (нм)	(в) Измеренное число молекул флюоресцеина, необходимое для наблюдения интенсивности света от одной золотой частицы
Золото	10.1±<1.2	~9
Золото	19.8±<2	~2.3× 102
Золото	29.5±<3.5	~4.1× 103
Золото	39.9±<6	~2× 104
Золото	49.2±<9.8	~7.3× 104
Золото	59.6±<11.9	~2.3× 105
Золото	76.4±<15.3	~9× 105
PST(б)	80±<6.6	~8.3× 103

(а) Падающий свет от раскаленного источника света микроскопа Leica с цветовой температурой 2800К и испускаемым светом, проходящим через стеклянную линзу для уменьшения инфракрасной составляющей.

(б) PST - полистирол.

(в) Результаты без поправок.

Таблица 11

Измерение относительной мощности сигнала генерации флюоресцеина по сравнению с золотыми частицами при освещении монохроматическим светом

Тип частицы	(а) Диаметр частицы	(б) Длина волны падающего света	(в) Измеренное число молекул флюоресцеина, необходимое для наблюдения интенсивности света от одной золотой частицы
Золото	10.1 нм	~525 нм	~4
Золото	19.8 нм	~530 нм	-120
Золото	29.5 нм	~532 нм	-1400
Золото	39.9 нм	~535 нм	~7800
Золото	49.2 нм	~550 нм	~25000
Золото	59.6 нм	~542 нм	~78000
Золото	76.4 нм	~565 нм	~190000
Золото	~100 нм	~560 нм	~550000

(а) Размер, представленный измерениями

(б) Падающий монохроматический свет, состоящий из существенной части горизонтально поляризованного света, исходящего из монохроматора. Вертикально поляризованный падающий свет мог бы дать значительно большую интенсивность сигнала частицы, но не повлиял бы на интенсивность сигнала от флюоресцеина.

(в) Результаты без поправок.

Таблица 11 иллюстрирует, что интенсивность сигнала рассеянного света, полученная от отдельных золотых частиц различных размеров, освещенных падающим монохроматическим светом, намного выше интенсивности светового сигнала от отдельной молекулы флюоресцеина. Эти результаты, кроме того, иллюстрируют, что отдельные металлоподобные частицы, как например золотые частицы, при освещении падающим монохроматическим светом могут детектироваться при очень низких концентрациях. Такая обнаружимость чрезвычайно полезна для использования таких частиц с соответствующими способами детектирования в качестве чрезвычайно чувствительных меток светорассеяния в применениях диагностического и аналитического анализа.

Неметаллоподобные частицы, как например полистирол, которые имеют сотни - тысячи высоко флюоресцентных молекул, внедренных в тело частицы, известны в уровне техники. Пример такой частицы - частица диаметром 120 нм, в которую было внедрено флюоресцентное соединение, имеющее длины волны максимумов возбуждения и излучения 490 и 515 нм соответственно, которые подобны флюоресцеину. Каждая частица содержит в среднем 4400 высоко флюоресцентных молекул, объем такой частицы составляет приблизительно 7× 10^-14 см³, и концентрация флюоресцентных молекул в частице составляет приблизительно 10^-5 М.

Таблица 12 представляет экспериментально измеренные результаты для мощности генерации света частицами полистирола диаметром 110 нм с примесью многих молекул из высоко флюоресцентного соединения и золотыми частицами диаметром 100 нм. Их мощность генерации света непосредственно сравнивается с раствором флюоресцеина, который дает такую же мощность генерации света. Интересно обратить внимание на то, что полный сигнал рассеянного света от одной частицы полистирола диаметром 110 нм эквивалентен световому сигналу приблизительно от 12000 молекул флюоресцеина. Присутствие флюоресцентных молекул в частице полистирола только увеличивает полный сигнал света от частицы примерно в 1.5 раза. Сигнал флюоресценции от этой частицы может быть отделен от сигнала светорассеяния посредством использования подходящего фильтра между образцом и детектором, который не пропускает длины волны падающего света и пропускает длины волн, характерные для флюоресцентного излучения. Такой фильтр приводит к тому, что интенсивность флюоресцентного сигнала, полученного от этой частицы, эквивалентна интенсивности приблизительно от 3000 молекул флюоресцеина. Золотая частица диаметром 100 нм, очевидно, намного превосходила эти частицы по мощности генерации испускаемого света.

Таблица 12

Расчетная относительная мощность генерации сигнала частиц флюоресцеина, полистирола, полистироловые частицы, содержащие флюоресцентные молекулы, и золотые частицы

Тип частицы	(а) Диаметр частицы	Число флюоресцентных молекул на частицу	Длина волны падающего света	(в) Измеренное число молекул флюоресцеина, необходимое для наблюдения интенсивности света от одной золотой частицы
(r)pST	110 нм	0	490 нм	~12000
PST	110 нм	~4400	490 нм	~19000
(д)Золото	110 нм	0	555 нм(б)	(д)~1.3% 10

(а) Размер, представленный измерениями.

(б) См. таблицу 11 (б).

(в) Результаты без поправок.

(г) Полистирол.

(д) Используемая здесь частица диаметром 100 нм была взята из партии, отличной от используемой в таблице 11.

Частицы смешанного состава

Сферические частицы смешанных составов оценивались теоретически и физическим экспериментированием, чтобы выяснить их возможную пригодность в различных диагностических и аналитических применениях. Для теоретических оценок изучались частица с золотым "ядром", покрытая серебром различной толщины, и частица с серебряным "ядром", покрытая золотом или полистиролом различной толщины. Под "ядром" подразумевается сферическая частица, на которую наносится дополнительный слой из различных светорассеивающих материалов, приводя к смешанному составу определенных пропорций. Было выполнено непосредственное физическое экспериментирование для частиц из смешанного состава, в которых к центральной золотой частице диаметром 16 нм была добавлена дополнительная толщина серебра. В этих иллюстративных примерах золото и серебро представляют металлоподобные материалы, а полистирол представляет неметаллоподобные материалы. Эти примеры составляют только небольшую часть от большего числа различных возможных комбинаций, которые охватывают частицы, составленные из смесей одного или более различных металлоподобных и/или неметаллоподобных материалов.

Результаты вычислений для свойств светорассеяния вышеупомянутых иллюстративных примеров представлены в таблицах 13 и 14. Таблица 13, часть А показывает, что для ряда сферических частиц диаметром 10 нм, которые составлены из увеличивающейся пропорции серебряного покрытия на золотом ядре, свойства светорассеяния изменяются, приближаясь к свойствам чисто золотой частицы. Наиболее важное, что мы наблюдали в этих вычислениях и физическом экспериментировании, то, что некоторые пропорции золотых частиц, покрытых серебром, могут давать два интенсивных максимума светорассеяния на длинах волн падающего света, близких к длинам волн, характерным для чистых золотых и чистых серебряных частиц приблизительно того же размера.

Прямое экспериментальное наблюдение золотых частиц диаметром 16 нм, покрытых серебром, с использованием освещения белым светом при условиях DLASLPD с простым оптическим микроскопом показали, что имелись новые цвета рассеянного света от этих частиц, которые ранее не замечались в препаратах из чисто золотых или чисто серебряных частиц. Многие из частиц имели цвет рассеянного света от ярко пурпурного до сиреневого.

Таблица 13, часть Б, представляет сравнение расчетных результатов для частиц смешанного состава, составленных из золотых шариков диаметром 10 нм, покрытых серебром различной толщины. Результаты показывают, что для свойств светорассеяния этих смешанных составов по мере изменения пропорций от серебра к золоту наблюдаются подобные тенденции, как в таблице 13, часть А. В дополнительных вычислениях (таблица 14), где серебряная центральная частица покрыта золотом изменяющейся толщины, свойства светорассеяния показывают подобные тенденции в своем изменении при изменении пропорций золота и серебра, как в табл.13.

Из наших объединенных теоретических исследований и физического экспериментирования мы определили следующее. Для частиц, составленных из некоторых смешанных составов металлоподобных материалов, как например, смешанных составов золота и серебра, проявляются новые свойства светорассеяния, которые являются практически пригодными во многих различных типах образцов и специфических диагностических и аналитических применениях. Частицы с двумя или более оптически отличными и разрешаемыми длинами волн высоких интенсивностей рассеяния могут быть изготовлены посредством вариации состава металлоподобных материалов.

Наоборот, частицы, составленные из смешанных составов не металлоподобных и металлоподобных материалов, в основном проявляют свойства светорассеяния, подобные металлоподобным материалам, при равных или меньших пропорциях неметаллоподобных материалов по отношению к металлоподобным материалам. Только при очень высоких пропорциях неметаллоподобных материалов по отношению к металлоподобным материалам свойства светорассеяния частицы смешанного состава становятся похожими на свойства неметаллоподобного материала, как показывают результаты таблицы 14, часть Б.

Оба смешанных состава - и составы серебро - золото, и составы серебро - полистирол проявляют высокую светорассеивающую способность и полосы рассеяния в видимом диапазоне длин волн, которые характерны для частиц, составленных из чистых металлоподобных материалов. Частицы некоторых смешанных составов обнаружимы посредством особенного способа детектирования рассеянного света от одного или обоих пиков интенсивности рассеивания, и/или по цвету или цветам этих частиц с составом смешанного типа. Такие частицы с составом смешанного типа увеличивают способность к детектированию меньших количеств частиц и большую определенность детектирования меньших и больших количеств частиц, чем было возможно до этого.

Асимметричные частицы

Физическая ориентация асимметричных частиц относительно светового луча учитывает дополнительные свойства рассеяния света, которые нужно использовать в детектировании этих частиц. Свойство RIFSLRW может использоваться во многих различных аспектах настоящего изобретения для детектирования и/или измерения с большей определенностью и большей чувствительностью одного или более аналитов или частиц в образце. Например, мерцание интенсивности рассеянного света и/или изменение цвета обеспечивает дополнительное средство детектирования для определения того, какие частицы привязаны к поверхности, а какие нет. Это позволяет развивать тип анализа неразделения (гомогенный). Все что требуется, это посредством подсчета частиц, измерений интенсивности и т.п. детектировать частицы, которые не мерцают и/или не изменяют цвет. Свободные частицы в растворе будут мерцать и/или изменять цвет, в то время как привязанные к поверхности - не будут. Дополнительное средство обработки изображения, типа видеомагнитофонов и т.п. позволяет использовать как асимметричные, так и сферические (симметричные) частицы для дополнительных способов детектирования. Например, либо в формате разделения, либо в формате неразделения связанные частицы детектируются посредством фокусировки собирающей линзы на поверхность и посредством регистрации только тех сигналов рассеянного света на единицу площади, которые являются постоянными в течение некоторого периода времени. Свободные частицы в растворе, испытывающие броуновское движение или другие типы движения, приводят к переменной интенсивности рассеянного света на единицу площади в единицу времени для этих частиц. Связанные светорассеивающие частицы фиксированы в пространстве и не перемещаются. Используя способы обработки изображения для отделения "подвижных" светорассеивающих частиц от "связанных" светорассеивающих частиц, количество связанных частиц определяется и коррелируется с количеством аналита в образце. Специалист поймет, что имеется много других способов обработки изображения, которые могут использоваться для того, чтобы отличить частицы, привязанные к поверхности, и свободные сферические или асимметричные частицы в растворе.

Добавка других материалов к поверхности или ядру частицы с целью обеспечить дополнительные физические неотъемлемые свойства, не относящиеся к свойствам светорассеяния

В некоторых применениях и при использовании некоторых типов составов может быть полезным "покрывать" поверхность частицы для дополнительной химической стабилизации частицы или добавлять дополнительные поверхностные связующие свойства, которые могут быть очень важны в специфических применениях аналитического диагностического анализа. Например, хорошо известно, что серебро быстро окисляется. Для использования серебряных частиц или частиц смешанного состава, которые содержат серебро, можно химически стабилизировать содержащую серебро частицу, нанося на поверхность тонкое покрытие из золота или другого вещества так, чтобы химическая стабильность серебра больше не поддавалось воздействию окружающей среды.

В другом примере может быть желательным покрывать поверхность другим материалом типа полимера, содержащего определенным образом связанные связующие агенты или другие материалы, подходящие для присоединения связующих агентов к частицам, или сами связующие агенты. В каждом из этих примеров эти "тонкие" покрытия значительно не изменяют свойства светорассеяния основного материала. Под "тонкими" покрытиями подразумевается монослой или подобный тип покрытия на поверхности частицы.

Управляемые светорассеивающие частицы (УСРЧ) - это частицы, которые в дополнение к обладанию одним или более желаемыми свойствами светорассеяния также могут управляться в одно-, двух или трехмерном пространстве посредством приложения электромагнитного поля. УСРЧ частица может быть создана многими различными способами. Например, УСРЧ частицу изготавливают, покрывая сегнетоэлектрический, магнитный или подобный материал "ядра" маленького диаметра намного большей пропорцией материала, который имеет желаемые свойства светорассеяния, например ядро диаметром 10 нм из магнитного или сегнетоэлектрического материала покрывают достаточным количеством золота, чтобы изготовить частицу диаметром 50, 70 или 100 нм. Это показано на фиг.29 А.

Другой способ изготовления такой частицы состоит в том, чтобы покрыть материал, который имеет желаемые свойства светорассеяния, тонким слоем магнитного или сегнетоэлектрического материала. Например, золотую или серебряную частицу диаметром приблизительно 50 нм покрывают покрытием толщиной 1-2 нм из магнитного или сегнетоэлектрического материала. Это показано на фиг.29Б.

В другом случае УСРЧ частицы изготавливают, смешивая в соответствующих пропорциях материалы с желательным светорассеянием и сегнетоэлектрические или магнитные материалы так, чтобы образовалась частица, подбирается соответствующее отношение пропорций количества материала с желательным светорассеянием к количеству магнитного или сегнетоэлектрического материала на частицу. Это показано на фиг.29 В.

Альтернатива к вышеупомянутым УСРЧ частицам состоит в том, чтобы связать или собрать один или более типов частиц с желаемыми свойствами светорассеяния в одну или более частиц, которые могут перемещаться электромагнитным полем. Такие структуры из многих частиц могут тогда иметь свойства, подобные частицам УСРЧ. Например, маленькие частицы из магнитного или сегнетоэлектрического материала связываются в одну или более частиц, свойства светорассеяния которых детектируются. Связывание осуществляется ионной, химической связью или любым другим средством, которое приводит к устойчивой структуре из многих частиц. Например, различные частицы покрывают подходящими полимерами так, чтобы при смешивании в надлежащей пропорции достигалось определенное распределение дискретных структур из многих частиц путем сшивания различных типов отдельных частиц между собой. Существует много различных способов связывания частиц между собой с целью достижения желаемой структуры из многих частиц. В целях иллюстрации на фиг.30 показаны несколько из возможных структур из многих частиц. Фигуры 30 А, Б и В показывают двухмерную, четырехмерную структуру частицы и структуру более высокого порядка, соответственно, для ориентируемых УСРЧ частиц. Специалист поймет, что это только небольшое количество из многих различных типов возможных структур из многих частиц и что существуют многочисленные способы для изготовления таких структур.

Эти примеры частиц, составленных из смесей одного или более материалов, всего лишь небольшая часть из очень большого количества различных составов из различных материалов, которые только возможны и которые должны быть очевидны для специалиста.

Однородность форм и размеров частиц

В зависимости от того, как детектируются свойства светорассеяния частиц, могут быть чрезвычайно важными приблизительный размер и распределение размеров частиц в популяции частиц. Например, для многих из коммерчески доступных препаратов золотых частиц коэффициент вариации распределения размеров частиц расценивается где-нибудь приблизительно от <10 до <20 процентов. Коэффициент вариации, выраженный в процентах, определяется как стандартное отклонение распределения размеров частиц, деленное на среднее значение размера препарата частиц. Таким образом, для препарата частиц диаметром 60 нм с коэффициентом вариации 20% элементарное стандартное отклонение будет равно ±12 нм. Это означает, что приблизительно 10% частиц меньше 48 нм или больше 72 нм. Такая вариация размеров значительно влияет на интенсивность рассеянного света и на цвет рассеянного света в зависимости от приблизительного "среднего" размера частиц в препарате.

Мы разработали процедуру выращивания частиц, которая, по-видимому, дает более узкое распределение размеров, чем распределение коммерчески доступных препаратов. Процедура включает сначала изготовление препарата "зародышевых" золотых частиц, за которым затем следует извлечение препарата "зародышевых" частиц и выращивание химическими способами золотых (см. примеры 11 и 15) или серебряных (см. пример 13) частиц различных размеров. Например, в качестве "зародышевых" частиц используются золотые частицы диаметром 16 нм, а золотые частицы большего диаметра производятся путем добавки соответствующих реагентов (см. пример 15). Этот способ также очень подходит для изготовления частиц смешанного состава.

Однородность частиц - детектирование аналитов по цвету света, рассеянного от отдельных частиц

В некоторых применениях цвет отдельных частиц используют для идентификации и количественного определения специфических типов аналитов. Например, в применениях цитометрии изображения может представлять интерес идентификация и подсчет различных типов поверхностных антигенов клетки или т.п. посредством детектирования числа и цвета различных типов частиц, прикрепленных к поверхности. Для этого или любого другого связанного типа многоаналитного детектирования распределение размеров различных частиц должно сохраняться как можно более плотным (узким, компактным). Средний диаметр частиц препарата должен выбираться таким, чтобы обеспечить желаемый цвет рассеянного света при освещении белым светом, используя средний или "усредненный" размер частиц, который близок к средней точке размеров между усредненными размерами меньших и больших частиц, которые будут использоваться в таком же применении, чтобы получить различные цвета рассеянного света. Таким образом, максимизируется разрешающая способность детектирования различных типов частиц по их цвету рассеянного света.

Однородность частицы - измерение интегральной интенсивности света

В других разделах мы уже описали, как сильно может изменяться интенсивность рассеянного света по мере увеличения или уменьшения размера частиц. Эта вариация интенсивности должна особенно учитываться, когда выполняются измерения интегральной интенсивности света. Использование вышеописанного препарата частиц диаметром 60 нм с коэффициентом вариации 20% означает, что 10% частиц имеют интенсивности приблизительно в 3 раза больше или меньше интенсивности частицы диаметром 60 нм. Кроме того, частицы в пределах оставшихся 90% совокупности имеют весьма изменяющиеся интенсивности. В применениях, где имеется много измеряемых частиц, "средняя" интегральная интенсивность света должна приближаться к интенсивности частицы диаметром 60 нм. Однако при более низких концентрациях частиц статистика такой вариации может затрагивать точность считывания от образца к образцу и могут понадобиться поправочные алгоритмы. При использовании как можно более узкого распределения частиц точность и простота измерения увеличиваются.

Металлоподобные частицы, подходящие для детектирования аналитов по цвету их полосы поглощения

Для некоторых типов анализа аналитов аналиты присутствуют при таких концентрациях, при которых может выполняться детектирование аналитов по свойствам поглощения света. Например, текущая проблема техники иммунохроматографического анализа и т.п. состоит в том, что использование золотых частиц обычно используемых размеров (диаметром от 4 до 50 нм) обеспечивает только такие частицы, которые оптически не могут быть разрешены по цвету их полосы поглощения. Эти частицы имеют цвет от розового до красного при наблюдении на фильтровальной бумаге или подобной твердофазной среде диагностического анализа. Изменяя размер и/или форму серебряных частиц и других металлоподобных частиц, можно получить много различных цветов поглощения света. Эти различные цвета поглощения частиц могут использоваться, чтобы детектировать различные аналиты по цвету светопоглощения частицы. Эти цвета, которые могут быть обнаружены глазом, очень подходят во многих типах твердофазного анализа, таких как проточный иммунохроматографический анализ, анализ типа планшетов, микроматрицы или большей твердой фазы, одно- или многоаналитный анализ. Сферические и асимметричные частицы из серебра и некоторых смешанных составов других металлоподобных частиц обеспечивают широкий диапазон цветов светового поглощения.

Автометаллографическое усиление свойств светорассеяния частиц

В технике хорошо известно, что автометаллография и связанные методы могут использоваться для увеличения размеров существующих металлоподобных частиц в малое или же большое число раз. Светопоглощающая способность частиц, составленных из металлического и/или полупроводникового материала и особенно золотых и серебряных частиц, часто использовалась для количественного определения или детектирования присутствия этих частиц глазом или прибором, разработанным для измерения поглощения света. Такой способ хуже способов детектирования светорассеяния настоящего изобретения по способности детектировать малое количество частиц, увеличенное металлографией.

Например, было сообщение (см. Immunogold-Silver Staining, Principles, Methods and Applications, CRC press, 1995 M.A.Hayat Ed.), что золотые частицы диаметром один нанометр были увеличены металлографическими способами посредством покрытия золотой частицы диаметром 1 нм серебром до среднего диаметра приблизительно 110 нм примерно за двадцать минут. Частицы в этом препарате имели диаметры в диапазоне приблизительно от 40 до 200 нм и были грубо сферическими по форме. К удивлению, наши вычисления показывают, что увеличение диаметра 1 нм центральной меченой частицы до 110 нм приводит к увеличению рассеивающей способности приблизительно в 10¹⁰ раз, в то время как светопоглощающая способность увеличивается только приблизительно в 10⁵ раз.

При увеличении диаметра маленькой частицы длина волны падающего света, на которой наблюдается максимальное светорассеяние, сдвигается в более длинноволновую область по сравнению с маленькой центральной частицей из того же самого материала. Таким образом, увеличенные частицы легко детектируются в присутствии или в отсутствие маленьких частиц диаметром 1 нм путем измерения сигнала светорассеяния от увеличенных частиц. Использование для детектирования увеличенных частиц падающего света с длиной волны, на которой наблюдается максимум рассеяния, для увеличенных частиц, допускает детектирование увеличенных частиц с большей определенностью относительно меньших частиц, которые составляют главный источник фона неспецифического светорассеяния.

а) Частица, составленная только из полистирола

Таблица 15 обеспечивает дополнительные данные в отношении свойств светорассеяния маленьких частиц, которые увеличиваются в размере посредством металлографических или связанных способов. Наши расчетные данные показывают, что увеличение размера частицы приводит к большему увеличению светорассеивающей способности частиц по сравнению с светопоглощающей способностью частиц. Например, двадцатипроцентное увеличение диаметра частицы увеличивает светорассеивающую способность маленькой частицы в (1.2)⁶ раза или приблизительно в три раза. Увеличение диаметра маленькой частицы в два - десять раз приведет к увеличению рассеивающей способности приблизительно в шестьдесят четыре и один миллион раз соответственно, в то время как светопоглощающая способность увеличится только в восемь и одну тысячу раз соответственно.

Таким образом, когда способ настоящего изобретения используется для количественного определения и/или детектирования присутствия частиц, которые были увеличены металлографией (то есть осаждением покрытия металлоподобного материала на частицу маленького диаметра, составленную либо из металлоподобных, либо из неметаллоподобных материалов), то возможно детектировать меньшее количество таких частиц и детектировать меньшие количества таких частиц с большей определенностью, чем было возможно ранее.

Вышеупомянутое - иллюстрация объединения металлографического увеличения металлоподобного ядра частицы осаждением металлоподобного покрытия на ядре, за которым следует детектирование увеличенных частиц способом настоящего изобретения. Такие способы могут использоваться для увеличения свободных частиц в растворе и/или частиц, прикрепленных к поверхности. Предшествующий пример - только одно из многих различных преобразований этого комбинированного способа, который включает использование многих различных стратегий и способов, обсуждаемых здесь, предназначенных для детектирования частиц посредством рассеяния света, а также различных комбинаций ядра и составов покрытий и различной степени увеличения. Эти различные комбинации будут очевидны для специалиста. Такой комбинационный подход может применяться почти к любой ситуации, в которой желательно использовать систему генерации и детектирования сигнала для детектирования аналита.

Таблица 15

Частица с золотым меченым ядром диаметром 2 нм - различная толщина равномерного серебряного покрытия - расчетные свойства светорассеяния

Диаметр частицы	Толщина серебряного покрытия	Рассеивающая способность частицы (Csca) (см2)	Длина волны, на которой наблюдается максимум рассеяния	Относительная интенсивность света, рассеянного частицами	Относительный десятиричный молярный к-нт экстинкции частицы
2 нм	0 нм	~8× 10-20	~520 нм	1	1
10 нм	4 нм	~10-14	~382 нм	~1.25× 105	~3× 102(a)
20 нм	9 нм	~6.5× 10-13	~384 нм	~8.1× 106	~2.3× 103
40 нм	19 нм	~2.8× 10-11	~400 нм	~3.5× 108	~1.6× 104
80 нм	39 нм	~2.9× 10-10	~447 нм	~3.6× 109	~5.8× 104
100 нм	49 нм	~4.3× 10-10	~481 нм	~5.4× 109	~7.6× 104
150 нм	74 нм	~7.9× 10-10	~432 нм	~9.9× 109	~1.5× 105
150 нм	74 нм	~7.6× 10-10	~600 нм	~9.5× 109	~1.2× 105

(а) Молярный десятиричный к-нт экстинкции C_sca и длина волны падающего света, на которой наблюдается максимум рассеяния, по существу идентичны тем же характеристикам чистосеребряной частицы диаметром 10 нм.

Способ повышения показателя преломления

Использование методов согласования показателя преломления в оптической микроскопии, телесвязи и других связанных областях хорошо известно в технике. Этот метод используется в основном для уменьшения неспецифического светорассеяния и отражения, которые имеют место, когда световой луч проходит из одной среды или устройства в другую среду, как например, с поверхности одного материала на поверхность другого отличающегося материала.

Мы определили, что на светорассеивающую способность (C_sca) частицы определенного типа влияет среда, в которой находится частица. Изменение показателя преломления среды приводит к изменению свойств светорассеяния частицы.

Таблица 16

Расчетное влияние показателя преломления среды на частицы диаметром десять нанометров различного состава. Влияние на длину волны и интенсивность

Золото	Серебро	Полистирол
N1	(А)	(Б)	(А)	(Б)	(А)	(Б)
1	1	520 нм	1	355 нм	1	400 нм
1.1	1.9	525 нм	1.6	360 нм	0.9	400 нм
1.2	3.9	525 нм	2.3	370 нм	0.75	400 нм
1.3	7.7	530 нм	2.9	380 нм	0.52	400 нм
1.4	15.1	535 нм	3.9	390 нм	0.27	400 нм
1.5	27.7	540 нм	5.3	400 нм	0.084	400 нм
1.6	45.4	550 нм	7.3	415 нм	~0	-
1.7	71.5	555 нм	9.7	425 нм	0.1	400 нм

(А) - относительная рассеивающая способность при показателях преломления различных сред

(Б) - длина волны, на которой наблюдается максимум рассеяния

N₁ - показатель преломления среды

Во многих типах образцов и типах диагностического анализа проблема неспецифического фона рассеянного, отраженного и другого света от контейнеров образцов и от составляющих образца, не содержащих аналит, хорошо известна. Эти типы неспецифического светового фона затрудняют или делают невозможным выполнение чувствительного и сверхчувствительного детектирования аналитов посредством детектирования и/или измерения свойств светорассеяния частицы.

Мы определили, что металлоподобные частицы можно детектировать до много более высокой степени определенности и чувствительности по сравнению с неметаллоподобными частицами, когда используется способ повышения показателя преломления. Далее описывается способ. Влияние показателя преломления частицы и среды на интенсивность рассеянного света можно оценить, используя следующее выражение (RI - коэффициент преломления

где refmed - показатель преломления среды, a m равно отношению показателя преломления частицы к показателю преломления среды. Параметр m зависит от длины волны косвенно, но точная зависимость изменяется с составом частицы и среды. Показатель преломления большинства растворителей, которые не имеют никакого цвета, обычно не зависит от длины волны по меньшей мере в видимой области спектра.

Для использования светорассеивающих частиц в чувствительном анализе интересно определить, какие значения показателя преломления приводят к более высоким интенсивностям светорассеяния. Это определяется из коэффициента преломления (RI) уравнения (16). Этот коэффициент имеет самое высокое значение, когда знаменатель уравнения (16) равен нулю. При этом условии коэффициент преломления имеет бесконечное значение. Таким образом, условие высокого светорассеяния следующее:

Решая уравнение относительно m, мы получаем

где Вышеупомянутое уравнение показывает, что коэффициент преломления имеет самое высокое значение и светорассеяние от частицы максимально, когда показатель преломления является чисто мнимым числом со значением 1.41. Расчетные данные, представленные в таблице 16, соответствуют ожидаемым тенденциям. Кроме того, способ повышения показателя преломления работает очень хорошо при длинах волн падающего света, далеких от длины волны падающего света, на которой наблюдается максимальное светорассеяние для металлоподобных частиц.

Далее представлен иллюстративный пример использования способа повышения показателя преломления. В высоко рассеивающих образцах, таких как образцы, где имеется высокий уровень фона неспецифического светорассеяния, металлоподобные частицы и способ повышения показателя преломления используются следующим образом.

Специалист увеличивает показатель преломления образца среды, например, нанося пленку воды или другой жидкости поверх сухого или влажного образца. Это увеличивает показатель преломления среды. В другом примере сыворотка или другой тип образца с высокой рассеивающей способностью разбавляется жидкостью с высоким показателем преломления, которая значительно увеличивает показатель преломления среды.

В вышеупомянутых примерах происходят следующие процессы. Специфический сигнал светорассеяния металлоподобных частиц увеличивается и неспецифический фон светорассеяния уменьшается по мере увеличения показателя преломления образца. Наибольшее увеличение отношения "светорассеяние частицы / неспецифический фон рассеяния" достигается, когда показатель преломления среды образца приближается к показателю преломления металлоподобной частицы, как показано в таблице 16. Это означает, что при надлежащих значениях показателя преломления среды неспецифическое рассеяние света от сывороточных белков или подобных составных частей может быть значительно уменьшено или устранено, в то время как интенсивность специфического светорассеяния частиц увеличена. Когда свойства светорассеяния металлоподобных частиц используются в качестве аналитического индикатора, это приводит к превосходным отношениям сигнал/фон детектирования аналитов. Эти способы могут применяться к образцам типа сухих поверхностей, поверхностей, покрытых растворами или растворами.

Эти способы согласования показателя преломления могут также использоваться с большими длинами волн для металлоподобных частиц с целью еще большего увеличения отношения "сигнал специфического рассеяния света/фон неспецифического рассеяния". Хотя таблица 16 показывает только эффекты для золотых и серебряных частиц, частицы, составленные из других металлоподобных материалов, могут также использоваться для детектирования меньших количеств частиц с использованием способов, которые мы описали. Описание способа повышения показателя преломления представляет только небольшую часть из многих возможных вариаций этого практического применения изобретения. Возможны многие другие вариации способа, которые должны быть очевидны для специалиста. Та или другая из этих вариаций могут эффективно применяться в большинстве диагностических форматах для определения присутствия или отсутствия аналита. Этот аспект настоящего изобретения обеспечивает средство для детектирования меньших количеств частиц и для детектирования меньших количеств и больших количеств частиц с большей определенностью, чем было возможно до этого.

Способ настоящего изобретения, который объединяет повышение показателя преломления с использованием узкополосного фильтра пропускания, описанным ранее, имеет большую применимость для детектирования меньших и больших количеств частиц, чем было возможно ранее. Эти подходы взаимодополняющие. Способ повышения показателя преломления используется для уменьшения фона неспецифического светорассеяния, в то время как узкополосный фильтр используется для снижения и минимизации других источников неспецифического светового фона, таких как флюоресценция и т.п. Комбинация этих способов приводит к оптимизированным в высокой степени отношениям "сигнал специфического рассеяния частицы /неспецифический световой фон" и обеспечивает возможность детектирования частиц с большей определенностью и с большей чувствительностью. Вышеупомянутый пример - только одна из многих возможных вариаций этого комбинированного способа. Другие вариации будут очевидны для специалиста.

Детектирование светорассеивающих частиц в образцах с высоким рассеянием и флюоресценцией - сыворотке

Молочная сыворотка содержит много важных для медицины веществ, количественное определение или присутствие которых определяется в клинической лаборатории, а также в других местах. Много различных систем генерации и детектирования сигнала используются для определения присутствия этих аналитов в сыворотке, и они включают способы генерации световых сигналов типа флюоресценции, светорассеяния и хемилюминесценции, а также колориметрических методов, которые используются в форматах, содержащих как способы непосредственного мечения, так и способы усиления сигнала. Натуральная сыворотка содержит множество разнообразных веществ, которые способны генерировать неспецифический световой сигнал посредством либо флюоресценции, хемилюминесценции, либо механизмов светорассеяния. Кроме того, сыворотка часто содержит вещества, которые при генерации и/или детектировании интерферируют со специфическим световым сигналом от меченого объекта. Эти проблемы затрудняют или делают невозможным проведение детектирования аналитов в образцах чистой или почти чистой сыворотки.

Чтобы обеспечить возможность эффективного использования большинства, если не всех существующих испытательных систем для детектирования аналитов сыворотки, почти всегда необходимо предварительно обрабатывать сыворотку некоторым способом так, чтобы сделать ее пригодной для исследования. Существует много таких способов обработки сыворотки, и возможно, самый простой - разбавление сыворотки до некоторого подходящего раствора, который по природе обычно является водным. Другой обычно используемый подход состоит в том, чтобы провести фактическое испытание таким способом, чтобы нежелательные составляющие сыворотки были удалены прежде, чем будет определяться присутствие специфического светоиспускающего индикатора. С точки зрения стоимости и трудоемкости, чем меньше усилий и реактивов необходимо для проведения испытания, тем лучше. Очень желательно, чтобы образец вообще не приходилось предварительно обрабатывать. Такая способность была бы также выгодной для выполнения испытания. Способ настоящего изобретения обеспечивает средство для проведения таких испытаний аналитов почти в чистой сыворотке и дополнительно обеспечивает средство для детектирования меньшего или большего количества частиц при высоких концентрациях сыворотки с большей определенностью, чем было возможно ранее.

Например, образцы сыворотки обычно разбавляют до конечной концентрации приблизительно 5 процентов сыворотки перед ее анализом с помощью флюоресцентного индикатора типа флюоресцеина. Образец сыворотки освещается монохроматическим светом на длине волны 490 нм, и для минимизации неспецифического фона рассеянного света используются оптические фильтры. Сигнал неспецифического света эквивалентен очень чистому жидкому образцу флюоресцеина, который содержит от 10^-6 до 10^-9 М флюоресцеина. Таким образом, в 5%-ном образце сыворотки можно детектировать от 10^-6 до 10^-9 М флюоресцеина при отношении сигнал/шум, равным 2. В 95-процентном образце сыворотки нижний предел детектирования флюоресцеина должен быть приблизительно в 19 раз выше, т.е. приблизительно от 1.9× 10^-7 до 1.9× 10^-8 М. Таким образом, в 95-процентной сыворотке при использовании оптических фильтров нижний предел детектирования флюоресцеина составляет приблизительно от 1.9× 10^-7 до 1.9× 10^-8 М, и эта величина светового сигнала флюоресцеина приводит к отношению "полный световой сигнал / неспецифический световой сигнал" приблизительно от 2 до 1.

Таблица 17 представляет экспериментально измеренные пределы чувствительности при отношении "полный световой сигнал /неспецифический световой сигнал", составляющем от 2 до 1 флюоресцеина при очень высоких концентрациях сыворотки. При этой высокой концентрации сыворотки при отсутствии оптической фильтрации предназначенной для устранения неспецифического светового сигнала, обусловленного рассеянным падающим светом, нижний предел детектирования флюоресцеина составляет приблизительно 6× 10^-7 М.

Таблица 18 представляет нижний предел детектирования флюоресцеина при очень высокой концентрации сыворотки, когда оптический фильтр, который устраняет неспецифический световой сигнал, обусловленный рассеянным падающим светом, помещается между образцом и фотоэлектронным умножителем. В этой ситуации нижний предел детектирования флюоресцеина при высокой концентрации сыворотки составляет приблизительно 2× 10^-8 М.

В отличие от флюоресцеина результаты, представленные в таблице 17, часть Б, и в таблице 18, показывают, что без оптической фильтрации присутствие золотых частиц диаметром 59.6 нм в 95-процентной сыворотке может быть обнаружено при отношении "полный световой сигнал/неспецифический световой сигнал", составляющем от 2 до 1 при концентрации приблизительно 1.8× 10^-12 М. Неспецифический световой сигнал, наблюдаемый от сыворотки, был эквивалентен такому сигналу приблизительно от 5× 10^-7 М флюоресцеина. При таких же условиях частицы полистирола диаметром 60 нм при высокой концентрации сыворотки могут детектироваться только при нижнем пределе, составляющем приблизительно 6× 10^-9 М (см. таблицу 18).

Таблица 17

Детектирование золотых частиц диаметром 59.6 нм при высокой концентрации сыворотки

	Процентное содержание сыворотки	Концентрация золотых частиц	Длина волны падающего света	Концентрация флюоресцеина	Относительная интенсивность света
А	97.8%	0	490 нм	0	102
	95.7%	0	490 нм	8.7× 10-6M	15.8
	97.8%	0	545 нм	0	0.52
95.7%	0	545 нм	8.7× 10-6 М	0.56
Б	97.8%	0	490 нм	0	0
	95.7%	1.77× 10-12 M	40 нм	0	1.1
	97.8%	0	543 нм	0	0.55
95.7%	1.77× 10-12 М	543 нм	0	105

Плодная бычья сыворотка, приобретенная от компании Biowhitaker Walkerville, MD под номером в каталоге 14-501 F. Сыворотку перед продажей пропускали через одномикронный фильтр и она была чистая (прозрачная), цвета соломы. Показатель рН сыворотки был близок приблизительно к рН 9... 9.5. Не было никакой спектральной фильтрации испускаемого света.

(а) Значение светового сигнала, полученного здесь, принимается за 1. Этот сигнал был эквивалентен 3.7× 10^-7 М флюоресцеина.

Таблица 18

Нижний предел детектирования флюоресцеина, золотых и полистироловых частиц при концентрации сыворотки = 92.8%

Процентное содержание сыворотки	Концентрация флюоресцеина	Тип и концентрация частиц	Длина волны падающего света	Фильтр для эмиссии	Относительная интенсивность сигналав
92.8%	0	0	554 нм	No	1(~520 mv)(б)
92.8%	0	Золото 1.8× 10-12 М	554 нм	No	2.1(~1100 mv)
92.8%	0	0	496 нм	Yes(a)	1(~39 mv)
92.8%	2.3× 10-8	0	496 нм	Yes	~2(~79 mv)
92.8%	0	0	554 нм	No	1(~468 mv)
92.8%	0	PST 6× 10-9 М	554 нм	No	~2(~960 mv)

Полистирол (PST) и золотые частицы имели измеренный диаметр 60 и 59.6 нм соответственно. Показатель рН растворов, содержащих флюоресцеин, был установлен равным рН 9... 10 перед измерением. Максимальная интенсивность света в сыворотке наблюдалась при длине волны падающего света, приблизительно равной 496 нм для флюоресцеина и приблизительно равной 554 нм для золотой частицы диаметром 59.6 нм.

(а) Световой сигнал, испускаемый из образца, пропускали через фильтр Wratten, №16 перед попаданием на фотоэлектронный умножитель.

(б) Приборные измерения были все получены на идентичных установках и напрямую сопоставимы друг с другом (мВ=mV=милливольты).

(в) Прибор детектирования света детектирует излучение флюоресцеина несколько более эффективно, чем свет, испускаемый частицами. Кроме того, падающий монохроматический свет обогащен горизонтально поляризованным светом, и это снижает результаты, полученные для частиц из-за более низкого уровня светорассеяния от них, но не влияет на интенсивность света флюоресцеина. Общее приборное смещение в отношении сигнала флюоресцеина приблизительно 1.5-2-кратное.

Результаты, представленные в таблице 19, показывают сравнение относительных пределов чувствительности (при отношении "полный световой сигнал / неспецифический световой сигнал", составляющем приблизительно 2 к 1) золотых частиц диаметром 100 нм, частиц полистирола диаметром 110 нм и частиц полистирола диаметром 110 нм, содержащих 4400 молекул высокофлюоресцентного состава на частицу, в 95.7-процентной сыворотке. Эти результаты дополнительно демонстрируют, что золотые частицы диаметром 100 нм могут детектироваться при намного более низких концентрациях, чем частицы диаметром 110 нм, составленные из полистирола или полистирола, содержащего много молекул высокофлюоресцентного состава. Золотые частицы могут детектироваться в сыворотке при концентрациях приблизительно в 230 раз более низких, чем другие неметаллоподобные частицы.

Таблица 20 сравнивает количество рассеянного света, измеренного от идентичных концентраций золотых частиц диаметром 59.6 нм в растворе, содержащем высокую концентрацию сыворотки, и в растворе, содержащем только воду, при тех же самых условиях освещения. При этих условиях концентрация золотых частиц 1.8× 10^-12 М была обнаружима при отношении сигнал/фон около 3. Эти результаты показывают, что присутствие сыворотки или любой из обычных составных частей оказывается, не оказывает прямого влияния на светорассеивающую способность золотых частиц. Такая стабильность и инертность свойств светорассеяния металлоподобных частиц делает их чрезвычайно подходящими в образцах типа сыворотки и других образцах, которые содержат много других составных частей.

Детектирование сферических полистироловых или золотых частиц диаметром 100 нм в сыворотке обеспечивает следующий иллюстративный пример.

Молочная сыворотка содержит около 3.7 грамм процентов от протеина, из которого две трети составляет альбумин сыворотки. Детектирование частиц полистирола в сыворотке затруднено неспецифическим светорассеянием, которое исходит от протеина и другого вещества в сыворотке, а также от многих других источников. Сходство зависимостей интенсивности светорассеяния от длин волн падающего света видимой области для частиц полистирола, протеинов и других веществ в сыворотке строго ограничивает способность детектировать частицы полистирола в сыворотке или любой другой высокорассеивающей среде.

(а) Получено от компании Interfacial Dynamics Corp., Portland, Oregon. Каждая частица содержит в среднем приблизительно 4400 флюоресцентных молекул. Максимумы возбуждения и испускания для флюоресцентных молекул наблюдаются на 490 и 515 нм соответственно. Концентрация флюоресцентного соединения в частице составляет приблизительно 3× 10^-2 М.

(б) Получено от компании Interfacial Dynamics Corp.

(в) Изготовлено способами, известными в технике.

(г) Не осуществлялась фильтрация испускаемого света по длинам волн.

(д) Сигнал света, наблюдаемый здесь, принимается за единицу. Все другие значения нормированы относительно этого значения. Этот сигнал эквивалентен сигналу от 2× 10^-7 М флюоресцеина.

Таблица 20

Генерация сигнала от золотых частиц диметром 59.6 нм при высокой концентрации сыворотки и при нулевой концентрации сыворотки

Процентное содержание сыворотки	Концентрация золотых частиц	Длина волны падающего света	Относительная величина полного сигнала
0	1.8× 10-12 M	543 нм	1
95.7%	0	543 нм	0.58
95.7%	1.8× 10-12 M	543 нм	1.38

Золотые частицы имели измеренный диаметр 59.6 нм соответственно. 95.7%-ная сыворотка соломенного цвета и имеет оптическую плотность приблизительно 0.14 при длине пути = 1 см и на длине волны = 543 нм. Измерения предельного рассеяния выполнялись в стеклянной пробирке 6× 50 мм с внутренним диаметром приблизительно 5 мм. Оценивается, что поглощение света сывороткой снижает сигнал рассеянного света примерно на 15 процентов.

Использование длины волны падающего света 578 нм вместо 300 нм для освещения сыворотки приводит приблизительно к 13-кратному уменьшению сигнала неспецифического светорассеяния, но также приводит приблизительно к такому же уменьшению сигнала специфического рассеяния от частиц полистирола. Оказывается, что увеличение длины волны освещения для полистирола или других неметаллоподобных частиц значительно не увеличивает отношение сигнал/фон, то есть обнаружимость частиц полистирола в образце.

В противоположность этому, металлоподобные частицы детектируются до больших отношений сигнал/фон по сравнению с неметаллоподобными частицами посредством увеличения длин волн видимой области освещения и/или детектирования. Золотая частица диаметром 100 нм максимально рассеивает свет вблизи длин волн приблизительно 575 нм в водной среде, подобной воде. Освещение образца монохроматическим светом на длинах волн приблизительно 575 нм приводит к генерации максимального сигнала светорассеяния от золотых частиц и значительно снижает сигнал неспецифического светорассеяния. Например, при этих условиях полное неспецифическое светорассеяние уменьшается примерно в тринадцать раз по сравнению с длиной волны освещения 300 нм относительно длины волны падающего света 300 нм.

Освещение образца сыворотки падающим белым светом с использованием соответствующих оптических фильтров, которые минимизируют количество света вне рассматриваемых длин волн (меньше или больше определенной полосы с центром приблизительно 575 нм), обеспечивает другое средство для детектирования меньших количеств металлоподобных частиц в сыворотке. При этих условиях используется длина волны видимой области падающего света, которая дает максимальную интенсивность светорассеяния от золотой частицы, и сигнал неспецифического светорассеяния, исходящий из сывороточного белка и других веществ, а также из других источников, сильно уменьшается. Многочисленные типы различных металлоподобных частиц обнаружимы в образцах сыворотки при освещении белым светом (или несколькими различными длинами волн) и при использовании соответствующего набора оптических фильтров. Этот способ использует каждый тип частицы, имеющей различные длины волн падающего света, на которых происходит максимальное светорассеяние.

Другой подход включает фильтрацию полного светового сигнала от образца через подходящий поляризационный фильтр и/или полосовой фильтр. Использование подходящего поляризационного фильтра приведет к эффективному исключению неполяризованного флюоресцентного фона, но будет иметь незначительное влияние на фон неспецифического светорассеяния, так как оно в основном поляризовано. При использовании широкополосного освещения, например освещения белым светом, использование оптических полосовых фильтров более высокой длины волны позволяет получать значительное снижение фона неспецифического светорассеяния и флюоресценции.

Многие из металлоподобных частиц имеют высокие интенсивности светорассеяния в более длинноволновой области, и это свойство может использоваться в комбинации с использованием полосового фильтра и/или поляризационного фильтра. Например, сферическая золотая частица диаметром 300 нм имеет эффективность вблизи максимума рассеяния на длине волны приблизительно 700 нм и интенсивность ее рассеянного света приблизительно в шесть раз больше, чем золотой частицы диаметром 100 нм. Использование частицы диаметром 300 нм и полосового фильтра с центром полосы пропускания на длине волны 700 нм уменьшает неспецифический свет наполовину и увеличивает рассеивающую способность золотой частицы в шесть раз (по сравнению с частицей диаметром 100 нм). Таким образом, отношение сигнал/фон в этой системе было увеличено в 12 раз. Использование этого подхода к неметаллоподобным частицам, например полистироловым частицам сопоставимого размера, значительно не увеличивает отношение сигнал/фон, а может фактически понизить его. Использование антиотражающего покрытия на оптических элементах устройства и/или на камере для образца может также улучшать отношение сигнал/фон. Много других схем и подходов также возможно, и они могут быть очевидны специалисту.

Этот аспект изобретения в результате приводит к улучшенной способности различения сигнала специфического светорассеяния от сигнала фона неспецифического светорассеяния системы диагностического анализа по сравнению с другими способами, которые используют детектирование рассеянного света как часть типа анализа испытательной системы. Кроме того, пригодность различных типов металлоподобных частиц, которые проявляют различные цвета при освещении белым светом, обеспечивает возможность детектирования присутствия многочисленных типов частиц в одном образце, что имеет применимость для детектирования многочисленных типов аналитов в одном образце.

Дополнительное преимущество частиц металлоподобного типа состоит в химической инертности этих частиц относительно флюоресцентных составов. Такие частицы не обесцвечиваются светом и на их способность генерации сигналов не влияют такие механизмы.

Вышеупомянутые подходы - только несколько примеров из многих возможных подходов использования частиц, составленных из металлоподобных материалов, с целью улучшения различения сигнала специфического светорассеяния частицы от сигнала неспецифического светорассеяния, который может исходить из множества разнообразных источников. Например, возможно большое количество схем, в которых такие частицы определенным образом детектируются на длине волны, отличной от длины волны, на которой наблюдается максимальное светорассеяние для используемой частицы. Много других схем или подходов также возможно, и они должны быть очевидны специалисту.

Далее обсуждается детектирование одного или более аналитов в твердой фазе или в соответствующем образце путем детектирования одного или более свойств светорассеяния частиц.

Способы детектирования с использованием твердой фазы

В предыдущих разделах мы описали различные аспекты изобретения, касающиеся некоторых свойств светорассеяния металлоподобных частиц и детектирования этих частиц в растворе. Теперь мы будем описывать наши способы для детектирования частиц, которые находятся на поверхности или очень близко к поверхности.

Мы определили, что, используя золотые, серебряные и другие металлоподобные частицы с нашими способами освещения и детектирования DLASLPD, мы способны детектировать очень низкие количества частиц и связующих агентов, меченных частицей (покрытые частицы), на единицу площади, имея возможность детектировать отдельные частицы и частицы, покрытые связующими агентами, на или вблизи поверхности, используя простые средства освещения и детектирования. Эти способы могут использоваться либо на оптически прозрачных, либо на оптически непрозрачных поверхностях.

Мы определили, что с использованием некоторых комбинаций частиц и способов освещения и детектирования мы можем детектировать широкий диапазон плотностей частиц приблизительно от 0.001 до 10³ частиц на квадратный микрон (мкм²) в образце. Используя подходящий тип (типы) частиц, различные типы аналитов можно детектировать до очень низких уровней и в очень широких диапазонах концентраций в том же самом образце, как например, в микроматрицах. Это выполняется в одном устройстве путем использования как подсчета частиц (при низких плотностях частиц), так и измерений интегральной интенсивности света (при высоких плотностях) на том же самом образце. Например, если образец должен быть проанализирован относительно двух или более различных аналитов, используя средство, относящееся к твердой фазе, типа элементов матрицы или другие твердофазные способы, в образцах имеются различные типы аналитов при различных концентрациях. То есть некоторые аналиты могут находиться при более высоких или при более низких концентрациях - от пары до нескольких порядков величины по сравнению с другими аналитами в образце. Выбор подходящих типов частиц чрезвычайно важен для достижения желаемой чувствительности детектирования анализов и диапазона концентраций, для которых будет использоваться способ. Наши способы, которые мы здесь описываем, обеспечивают детектирование аналитов в таких образцах. Возможны даже более широкие диапазоны детактирования и большие чувствительности, если используются более мощные источники света, например лазеры, и если к нашим основным способам освещения и детектирования добавляются более тонкие способы детектирования, такие как формирование конфокального изображения.

Мы определили, что мы можем детектировать высокие плотности частиц с большей определенностью и легкостью, то есть с очень хорошим отношением сигнал/фон, используя простые способы. В некоторых аспектах настоящего изобретения используются собирающие линзы (линзы, формирующие изображение, зеркало или подобное устройство), а в других аспектах собирающие линзы не используются.

Рассеянный свет от частиц детектируется фотодетектором, как, например, фотодиодом или матрицей фотодиодов, фотоэлектронным умножителем, фотоаппаратом, телекамерой или другим прибором ПЗС или человеческим глазом. Количество частиц определяется путем подсчета числа частиц на единицу площади и/или путем измерения полной интегральной интенсивности света на единицу площади. Детектируемые или измеряемые специфические свойства рассеянного света представляют собой одно или более из перечисленных: интенсивность рассеянного света на одной или более длинах волн, цвет, поляризация, RIFSLIW и/или угловая зависимость света рассеянного частицей на единицу площади. Затем они коррелируются с присутствием, отсутствием и/или количеством аналита(-ов) в образце.

В некоторых типах анализа, где должны детектироваться один или более аналитов, могут использоваться один или оба способа - подсчет частиц или измерения интегральной интенсивности света. Следует отметить, что при правильном выборе частиц и при использовании DLASLPD способов освещения и детектирования обычно имеется такая большая оптически разрешаемая и обнаружимая интенсивность рассеянного света, что не требуются более сложные источники света и методы пространственной и оптической фильтрации. Однако в некоторых образцах, где могут иметься существенные величины неспецифического светового фона, критическое отношение сигнал/фон улучшается путем использования оптических фильтров, формирования конфокального изображения или других методов пространственной фильтрации апертурного типа для увеличения отношения "сигнал(-ы) света, рассеянного частицей / полный неспецифический световой фон".

В некоторых аналитических и диагностических применениях интенсивность рассеянного света может детектироваться и измеряться, используя наши основные способы без использования собирающей линзы или зеркала. В этих образцах одно или более свойств рассеянного света детектируются и измеряются тем же самым способом, как описано выше, без использования собирающей линзы. Далее эти способы обсуждаются более подробно.

Детектирование рассеянного света от светорассеивающих частиц с использованием собирающей линзы или зеркала

Мы обнаружили, что мы можем использовать различные типы оптических приборов, собирающих свет, для сбора рассеянного света частиц. Мы использовали и подсчет частиц и измерения интенсивности (интегральная интенсивность на единичную площадь поверхности), чтобы детектировать одно или более специфических свойств светорассеяния частиц на заданной площади с нашими DLASLPD способами освещения и детектирования. В большинстве проведенных нами экспериментов мы обнаружили, что когда плотности частиц составляют приблизительно 0.1 частиц на (мкм²), то в основном полезно использовать способ измерения подсчетом, а когда плотности частиц приблизительно больше 0.1 частиц на (мкм²), то пригодным способом измерения является измерение полной интегральной интенсивности света. Следует, однако, отметить, что можно использовать измерение подсчетом или измерение полной интегральной интенсивности света при плотности частиц больше или меньше, чем приблизительно 0.1 частиц на (мкм²).

Использование специфического типа или типов линзы для сбора и/или отображения рассеянного света от образца, который мы сочли полезным, зависит от области или площади поверхности, представляющей интерес, типа контейнера для образцов, подлежащих измерению, и верхнего предела плотностей частиц, которые должны измеряться путем подсчета частиц. Например, если мы заинтересованы в измерении больших площадей для детектирования рассеянного света, то для собирания света от образца может использоваться объектив микроскопа с увеличением х10 или даже меньше, или линза, или зеркало. Аналогично, если должны быть измерены меньшие площади образца, то для собирания света от образца может использоваться линза объектива микроскопа с увеличением х20, х40, х100, или подобная линза или зеркало. Если способ подсчета частиц должен использоваться при более высоких плотностях частиц, то линзы объективов с большим увеличением позволяют получать лучшее разрешение частиц при высоких плотностях. Следует отметить, что когда используются большие объективы, то начинают играть роль дополнительные требования и ограничения. Например, рабочее расстояние становится очень маленьким и может понадобиться иммерсионное масло для добавления к образцу. Когда используется фотоаппарат, телекамера или подобный фотодетектор типа ПЗС, то детектируется полный рассеянный свет от площади образца. Эта информация затем может быть обработана простым аппаратным средством и/или средством программного обеспечения с целью анализа измерений рассеянного света. Это открывает огромные возможности, поскольку при помощи твердофазной микроматрицы, элемента матрицы или подобного формата могут детектироваться и количественно определяться многие различные аналиты в образце. В формате микроматрицы маленькие площади поверхности покрываются каждая в пространственно отличной области различными типами связующего агента, который определенным образом связывает отдельный аналит. Далее мы описываем специфические применения настоящего изобретения к твердофазным многоаналитным микроматрицам и т.п.

Способ подсчета частиц - обычно более требовательный к технике, чем способ измерения интегральной интенсивности света. Однако для очень чувствительного детектирования одного или более свойств светорассеяния частицы имеется много преимуществ использования метода подсчета. Например, флюктуации и неоднородности в источнике света или камере для образца не влияют на измерение подсчетом частиц, тогда как эти эффекты могут вызывать серьезные проблемы при использовании способа измерения интегральной интенсивности света. Кроме того, имеется много средств программного и аппаратного обеспечения для увеличения качества и отношения сигнал / фон измеренных частиц методами подсчета.

Детектирование светорассеивающих частиц без использования собирающей линзы или зеркала

Мы также разработали способы, в которых необязательно использование собирающей линзы, чтобы детектировать рассеянный свет частиц на или вблизи поверхности. В этой установке мы обычно детектируем рассеянный свет, исходящий от исследуемой площади, по интегральной интенсивности света. Это может быть выполнено невооруженным глазом или фотодетектором, как описано ранее. Мы обнаружили, что, когда мы используем металлоподобные частицы диаметром приблизительно 120 нм или меньше, мы можем значительно увеличивать отношение "сигнал светорассеяния частицы /полный неспецифический световой фон", помещая наш детектор (либо глаз, либо фотодетектор) под углами, находящимися вне огибающей углового распределения рассеянного света в прямом направлении.

Ключевые моменты, касающиеся увеличения отношения сигнал/фон

Прежде чем подробно описывать DLASLPD способы освещения и детектирования, полезно перечислить ключевые моменты, которые при использовании определения сигнала и отношения сигнал/фон в том или ином виде ограничивают детектирование светорассеивающих частиц. Эти способы являются дополнительными к настройке или изменению различных компонентов устройства, таких как использование более мощного светового источника; светового источника, коллимированного в более высокой степени; меньшая полоса длин волн светового источника; световой источник с различными длинами волн; более чувствительный фотодетектор; оптические и/или пространственные фильтры между источником освещения и образцом и/или между образцом и детектором; и/или конфокальный или подобный ему способы формирования изображения. Эти стратегии и способы описываются далее.

(1) Посредством большего диаметра металлоподобных частиц рассеивающая способность частицы может быть значительно увеличена. Увеличение размера может также изменить зависимость интенсивности рассеивающего света от длины волны падающего света. Эти свойства могут быть отрегулированы так, чтобы удовлетворять требованиям определенного типа анализа, так, чтобы одно или более свойств светорассеяния можно было легко детектировать. Например, для измерения аналитов в образцах с высоким неспецифическим световым фоном подходит большая золотая частица приблизительно диаметром 80-120 нм или более. Максимальная длина волны, на которой наблюдается максимальное светорассеяние, сдвигается в сторону больших длин волн, и интенсивность рассеянного света также увеличивается по сравнению с золотой частицей диаметром 40 нм. Комбинация из этих двух эффектов значительно увеличивает отношение сигнал/фон по сравнению с золотой частицей диаметром 40 нм.

(2) При измерении рассеянного света образца под углами вне огибающей углового распределения рассеянного света в прямом направлении отношение сигнал/фон существенно увеличивается либо в режиме подсчета, либо в режиме измерения интенсивности. Мы наблюдали, что детектор можно поместить либо выше, либо ниже плоскости поверхности образца, а также на той же стороне или на противоположной стороне от плоскости образца, на которой фокусируется луч освещения. В этих различных ориентациях сигналы специфического светорассеяния от частиц детектируются вне огибающей прямого направления рассеянного света, в то время как большая часть неспецифического рассеянного света из-за оптических аберраций в камере для образца и от других составных частей в образце находится в пределах этой огибающей углового распределения рассеянного света в прямом направлении. Это позволяет детектировать рассеянный частицами свет с большей чувствительностью и определенностью.

(3) Величина неспецифического отраженного света также влияет на чувствительность детектирования, как мы уже описали ранее. Мы обнаружили, что величина отраженного света может быть существенно уменьшена путем удаления поверхности падения света как можно дальше от детектируемой площади сбора. Это может быть выполнено многими различными способами, включая подходящую конструкцию камеры для образца (обсуждается позже). Например, мы заметили, что если мы наносили тонкий слой иммерсионного масла на нижнюю часть предметного стекла, через которое световой луч освещает частицы на противоположной поверхности, то результаты сильно улучшались. В другом эксперименте, когда мы приклеивали маленькую пластмассовую светонаправляющую систему к основанию пластмассовой камеры для образца с микроматрицей связанных частиц на противоположной стороне поверхности, мы наблюдали улучшенные результаты. Мы также использовали намного большие оптические средства юстировки типа равнобочной призмы и/или других типов призм или оптических светонаправляющих систем и наносили иммерсионное масло на поверхность, на которой контейнер для образцов соприкасается с призмой. Мы сделали вывод, что эти превосходные результаты обусловлены тем, что: (i) поверхность падения света удаляется на большее расстояние от площади детектирования, которая содержит светорассеивающие частицы; (ii) угол падения = 0 градусов на поверхность световода, например, на переднюю сторону призмы и т.п. (относительно перпендикуляра) и (iii), что большая часть отраженного света, который возникает в системе, выводится из системы и удаляется от точки собирания. Все эти способы полезны для увеличения отношения сигнал/фон для детектирования светорассеивающих частиц в различных образцах. Имеются несколько стратегий направления света, которые могут использоваться для эффективного отведения отраженного света из системы с целью улучшения отношения сигнал/фон.

(4) Способы повышения показателя преломления также чрезвычайно полезны в увеличении отношения сигнал/фон во многих различных типах образцов. Мы обнаружили несколько способов увеличения отношения сигнал/фон, некоторые из которых теперь будут обсуждаться. Использование жидкости для покрывания поверхности, содержащей частицы, в этом случае чем ближе показатель преломления жидкости к показателю преломления поверхности, которая содержит частицы, тем лучше отношение сигнал / фон. Мы обнаружили, что для детектирования аналитов на сухой твердой фазе отношение сигнал / фон улучшается посредством нанесения жидкого слоя на поверхность. Например, когда водный буферный раствор с показателем преломления приблизительно 1.33, используется для покрывания поверхности образца, то мы получаем результаты, намного улучшенные по сравнению с измерением частиц на той же поверхности в воздухе. Еще лучшее отношение сигнал / фон получается при использовании жидкости, которая лучше согласуется по показателю преломления с твердой фазой. Например, анализ может быть выполнен путем первоначального связывания аналитов со светорассеивающими частицами, покрытыми связующим агентом, с твердой фазой в среде образца или в другой подходящей реакционной смеси или буферном растворе. Раствор в образце затем разбавляется или заменяется раствором выбранного показателя преломления, который покрывает твердую фазу перед детектированием частиц. Таким образом, могут быть получены высокочувствительные результаты.

В дополнение к вышеупомянутым способам, дополнительное использование узкополосных оптических фильтров, обрезающих оптических фильтров, пространственной фильтрации, такой как апертура между лучом освещения и образцом и/или между образцом и фотодетектором или глазом, также увеличит отношение сигнал/фон. Использование методов формирования конфокального изображения может также быть полезным в некоторых применениях аналитического анализа, где стоимость и сложность таких методов и устройства не существенны. Использование источников с излучением в более длинноволновой области с оптической фильтрацией или без нее также способно увеличить отношение сигнал/фон. Отвод избыточного неспецифического света из системы путем использования определенным образом сконструированных камер для образца с целью устранения избыточного света - другой полезный способ. Основные подходящие конструкции камер для образцов описываются ниже. Все из этих вариаций одного или более аспектов настоящего изобретения обеспечивают увеличенное отношение сигнал/фон и, таким образом, обеспечивают детектирование одного или более аналитов в образце с большей определенностью и чувствительностью.

Имеется много различных путей специфического применения DLASLPD способов освещения и детектирования к образцу, и они перечислены на фиг.15. Фиг.14 изображает схему ориентации и описания DLASLPD способов, перечисленных на фиг.15. Специалисту должны быть понятны применимость и возможности способов при использовании с некоторыми металлоподобными частицами с целью детектирования одного или более аналитов в твердой фазе или подобном образце.

Теперь эти способы будут описаны подробно.

Осветительная и собирающая свет оптика

1. Основные концепции

Для детектирования светорассеивающих частиц могут применяться твердофазные способы, которые мы теперь описываем. Детектирование и измерение одного или более свойств светорассеяния может коррелироваться с присутствием, отсутствием или концентрацией одного или более аналитов в образце. Эти способы могут использоваться с большинством, если не со всеми известными твердофазными аналитическими способами, включая микроматрицу, элемент матрицы или подобные форматы анализа. Способ рассчитан на широкий диапазон чувствительности (от диапазона низкой чувствительности до диапазона сверхвысокой чувствительности). Этот диапазон чувствительности достигается вместе с удобством использования и недорогим устройством.

В этом методе абсолютное число или относительное число частиц на поверхности определяется способами, которые зависят от свойств светорассеяния частиц. Система детектирования в основном состоит из: (1) увеличительной линзы (также называемой линзы формирования изображения или собирающей линзы), которая формирует увеличенное изображение участка светорассеивающих частиц или части участка; и (2) системы освещения, которая приводит к проявлению частиц в виде светлых объектов на темном фоне (DLASLPD способ). Способ также может быть выполнен без собирающей линзы. Число частиц в увеличенном изображении может определяться количественно подсчетом частиц или измерением интенсивности рассеянного света (которая пропорциональна числу частиц или плотности). Подсчет частиц может выполняться: (а) глазом (невооруженным или с глазной линзой в зависимости от размера частиц), (б) электронной системой отображения (например, телекамерой, камерой на приборах с зарядовой связью, электронно-оптическим преобразователем) или (в) светочувствительным детектором с ограничительной апертурой и устройством сканирования луча света. Интенсивность рассеянного света может быть измерена с помощью электронной системы формирования изображения или светочувствительного детектора. При низких поверхностных плотностях частиц (приблизительно менее 0.1 частиц на мкм²) предпочтителен способ подсчета, в то время при более высоких поверхностных плотностях частиц (особенно, где отдельные частицы находятся на расстоянии, меньшем, чем пространственная разрешающая способность линзы) предпочтительно измерение интенсивности рассеяния постоянного света. Метод разработан для легкого перехода между этими двумя способами детектирования, то есть между подсчетом частиц и измерениями интенсивности, и может использоваться с диаметрами частиц приблизительно до 20 нм в зависимости от светорассеивающей способности частиц и специфических компонентов аппаратных средств устройства детектирования.

Осветительные системы

Осветительная система – ключевой элемент метода

Осветительные системы предназначены для освещения участка частиц или группы точечных частиц с высокой интенсивностью света таким образом, чтобы отдельные частицы проявлялись в виде светлых объектов на темном фоне. Это обеспечивает возможность визуализации частиц, прикрепленных к поверхности, или свободных частиц в пленке текучей среды на поверхности.

Свободные частицы отличаются от фиксированных частиц по их броуновскому движению, которое отсутствует у фиксированных частиц. В следующих разделах мы описываем детали и принцип действия осветительных систем.

Заявитель экспериментировал со многими различными системами освещения, включая дорогостоящий осветительный прибор темного поля, называемый ультраконденсором (фирмы Zeiss). Могут использоваться два основных способа освещения и несколько вариантов этих двух способов. Эти способы проще и, оказывается, производят большие интенсивности света от осветителя, чем, например, ультраконденсор.

Общее описание основных способов освещения

Системы освещения предназначены для: (1) направления луча света высокой интенсивности на участок (или группу точек) светорассеивающих частиц, и (2) минимизации количества света от осветителя, который поступает в систему детектирования прямо или путем отражений. Это достигается путем ограничения светового луча и его отражений до углов, которые лежат за пределами световых собирающих конусов системы детектирования. В одном способе освещения собирающая линза и источник света находятся на противоположных сторонах поверхности твердой фазы (освещение снизу), а в другом способе источник света и увеличительная линза находятся на одной стороне поверхности.

Прямое освещение снизу увеличительной линзы

Фиг.1 изображает схему одного из основных способов используемого освещения. В этом способе свет падает на поверхность S твердой фазы снизу поверхности. Предполагается, что S - прозрачна (хотя может иметь некоторый цвет). О - область на поверхности, которая содержит светорассеивающие частицы. Увеличительная или собирающаяся линза L расположена над S. Углы, под которыми линза L собирает свет, изображены как пунктирный конус С (светособирающий конус линзы L) с вершиной на поверхности S (на которой расположены светорассеивающие частицы) и с основанием, которое определяется диаметром D линзы. Луч света от осветителя (LB) направлен под таким углом, что он не входит в светособирающий конус линзы L. Стрелки показывают направление хода луча LB.

Твердая фаза может быть, например, предметным стеклом, планшетом для микротитрования или прозрачными твердыми фазами других типов, используемыми в клинической диагностике. Световой источник может быть световым источником любого типа, например лампой накаливания, разрядной лампой, светодиодами, лазерами и т.п. Свет собирается из луча света от осветителя с использованием оптоволоконных световодов и светособирающих линз и затем фокусируется на светорассеивающие частицы с помощью конденсорной линзы. Средний угол Θ , который световой луч составляет с поверхностью S, подбирается так, чтобы луч света не попадал на линзу L, как объяснялось выше. Регулировка угла Θ может легко быть выполнена визуальным наблюдением светорассеивающих частиц через увеличительную линзу и окуляр (составное устройство микроскопа) путем регулировки угла так, чтобы частицы проявились в виде светлых объектов на темном фоне. Этот угол также хорошо служит для измерений интенсивности светорассеяния, хотя при высоких плотностях частиц требование к фокусировке не такое строгое.

Величина угла Θ может быть выведена из числовой апертуры увеличительной линзы. Для сверхчувствительного детектирования объектив микроскопа используется в качестве увеличительной или формирующей изображение линзы. Объектив микроскопа обычно имеет числовую апертуру, надписанную на корпусе. Числовая апертура может быть определена в терминах схемы фиг.2. Эта фигура изображает увеличительную линзу (с фокусным расстоянием f), которая фокусирует свет на участок светорассеивающих частиц 0. Расстояние между линзой и точкой 0 равно f. Линза (L) собирает весь свет, рассеянный от участка 0, в телесный конус, основание которого является диаметром D линзы. Угол Θ _H определяется как половина плоского угла этого телесного конуса. Числовая апертура (N.A.) конуса связана с углом Θ _H выражением

где n - показатель преломления среды между линзой и точкой 0. Среда может быть, например, воздухом (n=1), водой (n=1.33) или иммерсионным маслом (n=1.5). Для маленьких значений Θ _H числовая апертура N.A. приблизительно равна D/2f, где D - диаметр линзы и f - фокусное расстояние.

Следующая таблица дает типичные значения для числовых апертур и углов Θ _H, обычно используемых объективов (для n=1)

Как уже упомянуто, луч возбуждающего света должен направляться под таким углом, чтобы он был вне телесного конуса сбора света увеличительной линзы. Для высоких значений увеличения угол, под которым возбуждающий луч падает на поверхность твердой фазы, должен быть большим. Например, для объектива с увеличением × 40 падающий угол должен быть больше 40° . Поскольку доля света, отраженного от поверхности, увеличивается с углом падения, то мы должны следить за тем, чтобы углы, которые должны использоваться в нашей системе освещения, не привели в результате к большой потере света из-за отражения. Кроме того, мы должны следить за тем, чтобы при больших углах падения не возникло критического отражения (полное внутреннее отражение). Следующий раздел представляет краткое обсуждение фундаментальных законов преломлении и отражения, необходимых в последующем обсуждении эффектов отражения в этой системе освещения.

Закон преломления Снеллиуса

Мы описываем закон преломления Снеллиуса в терминах схемы фиг.3. Это фигура изображает световой луч, который проходит через среду с показателем преломления ni (i индекс среды, из которой падает свет), и падает на поверхность S среды с показателем преломления nt (t индекс для среды прохождения). Часть падающего света проходит в среду t (преломляемый луч) и часть отражается (отраженный луч) назад в среду i. Если угол падения - Θ i, то тогда угол преломляемого луча дается в соответствии с законом Снеллиуса, который может быть записан как

Если ni<nt, тогда Θ i<Θ t. Если ni>nt, тогда Θ i>Θ t. Заметим, что углы измеряются относительно линии, которая перпендикулярна поверхности S. Отраженный луч образует угол Θ r=Θ i (то есть отраженные и падающие углы равны).

Законы преломления. Доля падающего света, которая отражается от поверхности

Доля R интенсивности падающего света, которая отражается при различных углах падения Θ i, может быть рассчитана с использованием уравнений Френеля для отражения. (Следует отметить, что интенсивность здесь определяется как энергия в единицу времени на единицу площади. Интенсивность также называется - энергетическая освещенность). Для простоты, однако, мы представили наше обсуждение в терминах графиков зависимости R от угла Θ i. Точная зависимость R от Θ i определена значениями ni и nt и состоянием поляризации падающего света. Важные факты, касающиеся коэффициента отражения, заключаются в следующем.

i. Коэффициент отражения для случая, когда световой луч проходит из среды с низким показателем преломления в среду с высоким показателем преломления (ni<nt).

Фиг.4 изображает графики зависимости R от Θ i (ω =Θ i) для случая, когда ni=1 (воздух) и nt=1.5 (последний близок к показателю преломления стекла или пластмассы) и для света, поляризованного параллельно (rр) и перпендикулярно (rs) к плоскости падения. Плоскость падения определяется как плоскость, которая содержит падающий световой луч и перпендикуляр к поверхности (см. фиг.3). Коэффициент отражения R неполяризованного света дается средним между графиками для света, поляризованного параллельно и перпендикулярно к плоскости падения.

На фиг.4 график коэффициента отражения для неполяризованного света помечен Ord (для обычного). Графики фиг.4 показывают, что:

а) rs увеличивается непрерывно с увеличением ω (ω на фиг.3 - то же самое, что используемое здесь Θ i). Увеличение rs мало, приблизительно до 70° (когда коэффициент отражения составляет только приблизительно 15%), а затем увеличивается намного быстрее, достигая коэффициента отражения 100% под углом 90° . Таким образом, доля отраженного света меньше 20% вплоть до углов падения 60° .

б) rр уменьшается с увеличением ω приблизительно до 57° , при котором величина rр=0. Угол, при котором rр=0, называется углом Брюстера, или углом поляризации. Угол Брюстера Θ b может быть рассчитан из выражения

в предположении, что ni=1 (воздух). Для nt=1.5 верхнее уравнение дает Θ b=56.3. Следует отметить, что при угле Брюстера выполняется соотношение: Θ i+Θ t=90° . Таким образом, для nt=1.5: Θ i = Θ t=56.3° и Θ i=33.7° . Для углов, больших угла Брюстера, величина rр быстро увеличивается с увеличением ω и достигает значения 100% при 90° .

в) Для неполяризованного (обычного света) коэффициент отражения увеличивается постепенно с увеличением в приблизительно до 70° и затем быстро увеличивается, достигая 100% при 90° . Меньше 20% падающего света отражается для углов Θ i<70° .

г) Следует отметить, что интенсивности отраженного и прошедшего света не складываются до интенсивности падающего света. Кажется, что это нарушает закон сохранения энергии. Это очевидное нарушение действительно обусловлено определением интенсивности как энергии в единицу времени на единицу площади. Из-за преломления падающий и прошедший свет не имеют одинаковой площади сечения. Если различия в площадях сечения учитываются, то можно показать, что энергия в единицу времени в отраженном и прошедшем лучах складываются до энергии в единицу времени в падающем луче света.

ii) Преломление для случая, когда свет распространяется из среды с высоким показателем преломления в среду с низким показателем преломления (ni>nt).

Фиг.5 изображает графики коэффициента отражения поляризованного света в зависимости от угла падения (ω =Θ i) для ni=1.54 и nt=1. Графики сильно отличаются от графиков фиг.4 для ni<nt. Наиболее существенная разница состоит в том, что при угле падения приблизительно больше 41° весь свет отражается (отражение 100%, полное отражение). Наименьший угол падения, при котором происходит полное внутреннее отражение, называется критическим углом отражения Θ с. Значение этого угла зависит от значений ni и nt. Выражение для вычисления Θ с из значений ni и nt может быть выведено, рассматривая углы падающего и прошедшего лучей света при достижении критического угла. Под критическим углом Θ с отраженный луч содержит большую часть падающего света и составляет угол Θ с с перпендикуляром к поверхности, как требуется в соответствии с законами для зеркального отражения. Прошедший свет имеет низкую интенсивность, и его угол Θ t относительно перпендикуляра составляет 90° . То есть прошедший световой луч распространяется параллельно поверхности. Мы можем поэтому получить значение Θ с, вставляя Θ t=90° в уравнение Снеллиуса. Эта подстановка даст

Поскольку sin(90)=1, мы можем записать

Для случая nt=1.54 и ni=1 (воздух) вышеупомянутое уравнение дает Θ с=40.5° . Следует отметить, что критический угол одинаков для неполяризованного света и света, поляризованного перпендикулярно или параллельно плоскости падения. То есть Θ с не зависит от того, является ли свет неполяризованным или плоско поляризованым.

iii) Влияние эффектов отражения и преломления света на освещение участка светорассеивающих частиц

Сначала рассмотрим простой случай, в котором частицы находятся на поверхности сухого предметного стекла в воздухе. Т.е. частицы сухие и с обеих сторон предметного стекла находится воздушная среда. Фиг.6 изображает схему отражения и преломления в этом случае. Первое отражение происходит на поверхности S1 (ni<nt, ni=1 и nt=1.5). Фиг.4 показывает, что доля отраженного света составляет меньше 20% для углов падения вплоть до 70°. Следовательно, отражения на поверхности S1 не проблематичны в этом способе освещения. Поверхность 2 могла бы быть проблематичной потому, что световой луч переходит из среды с низким в среду с высоким показателем преломления и существует вероятность полного внутреннего отражения на этой поверхности. Критический угол для полного внутреннего отражения на поверхности, где ni=1.5 и nt=1 (воздух), составляет приблизительно 42° (вычислено с помощью уравнения (40)). Вопрос теперь состоит в том, достигнут ли этот критический угол, когда падающий световой луч на поверхности 1 имеет большой угол.

Фиг.7 изображает график зависимости Θ i2 [Θ tj] от Θ i1 [Θ ij], вычисленной из уравнения Снеллиуса (37), и используя равенство Θ t1=Θ i2. Как видно из графика, ©i2 быстро увеличивается с увеличением Θ i1 приблизительно до Θ i1=70° . Увеличение Θ i2 затем выравнивается и не достигает критического угла до Θ i1=90° . Однако при Θ i1=90° свет совсем не проходит через S1. Мы, таким образом, заключаем, что для конфигурации фиг.4 критическое освещение никогда не достигается под любым практическим углом Θ i1. Кроме того, отражения значительно не уменьшают величину света, попадающего на частицы на поверхности S2 для значений угла Θ i1 приблизительно менее 70° .

Мы проверили вышеупомянутые заключения экспериментально. В наших экспериментах, однако, мы обнаружили, что свет, рассеянный пятнами, грязью, царапинами и другими дефектами или артефактами на поверхностях S1 и S2 (неспецифическое светорассеяние), может стать сопоставимым со светом, рассеянным частицами на S2 и, таким образом, значительно увеличивает фоновый свет и уменьшает чувствительность детектирования частиц. Однако неспецифический свет, рассеянный артефактами на S1 и S2, концентрируется в прямом направлении луча света от осветителя, тогда как свет, рассеянный частицами (для маленьких частиц), имеется во всех направлениях. Эти эффекты показаны на фиг.8.

На фиг.8 интенсивность неспецифического света, рассеянного поверхностными артефактами в любом направлении Θ , задается длиной линии (с углом Θ ), проходящей от исходной точки 0 до огибающей интенсивности. Свет, рассеянный частицами, изображается в виде пунктирных линий, которые выходят из точки 0 во всех направлениях. Влияние неспецифического светорассеяния на детектирование специфического светорассеяния может быть показано путем экспериментального использования предметного стекла, содержащего на поверхности золотые частицы диаметром 60 нм. В воздухе эти частицы рассеивают зеленый свет и в отсутствие неспецифического светорассеяния освещенный участок частиц проявляется как зеленый участок на темном фоне. Поверхностные артефакты рассеивают белый свет, и когда этот тип неспецифического светорассеяния накладывается на специфическое светорассеяние частиц, свет, рассеянный от участка частиц, имеет зеленовато-белый цвет вместо чистого зеленого цвета. Эффекты преимущественного прямого рассеяния поверхностными артефактами могут наблюдаться, если рассматривать рассеянный свет глазом, расположенным под различными углами Θ v, как показано на фиг.8. Когда глаз располагается под углом Θ v, рассеянный свет имеет зеленоватый белый цвет. По мере того, как угол наблюдения Θ v увеличивается, белый цвет уменьшается, и при Θ v, большем 30° , виден только чистый зеленый цвет от золотых частиц. Таким образом, в настоящем изобретении полезно наблюдать глазом или детектировать с помощью средства фотодетектора угол, больший, чем Θ v=30° . Как мы показываем позже, неспецифическое светорассеяние, обусловленное поверхностными артефактами, может быть дополнительно уменьшено посредством освещения через светонаправляющие системы, как например, с помощью призменной системы.

Далее мы рассматриваем случай, в котором светорассеивающие частицы находятся в тонкой пленке воды, которая находится на предметном стекле и покрыта покровным стеклом, как показано на фиг.9. Луч света от осветителя проходит четыре поверхности, на которых происходят изменения показателя преломления, а именно S1 (из воздуха в стекло), S2 (из стекла в воду), S3 (из воды в стекло), S4 (из стекла в воздух). Рассмотрение отражения и преломления на каждой поверхности, аналогичное выполненному в предыдущих параграфах, приводит к заключению, что в системе фиг.9 отражения незначительно снижают величину световой энергии, передаваемой светорассеивающим частицам, и что критическое отражение не происходит ни на какой поверхности. Неспецифическое светорассеяние, обусловленное поверхностными артефактами на поверхностях 31 и 34, присутствует как в случае фиг.8. Однако присутствие воды сильно снижает неспецифическое светорассеяние для поверхностей 32 и 33.

Прямое освещение со стороны увеличительной линзы

Этот способ освещения показан на фиг.10. Смысл обозначений S, L, С и LB - тот же, что на фиг.2. На этой фигуре луч возбуждающего света падает на поверхность S сверху. Светособирающая линза также находится над поверхностью S. Луч возбуждающего света направлен под таким углом, что ни падающий, ни отраженный свет не попадает в светособирающий конус С линзы L. В этом способе освещения необходимо предохранять свет, отраженный от различных поверхностей на пути луча, от отражения на светособирающий конус С увеличительной или изображающей линзы L. Поскольку угол отражения равен углу падения на каждой поверхности, то собирание нежелаемого отраженного света L может быть минимизировано путем ограничения луча света от осветителя до тех углов, которые находятся вне конуса С. Можно показать, как в предыдущем разделе, что отражения незначительно снижают величину энергии, передаваемой светорассеивающим частицам, и что критическое отражение не происходит на сухих или покрытых водой частицах. Неспецифическое светорассеяние, обусловленное поверхностными артефактами, такое же, как обсуждалось в предыдущем разделе.

Освещение с помощью призменной схемы

i. Освещение снизу

Фиг.11 представляет призменную схему. В простейшем виде она состоит из треугольной призмы, на которой могут помещаться лунки для микротитрования, предметные стекла, микроматрицы на пластмассовых или стеклянных подложках и т.п., которые содержат детектируемые светорассеивающие частицы. Камера для образца или предметное стекло, которое содержит светорассеивающие частицы, располагаются на верхней поверхности S2 призмы, поверхность, содержащая частицы, находится в фокусе линзы L. Иммерсионное масло наносится между камерой для образца или предметным стеклом и призмой, чтобы минимизировать неспецифический свет путем согласования показателя преломления. Частицы сухие в воздухе. Если показатели преломления на поверхности S2 точно или почти точно соответствуют, то световой луч не подвергается значительному преломлению или отражению на поверхности S2. Таким образом, световой луч от подсветки распространяется приблизительно по той же прямой линии, по которой он проходит через призму и поверхность, содержащую светорассеивающие частицы. Однако имеется преломление на границе раздела воздух - призма S1 и на S3. Рассмотрим луч света от осветителя, который входит в призму в направлении, которое перпендикулярно поверхности S1 (угол падения = 0° ) и предположим, что эта призма - призма с углом при вершине 45° (угол γ =45° ). Поскольку луч проходит по прямой линии от поверхности S1 до точки 0 на поверхности S3, то он падает на поверхность под углом 45° . Затем луч будет подвергаться полному внутреннему отражению, так как критический угол для границы раздела стекло - воздух составляет приблизительно 42° . Таким образом, в отличие от освещения снизу без призмы (см. фиг.6), призменная схема допускает критическое отражение. Напомним, что в отсутствие призмы (фиг.6) критическое отражение не может быть достигнуто из-за преломления света на S1, как показано на фиг.6 (также см. фиг.7). Чтобы передать световой луч с высокой энергией, используя светонаправляющую систему типа призмы, луч света от осветителя должен быть направлен так, чтобы он падал на поверхность S3 (фиг.11) под углом, меньшим 42° . Вопрос теперь состоит в том, позволяют ли углы падения на поверхность S3, меньшие 42° , удовлетворить тому условию, что свет, выходящий на S3, должен быть вне собирающего конуса линзы L. Предположим, что угол падения на поверхность S3 составляет 35° . Из закона Снеллиуса (с ni=1.5 и nt=1) мы вычисляем, что угол выхода равен 62° , который находится вне собирающего конуса нашего наиболее часто употребляемого объектива, а именно объектива с увеличением × 40 и углом Θ _H=41° . Мы делаем вывод, что призменная схема фиг.11 позволяет передавать высокую световую энергию сухим светорассеивающим частицам в воздухе при сохранении темного фона.

Теперь мы рассматриваем призменную схему фиг.11, в которой светорассеивающие частицы покрыты водой и покровным стеклом. Как описано выше, луч возбуждающего света проходит по прямой линии от S1 до точки 0, где он сталкивается с границей раздела стекло - вода. Затем он проходит через воду и покровное стекло, наконец сталкиваясь с границей раздела стекло - воздух на верхней поверхности покровного стекла. Интересно рассмотреть отражения, которые происходят в границах раздела стекло - вода и стекло - воздух. Угол критического отражения на поверхности раздела вода - воздух равен 62.5° (при использовании ni=1.5 и nt=1.33 в уравнении (40)). Введение воды на поверхности S3, таким образом, допускает освещение при значительно больших углах, чем в воздухе, без возможности полного внутреннего отражения. Кроме того, при углах, меньших 62.5° , коэффициент отражения на поверхности раздела стекло - вода низкий. Теперь мы рассматриваем отражение на поверхности раздела покровное стекло - воздух. Рассмотрим луч света, который входит перпендикулярно в поверхность S1. Если это призма - призма с углом при вершине 45° , то луч падает под углом 45° на поверхность S3, где он подвергается полному внутреннему отражению. Преломление на поверхности S3 (из стекла в воду) изменяет угол луча до 55° . Однако преломление на поверхности раздела вода - покровное стекло преломляет луч опять к 45° . Луч, таким образом, падает на поверхность раздела покровное стекло - воздух под углом 45° . Призменная схема с частицами в воде и с покровным стеклом, таким образом, обеспечивает возможность эффективной передачи световой энергии светорассеивающим частицам (прикрепленным к поверхности S3 или свободным в воде), но падающий свет полностью отражается на покровном стекле.

Из вышеупомянутого обсуждения мы делаем вывод, что не имеется никаких отражений, которые серьезно влияли бы на передачу световой энергии светорассеивающим частицам в пленке воды. Полное отражение происходит на поверхности раздела покровное стекло - воздух, но это отражение не влияет на передачу энергии падающего света рассеивающим частицам.

Из вышеупомянутых обсуждений очевидно, что и призменные, и непризменные схемы позволяют эффективно передавать энергию путем освещения под углом частиц, прикрепленных к поверхности, или свободных частиц в растворе. Под эффективной передачей мы подразумеваем, что луч света не подвергается полному внутреннему отражению на любой подходящей поверхности и что сбор неспецифического света минимизирован. Однако мы экспериментально обнаружили, что в некоторых применениях превосходные способности детектирования получаются с помощью призменной схемы, поскольку она устраняет или значительно снижает артефакты, обусловленные рассеянием на неоднородностях стеклянных или пластмассовых поверхностей вблизи светорассеивающих частиц. Иммерсионное масло, используемое для сцепления твердой фазы с призмой, устраняет почти полностью неспецифическое светорассеяние от неоднородностей на поверхности S2 (фиг.11). Оказывается, эти эффекты обусловлены механизмом согласования показателей преломления. Неспецифический свет, рассеянный в точке входа светового луча на поверхности S1, удаляется от частиц специфического рассеяния в точке 0 (если призма достаточно большая) и не вносит вклад в рассеянный свет, собираемый увеличительной линзой. Кроме того, если частицы специфического рассеяния находятся в воде, показатель преломления, согласованный водной пленкой, значительно снижает неспецифическое рассеяние на поверхности S3. Кроме того, в присутствии воды и покровного стекла луч света от осветителя подвергается полному отражению на поверхности раздела покровное стекло - воздух. Это отражение значительно уменьшает неспецифическое рассеяние от неоднородностей на поверхности раздела покровное стекло - воздух, потому что только маленькое количество световой энергии достигает неоднородностей на этой поверхности. Кроме того, полное внутреннее отражение уменьшает или устраняет вероятность того, что свет от осветителя может входить прямо в светособирающий конус или увеличительную линзу. Следует отметить, что полное внутреннее отражение может также затрагивать угол сбора линзы L, потому что свет, рассеянный частицей, который образует угол, больший 42° на поверхности раздела покровное стекло - воздух, полностью отражается. Однако этот эффект - не критический.

Наблюдения с помощью микроскопа

В предыдущем разделе мы обсуждали наши системы освещения и детектирования (с увеличительной линзой) с акцентом на коэффициентах (отражения и преломления), которые определяют эффективную передачу световой энергии светорассеивающим частицам (которые прикреплены к поверхности или находятся в свободном состоянии над поверхностью), в то же время уменьшая неспецифический свет, который собирается. В этом разделе мы представляем экспериментальные детали, полученные визуальным наблюдением через окуляр увеличенного изображения, сформированного увеличительной линзой L.

а. Подробный обзор источников света и оптических световодов

Мы использовали три различных типа источников света следующим образом.

i. Осветитель для микроскопа фирмы Leica

Это стандартный коммерческий осветитель микроскопа. Он использует вольфрамовую лампочку накаливания и линзу, которая формирует сфокусированное изображение 5× 7 мм нити накала на расстоянии приблизительно 22 мм от наконечника осветителя. Чтобы получить более сфокусированный световой луч, мы присоединили к микроскопу линзу объектива с увеличением × 10. Линза находится на расстоянии приблизительно 6.5 см от наконечника осветителя. Объектив формирует сфокусированное пятно света диаметром приблизительно от 4 до 5 мм на расстоянии приблизительно 7 мм от линзы объектива.

ii. Оптоволоконный осветитель фирмы Bausch and Lomb

Это также коммерческий осветитель. Он использует вольфрамовую лампу накаливания мощностью 150 Вт, которая установлена на параболическом отражателе. Отражатель формирует луч почти параллельного света с диаметром приблизительно 25 мм. Оптический световод диаметром 11 мм (состоящий из многих маленьких оптических волокон, сгруппированных в пучок) помещается близко к лампе накаливания. Оптический световод затем расщепляется на два равных световода, каждый диаметром приблизительно 5.3 мм и длиной приблизительно 60,96 см (2 фута). Мы используем один из световодов. Чтобы получить сфокусированное световое пятно, мы коллимируем свет из оптического волокна, используя линзу с фокусным расстоянием 25 мм (диаметром 20 мм), расположенную на расстоянии приблизительно 25 мм от конца оптического волокна. Коллимированный свет затем фокусируется в пятно света диаметром 5 мм объективом с увеличением × 10, который расположен на расстоянии приблизительно 50 мм от коллимирующей линзы. Коллимирующая линза и линза объектива находятся в компактном держателе, который жестко прикрепляется к оптическому волокну. Гибкость оптического волокна делает этот тип системы источника света, намного более удобной для использования, чем жесткий осветитель микроскопа фирмы Leica.

iii. Специальный осветитель

Это осветитель, который сконструировали мы. Он использует вольфрамовую лампу накаливания на 12 В мощностью 28 Вт, которая установлена на параболическом отражателе. Отражатель производит почти параллельный луч света, который фокусируется в оптический волновод, который имеет диаметр 0,3175 см (0.125 дюймов). Световод имеет длину 91,44 см (36 дюймов). Свет от отражателя фокусируется в оптическое волокно линзой (диаметром 9 мм с фокусным расстоянием 23 мм), которая расположена близко к лампе. Световод имеет числовую апертуру 0.55 и принимает конус света с плоским половинным углом 60° . Свет, который выходит на другом конце световода, коллимируются линзой с фокусным расстоянием 12 мм (диаметром 11 мм), расположенной на расстоянии приблизительно 17 мм от конца оптического волокна. Коллимированный свет окончательно фокусируется объективом с увеличением × 10 в светлое пятно диаметром 5 мм. Линза объектива расположена на расстоянии приблизительно 26 мм от коллимирующей линзы. Светлое пятно диаметром 5 мм находится на расстоянии приблизительно 12 мм от края фокусирующей линзы.

б. Призмы (светонаправляющие системы)

Фиг.12 изображает схемы некоторых светонаправляющих систем типа призм, которые мы нашли полезными в наших системах освещения. Некоторые из них действительно не являются призмами в классическом смысле, но могут правильнее называться направляющими света или светонаправляющими системами. Направляющая света позволяет эффективно передавать свет под углом, при этом позволяя отраженному лучу света выходить на грани, противоположной той грани, на которую падает свет. Она должна иметь некоторые минимальные размеры по следующим причинам. Пятна, где входит световой луч и выходит отраженный свет, могут давать существенное неспецифическое светорассеяние из-за поверхностных неоднородностей. Эти пятна должны быть достаточно удалены от участка частиц специфического светорассеяния, чтобы минимизировать их вклад в неспецифическое светорассеяние. Светонаправляющие системы могут быть сформованы в одной детали с камерой для образца, таким образом избавляясь от необходимости использовать иммерсионное масло между направляющей света и анализируемой частью. Мы сделали прототип такого устройства, приклеивая маленькую светонаправляющую систему к основанию пластмассовой камеры, которая имеет микроматрицу пятен стрептавидина, нанесенную на внутреннюю поверхность камеры для образца. Наше детектирование и измерение привязанных к отдельным микропятнам микроматрицы светорассеивающих частиц с помощью этого прибора были по существу такие же, как наши измерения посредством подсчета частиц и измерений интенсивности с камерой для образца, расположенной на призме с иммерсионным маслом между двумя поверхностями.

в. Исследования с использованием микроскопа

Используя окуляр для визуальных исследований с помощью микроскопа, мы оценили несколько осветительных систем, акцентируя внимание на яркость частиц, темноту фона и применимость в различных форматах клинического анализа. Мы выявили несколько систем, которые дают хорошие результаты. Здесь мы ограничим наше обсуждение одной из наиболее удобных и наименее дорогостоящих систем, которые дают превосходные результаты. Под превосходными результатами мы подразумеваем наблюдение светлых частиц на темном фоне с использованием объективов × 10 и × 40 в качестве увеличительных линз.

Системой изображения является недорогой микроскоп от фирмы Edmund Scientific. Микроскоп состоит из объектива (× 10 или × 40) и окуляра в стандартном тубусе длиной 120 мм. Причиной использования этого микроскопа вместо простого использования объектива и окуляра является удобство, обеспечиваемое точной регулировкой фокусирующего механизма микроскопа. Однако мы модифицировали предметный столик микроскопа, чтобы приспособить его к нашему способу освещения, и заменили конденсор микроскопа на светонаправляющую систему (призменного типа), как изображено на фиг.12 (Г). Цилиндр под призмой плотной посадкой вставляется в держатель конденсора. Усовершенствованные предметный столик и осветитель позволяют работать с предметными стеклами микроскопов, планшетами для микротитрования и другими пластмассовыми пластинами. Однако объектив х40 нельзя использовать с толстыми пластмассовыми пластинами из-за маленького рабочего расстояния этого объектива (приблизительно 0,45 мм). Существуют объективы × 40 с большими рабочими расстояниями. Для освещения используется обычный осветитель.

Чтобы установить систему микроскопа для DLASLPD способа, предметное стекло микроскопа, содержащее свободные или связанные с поверхностью золотые частицы (золотые частицы диаметром 60 нм в тонкой водной пленке, накрытой покровным стеклом), помещают на предметный столик микроскопа. Призма располагается так, чтобы ее поверхность была почти в контакте с предметным стеклом микроскопа. Поверхности предметного стекла и призмы сцепляются с помощью иммерсионного масла. Фокусирующий объектив с увеличением х10 осветительной системы помещается так, чтобы он почти контактировал с освещаемой стороной призмы (см. фиг.13). Объектив располагается под таким углом, чтобы свет входил перпендикулярно в освещаемую поверхность и падал на поверхность S (поверхность, находящаяся в контакте с предметным стеклом микроскопа) под углом приблизительно 45° . Если пленка с золотыми частицами на предметном стекле имеет достаточно высокую концентрацию частиц (приблизительно 6× 10⁹ частиц/мл или выше), то пятно, в котором свет проходит через пленку с частицами, имеет интенсивный желто-зеленый цвет, обусловленный светорассеянием частиц. Положение фокусирующего объектива с увеличением × 10 юстируется так, чтобы желто-зеленое пятно было центрировано относительно (увеличительного) объектива микроскопа. Микроскоп затем фокусируется на пятно так, чтобы частицы проявились как отчетливые объекты при наблюдении через окуляр. Угол наклона освещающего объектива × 10 затем изменяется, чтобы получить светлые объекты на темном фоне. Эта юстировка повторяется для объектива × 40 микроскопа. Имеется узкий диапазон положений, которые производят светлые объекты на темном фоне для обоих объективов × 10 и × 40.

Следует отметить, что никакая часть света от осветителя не проходит в воздушное пространство над предметным стеклом микроскопа, когда луч света от осветителя падает на поверхность призмы под углами, приблизительно большими 42° (критический угол полного внутреннего отражения на поверхности раздела пластмасса - воздух или стекло - воздух). В нашей установке угол падения = 45° . Это можно проверить, помещая кусок белой бумаги над предметным стеклом микроскопа. Никакой свет от источника подсветки не попадает на бумагу. Однако интересно визуализировать луч подсветки для того, чтобы определить форму или ее распределение в пространстве. Это можно выполнить, помещая блок из родаминовой пластмассы поверх предметного стекла, используя для сцепления иммерсионное масло. Родаминовый блок представляет собой прозрачный пластмассовый блок, который содержит флюоресцентные молекулы родамина. Луч, проходящий через блок, может наблюдаться из-за производимой им флюоресценции родамина. Иммерсионное масло устраняет воздушный зазор и позволяет лучу освещения входить в пластмассовый блок. Профиль луча освещения, визуализированный флюоресценцией внутри блока, изображен на фиг.13.

Как только система освещения отъюстирована должным образом, золотые частицы диаметром приблизительно больше 30 нм можно легко увидеть на предметных стеклах микроскопа, пластмассовых лунках и микроматрицах твердой фазы или элементах матрицы. Объектив × 10 позволяет детектировать плотности частиц менее 0.005 частиц на мкм². Объектив × 10 имеет рабочее расстояние приблизительно 8.5 мм, так что он может использоваться с пластмассовыми деталями толщиной приблизительно 8 мм.

Способ DLASLPD увеличения видимого контраста

Мы определили, что металлоподобные частицы и неметаллоподобные частицы могут детектироваться с большей чувствительностью в образцах посредством DLASLPD способа увеличения видимого контраста. Этот способ включает настройку изображаемого неспецифического светового фона с помощью электроники так, что фон по существу удаляется из поля изображения, при этом оставляя видимыми отдельные частицы. Способ работает очень хорошо с другими способами, как здесь описано. Используя этот способ, мы наблюдали результаты с улучшенной определенностью и чувствительностью.

Усовершенствования камеры для образцов

В смысле использования некоторых аспектов настоящего изобретения и настоящего дополнительного улучшения в терминах удобства использования, адаптации к различным окружающим средам и условиям, мы обнаружили, что несколько аспектов настоящего изобретения могут быть воплощены в конструкции камер для образца, которые используются для проведения анализа и детектирования анализов.

Например, на основании наших наблюдений и умозаключений мы можем применять наши принципы к общей конструкции камеры для образца, которая представляет собой контейнер, который содержит анализируемый образец. Эти усовершенствования могут способствовать удобству использования и применимости к типам испытаний и условиям испытаний, коротко перечисленных выше. Следует, однако, заявить, что описанное здесь изобретение может практически применяться одинаково хорошо без использования следующих усовершенствований камер для образцов. Эти усовершенствования касаются средства увеличения практической применимости настоящего изобретения к специфическим условиям и окружающей среде и описываются в другом месте настоящего описания.

Мы обнаружили, что если отодвигать или смещать поверхность S1 (поверхность падения света) как можно дальше от области, которая содержит измеряемые частицы, то отношение сигнал / фон значительно увеличивается. Мы предварительно описали использование оптических средств юстировки типа призмы или подобного оптического световода, который используется, чтобы способствовать ориентации направления луча освещения к поверхности S1. Обычно используется иммерсионное масло между поверхностью светонаправляющей системы (призмы и т.д.) и поверхностью камеры для образца. Имеются многочисленные условия в испытании аналитов, когда может быть предпочтительно не использовать иммерсионное масло в качестве компонента в аналитической методологии. Мы определили, что увеличение толщины поверхности, на которой или вблизи которой находятся частицы, значительно снижает уровень неспецифического света, как описано ранее.

Мы применили этот и другие аспекты к конструкции камеры для образца для детектирования одного или более аналитов в образце. Эти основные конструкции камеры для образца изображены схематически на фиг.17, 18 и 19. Фиг.17 изображает камеру для образца, которая имеет скошенные плоские стороны. Угол наклона скошенных сторон согласуется с углом освещения так, что луч освещения падает на лицевую скошенную сторону под углом, как можно более близким к 0 градусов (относительно перпендикуляра). Таким образом, неспецифический отраженный и рассеянный свет минимизируется. Фиг.18 изображает камеру для образцов, которая имеет изогнутые стороны вместо плоских скошенных сторон фиг.17. В этой камере для образца для выходящего луча, который отклоняется, изогнутая поверхность способствует более эффективному удалению этого неспецифического света. Фиг.19 изображает камеру для образца, которая использует обе концепции: перемещение поверхности падения светового луча на образец еще дальше от измеряемой области; и изогнутые стороны для более эффективного удаления неспецифического света. Таким образом, эта камера для образца имеет увеличенную толщину материала под поверхностью дна внутренней полости, скошенные плоские поверхности под плоскостью поверхности для освещения и изогнутые стороны над плоскостью поверхности дна внутренней полости для эффективного удаления неспецифического света. Камеры для образцов, подобные изображенным на фиг.17, 18 и 19, подходят для измерения фиксированных образцов так же хорошо, как для образцов в растворе.

Практическое применение настоящего изобретения к аналитическому диагностическому анализу - типы устройств и испытательные комплекты

В уровне техники хорошо известно, что имеется широкий диапазон типов аналитов. Эти аналиты существуют в различных средах образцов, таких как вода, урина, кровь, мокрота, ткани, почва, воздух и т.п. В зависимости от требований специфического типа аналитического анализа может быть желательным получить полуколичественную или количественную информацию или то и другое в отношении анализов, представляющих интерес. Существуют условия, при которых желательно выполнять анализ с маленьким, недорогим и портативным инструментом. Например, использование в быту, использование в полевых условиях (далеко от лаборатории) или для лежачих больных в больнице. Каждый хочет иметь возможность быстро получать любые полуколичественные и/или количественные измерения на исследуемых аналитах. В других применениях желательно иметь маленький и недорогой инструмент, способный к количественным результатам, для детектирования аналитов в маленькой лаборатории, где проверяется несколько образцов в день. Например, медицинское учреждение, клиника, спутниковая испытательная лаборатория, исследовательская лаборатория и т.п. Имеются также условия, в которых желательно проверять от нескольких сотен до тысяч образцов в день, типа испытаний с высокой пропускной способностью. Таким образом, каждое из вышеупомянутых условий испытаний и сред требует различных типов устройств. Достоинства и недостатки, с точки зрения удобства применения и стоимости такого устройства, могут быть подробно определены, только когда точно сформулированы требования к испытаниям аналита(-ов) в образце.

Мы определили, что использование некоторых металлоподобных частиц с некоторыми вариациями DLASLPD способов детектирования обеспечивает возможность разработки специфических испытательных комплектов и устройства для вышеупомянутых окружающих сред испытания и применений. Имеются многочисленные различные комбинации аналитов, сред испытания, типов образцов, типов анализа, требований детектирования аналитов, стоимости устройства и требований по габаритам. Обычный специалист признает огромную полезность настоящего изобретения, состоящую в том, что практическое применение настоящего изобретения в том или другом виде приводит к удобному и недорогому устройству и испытательным комплектам для решения большинства нужд аналитического и диагностического испытаний.

Имеется много различных конфигураций и комбинаций DLASLPD способов, типов частиц и типов образцов, которые используются вместе для достижения определенной способности детектирования аналитов. В любом специфическом применении диагностического анализа тип(ы) образцов и способ(-ы) освещения и детектирования обычно являются устоявшимися, как например, тип анализа, тип камеры для образца и устройство детектирования. Металлоподобные частицы имеют уникальные свойства светорассеяния, которые изменяются в зависимости от размера, формы, состава и однородности частиц. Специфические свойства светорассеяния, которые могут детектироваться и/или измеряться от частиц, определяются вышеупомянутыми свойствами частиц и способом и устройством, используемым для детектирования и измерения свойств светорассеяния. Поэтому конечный полезный эффект и практическое применение настоящего изобретения в том или другом виде достигаются путем комбинирования различных аспектов средств освещения и детектирования и типа образцов с соответствующим типом(-ами) светорассеивающих частиц. Это в результате приводит к специфическим устройству и испытательным комплектам.

Специалист может практически применять много различных аспектов этого изобретения, используя различные типы частиц, типы анализа и устройство во многих различных конфигурациях, с целью достижения многих различных результирующих способностей диагностического и аналитического детектирования. Фиг.22 схематически изображает различные аспекты изобретения, которые при компоновке в специфической комбинации дают устройство и испытательные комплекты, способные удовлетворять специфическим нуждам диагностического аналитического испытания. Результирующее устройство и испытательные комплекты создаются путем выбора соответствующих составляющих структурной схемы типов методологии / устройства (фиг.23) и структурной схемы типов частиц (фиг.24). Фиг.23 показывает, что специалист выбирает источник освещения, способ и другие компоненты устройства, тип анализа и образца, способ детектирования и компоненты устройства. Фиг.24 показывает, что специалист выбирает соответствующие состав, форму, размер и однородность частицы, чтобы детектировать желаемые свойства светорассеяния частицы. Эти процессы, которые перечислены на фиг.23 и 24 и сведены в итоговую схему фиг.22, приводят к специфическому устройству и испытательным комплектам. Схема фиг.25 изображает один из основных способов, который мы использовали с целью разработки специфического устройства и испытательных комплектов для специфических нужд диагностического испытания. Специалисту не нужно практически применять способ фиг.25 к практическому использованию настоящего изобретения в том или другом виде.

Замечательные способности генерации и детектирования сигналов комбинации металлоподобных частиц с DLASLPD способами освещения и детектирования, которые здесь описаны, позволяют получать широкий диапазон чувствительности детектирования аналитов. Учитывая основные типы сред испытания и фигуры 22-25, коротко описанные выше, специалист может легко разработать устройство и испытательные комплекты, в которых для некоторых применений диагностических испытаний нужно будет использовать только невооруженный глаз для детектирования и/или измерения, а в других случаях, где используется простой источник света типа светодиода или лампы накаливания низкой мощности, для того чтобы детектировать и/или измерять сигнал, может использоваться фотодиод или матрица фотодиодов. В других применениях аналитического испытания можно использовать лазер, лазерный диод, лампу накаливания или т.п. в сочетании с фотоаппаратом, телекамерой или другим прибором ПЗС (прибор с зарядовой связью); и рассеянный на частицах свет может детектироваться и измеряться с помощью простого средства обработки изображения в формате микроматрицы или любом другом формате. Эти примеры не следует понимать как ограничение, скорее они вообще иллюстрируют многосторонность и широкую применимость настоящего изобретения для детектирования одного или более аналитов, представляющих интерес, в образце.

Например, маленькое ручное устройство для мобильного использования, которое может измерять один или более аналитов в образце, может быть сконструировано посредством использования в качестве источника света лампочки накаливания низкой мощности, светодиода или лазерного диода. Фотодиод или матрица фотодиодов используется в качестве детектора. В зависимости от чувствительности требуемого детектирования некоторые типы металлоподобных частиц могут использоваться с этим устройством, чтобы удовлетворить требования детектирования аналитов. Испытательные комплекты конструируются для многоаналитного или одноаналитного детектирования в жидких или твердофазных образцах. Например, для жидких образцов используются различные типы частиц, каждая из которых имеет различные легко обнаружимые свойства светорассеяния. В образцах и форматах твердой фазы типа микроматрицы может использоваться один тип частицы для всех различных аналитов или могут использоваться различные комбинации типов частиц (в зависимости от концентраций различных аналитов в образце).

В другом примере недорогое устройство и испытательные комплекты, способные измерять низкие концентрации аналитов, могут быть сконструированы следующим образом. Источник света низкой или высокой мощности используется с фотоэлектронным умножителем, матрицей фотодиодов или телекамерой. Линза используется для сбора рассеянного света от поверхности(-ей), содержащей частицы. Микропроцессор или внешний настольный компьютер используются для сбора и анализа данных о рассеянном свете. Испытательные комплекты для многоаналитного твердофазного анализа создаются посредством использования подходящего типа(-ов) частиц с соответствующими камерами для образца типа микроматрицы так, чтобы достичь требуемых диапазонов концентрации и пределов детектирования. Этот тип устройства и испытательные комплекты могут быть полезными в исследовательских лабораториях, медицинских учреждениях, спутниковых клиниках, лабораториях проверки окружающей среды и в испытательных лабораториях с высокой пропускной способностью.

Вышеупомянутые примеры устройства и испытательных комплектов даются как иллюстративные примеры и не должны интерпретироваться как единственные практические применения настоящего изобретения. Специалист признает широкую применимость настоящего изобретения. Практически применяя один или более аспектов настоящего изобретения, чтобы удовлетворить специфическим потребностям детектирования аналитов, специалист может представить и изготовить широкий диапазон устройств и испытательных комплектов.

Анализы с использованием ассоциации или агрегации двух или нескольких частиц посредством взаимодействия аналита и реагентов, специфически распознающих аналит

Каждому специалисту известно, что при использовании соответствующего связывающего агента и концентрации связывающих агентов и аналита могут происходить агглютинация, агрегация, перекрестное сшивание, структурирование и аналогичные события связывания, а также известно, что эти события могут быть использованы для детектирования одного или нескольких аналитов в образце. В некоторых иммуноанализах в том случае, если антиген является растворимым и многовалентным, образуются видимые преципитаты, а в том случае, если антиген состоит из частиц и является многовалентным, образуются агглютинированные и агрегированные частицы. В некоторых анализах нуклеиновых кислот один специфический одноцепочечный зонд может "перекрестно сшивать" две или несколько одноцепочечных мишеней и образовывать сетчатые структуры. Альтернативно, два или более различных уникальных одноцепочечных нуклеиновокислотных зондов могут быть использованы для связывания с различными сайтами на одной и той же одноцепочечной нуклеиновой кислоте-мишени. Для достижения этого может быть осуществлено перекрестное сшивание двух или нескольких мишеней, либо могут быть просто получены последовательности двух уникальных зондов, связанных с той же самой мишенью, которая подвергается детектированию.

Настоящее изобретение обеспечивает более легкий в осуществлении, более чувствительный и более универсальный способ обнаружения аналитов, чем те способы, которые существовали до настоящего времени. В конкретных видах анализов субмикроскопические частицы настоящего изобретения могут образовывать различные типы скоплений, которые могут быть обнаружены визуально или с помощью микроскопа, или посредством макроскопических наблюдений или измерений без отделения связанных частиц, не содержащих аналита. Тип образуемых скоплений частиц зависит от размера перекрестносшивающего агента или агентов, от их валентности и от типа связывающего агента, присоединенного к частице. Скопления могут иметь от двух до множества частиц.

Частицы, используемые в гомогенном жидкофазном анализе на обнаружение их агрегации, могут быть помечены прямым или непрямым способом. В анализе с прямым мечением агент, который может непосредственно связываться с аналитом, присоединяют к сигнал-генерирующей частице. Так, например, в анализе с прямым мечением нуклеиновокислотного аналита, ДНК-зонд присоединяют к рассеивающей свет частице. В непрямом анализе аналит - детектирующий агент метят химической группой А, а частицу метят или покрывают агентом, который может распознавать эту группу А. С использованием прямого или непрямого мечения анализ может быть отформатирован так, чтобы взаимодействие аналитразпознающих связывающих агентов с аналитом (и с группой А в случае непрямого мечения) приводило к агрегации частиц. Эти скопления (агрегаты) могут состоять из двух или нескольких частиц.

Нами было обнаружено, что в том случае, если агрегирующий или перекрестносшивающий агент (агенты) в данном анализе являются небольшими по своему размеру, такими, что частицы, присутствующие в агрегате, находятся в тесной близости друг к другу, то эти агрегаты, содержащие два или, как максимум, несколько частиц, обнаруживаются под микроскопом как одна частица (субмикроскопический агрегат). Однако в отличие от неагрегированных частиц этот субмикроскопический агрегат обладает другими светорассеивающими свойствами, обусловленными взаимодействиями между частицами в этом агрегате. В зависимости от состава частиц, их размера и формы мы наблюдали изменения цвета, интенсивности RIFSLIW и поляризации рассеянного света. Эти изменения могут быть использованы для измерения количества аналита, не прибегая к отделению свободных от аналита связанных частиц. В микроскопических исследованиях эти изменения могут быть использованы для различения субмикроскопических агрегатов от неагрегированных частиц даже в том случае, если эти частицы наблюдаются как одна частица. Если агрегирующие или перекрестносшивающие агенты имеют большой размер, такой как ДНК с длинной цепью, где расстояние между частицами в агрегате превышает разрешающую способность микроскопа, то частицы в этом агрегате могут наблюдаться индивидуально и отличаются от неагрегированных частиц тем, что они неподвижны или двигаются вместе. Эти микроскопические агрегаты могут легко наблюдаться под микроскопом в том случае, если в агрегате присутствует небольшое количество частиц, например две частицы. Если расстояние между частицами достаточно большое, такое, что взаимодействие между частицами мало, то частицы в данном агрегате сохраняют свои первоначальные светорассеивающие свойства. Расстояния между частицами могут быть также такими, что они будут соответствовать случаю, являющемуся промежуточным между двумя общими случаями, обсуждаемыми выше. В некоторых конкретных случаях мы обнаружили, что частицы в субмикроскопическом агрегате не оказывают влияния на светорассеивающие свойства друг друга, вероятно, потому что они расположены относительно друг друга не на таком близком расстоянии, чтобы происходило взаимодействия между частицами. Тем не менее, этот агрегат может отличаться от неагрегированных частиц благодаря тому, что его интенсивность в раз превышает интенсивности неагрегированной частицы, где обозначает число частиц в агрегате и/или частиц, "фиксированных" в определенном положении по отношению друг к другу.

Из вышепривиденной дискуссии можно сделать вывод, что жидкофазный гомогенный анализ, основанный на макроскопических измерениях или визуальных наблюдениях, может быть легко осуществлен в том случае, когда агрегаты, продуцированные благодаря присутствию аналита, имеют светорассеивающие свойства, отличающиеся от свойств свободных неагрегированных частиц. Если взаимодействия между частицами в агрегатах малы настолько, что светорассеивающие свойства агрегированных и свободных частиц являются аналогичными, то в этих гомогенных анализах можно использовать методы детекции, которые позволяют визуализировать или измерять интенсивность света, рассеянного отдельными частицами и агрегатами. В том случае когда могут наблюдаться отдельные частицы в агрегате, эти агрегаты могут быть легко отличимы от свободных частиц и количественно оценены, как описано выше, путем визуальных наблюдений или путем компьютерного анализа изображений. Агрегаты можно также отличить от свободных частиц и количественно оценить в проточном цитометре или в аналогичном приборе или устройстве, поскольку агрегаты должны иметь более высокую интенсивность света, чем отдельные частицы. В тех случаях, когда отдельные частицы и частицы в агрегате не могут быть обнаружены под микроскопом и взаимодействие между частицами отсутствует, то свободные частицы и агрегаты могут быть выявлены по разности их интенсивности и по числу частиц в агрегате, установленному исходя из интенсивности света, рассеянного агрегатом (в предположении, что эти интенсивности являются суммарными). Это может быть осуществлено путем анализа изображений или с помощью проточной цитометрии и предусматривает получение изображения путем лазерного сканирования или другими методами, которые способны обеспечить пространственный анализ площади или объема образца.

Поскольку число частиц в субмикроскопическом агрегате растет, то этот агрегат может наблюдаться как увеличенная частица или крупная частица, даже если отдельные субмикроскопические частицы в агрегате не могут быть обнаружены под микроскопом. В случае микроскопических агрегатов увеличение числа частиц в агрегате приводит к образованию видимой сетчатой структуры и частицы в этой сетчатой структуре могут быть подсчитаны. Крупные сетчатые структуры и агрегаты частиц продуцируют макроскопические объекты, которые могут наблюдаться невооруженным глазом, и могут образовывать преципитаты или агглютинаты.

Каждому специалисту ясно, что эти различные явления агрегации, описанные в предыдущем параграфе, могут быть использованы для разработки многих типов различных гомогенных анализов, некоторые из которых осуществляют при помощи микроскопа или при помощи других анализов с использованием техники визуализации, а также другой техники, которая предусматривает макроскопические наблюдения или измерения.

Ниже приводятся иллюстративные примеры анализов гомогенного типа или анализов других типов, которые могут быть осуществлены.

Примеры видов анализов с использованием частиц, рассеивающих свет

Ниже приводится несколько характерных примеров, которые иллюстрируют широкую универсальность и большое значение настоящего изобретения для разработки различных видов анализов.

Каждому специалисту ясно, что имеется множество вариантов настоящего изобретения, которые могут быть использованы для более специфичной, более простой и более чувствительной детекции одного или нескольких аналитов в образце, чем это было возможно в предшествующих анализах.

i. Виды анализов, основанных на ассоциации двух или нескольких частиц посредством связывания по принципу молекулярного распознавания. Общие процедуры

В одной серии экспериментов нами были проведено биотинилирование поверхности препарата, состоящего из золотых частиц диаметром 40 нм, с использованием метода молекулярного присоединения основного материала. После очистки путем центрифугирования и промывки мы помещали каплю этого материала на предметное стекло и покрывали его покровным стеклом, а затем наблюдали под оптическим микроскопом с использованием метода DLASLPD освещения светом и детекции. Этот материал был гомогенным, и частицы в соответствии с броуновским движением двигались очень быстро и имели зеленую окраску. Затем покровное стекло удаляли и на предметное стекло наносили каплю раствора стрептавидина, после чего снова покрывали покровным стеклом. Через определенный период времени в растворе наблюдались новые структуры частиц желто-оранжевого и оранжевого цвета и оранжево-белого цвета, которые имели большую интенсивность и двигались гораздо медленней, чем зеленые частицы. Некоторые из этих новых наблюдаемых структур были также асимметричными, поскольку они совершают как колебательные, так и вращательные движения в растворе. Через некоторое время многие из зеленых частиц исчезали и оставалось множество агрегатов из указанных желто-оранжевых и оранжевых частиц. При исследовании края покровного стекла под микроскопом было обнаружено, что он покрыт слоем оранжевых, желто-оранжевых и бело-оранжевых агрегатов частиц, которые имели очень яркую окраску. Аналогичное явление наблюдалось в гомополимерных нуклеиновокислотных системах. Эти наблюдения показали, что в различных вариантах настоящего изобретения изменения светорассеивающих свойств могут быть использованы для детекции событий молекулярного связывания либо путем визуализации этих агрегатов, по снижению числа одиночных "свободных" частиц, либо в объемном растворе с использованием других методов.

Так, например, для детекции в объемном растворе или в проточной системе определяют увеличение числа вновь образованных частиц с уникальными светорассеивающими свойствами и/или снижение количества частиц с исходными свойствами при освещении части раствора в соответствующих условиях и наблюдают за изменением рассеянного света, идущего от раствора. Альтернативно, материал в образце может быть более специфично проанализирован путем использования проточной системы. Так, например, приборы или устройства для микроканальной, капиллярной или проточной цитометрии используют таким образом, чтобы часть или весь раствор образца мог быть проанализирован на основе взаимодействия частиц друг с другом. Этот раствор течет под источником (источниками) освещения и детектором, или альтернативно, этот раствор захватывается в микроканальную или капиллярную трубку, а затем вся или часть микроканальной трубки анализируется путем перемещения либо контейнера с образцом, либо источника света, либо детектора (или их определенной комбинации) вдоль длины образца.

Так, например, определенный нуклеиновокислотный аналит состоит примерно из 100 нуклеиновокислотных оснований и присутствует в образце. Этот образец приготавливают так, чтобы указанная нуклеиновая кислота имела одноцепочечную форму. Затем к этому образцу добавляют два или несколько одноцепочечных "зонда", имеющих уникальные нуклеиновокислотные последовательности, в результате чего эти различные нуклеиновокислотные зонды связываются с различными участками цепи-мишени. Каждый из этих нуклеиновокислотных зондов также связывается путем непрямого или прямого мечения с одной или несколькими частицами. После инкубирования образец помещают в аппарат для проточной цитометрии или аналогичное проточное устройство, в котором может быть проанализирован раствор, содержащий образец. В том случае если присутствует целевая последовательность, то две или несколько частиц будут тесно "связаны" друг с другом. В зависимости от расстояния между частицами взаимодействия между частицами могут происходить, а могут и не происходить. Те молекулярные структуры, которые содержат две или несколько частиц в результате гибридизации цепей зонда с цепью-мишенью, детектируются с использованием соответствующих устройств, как описано ранее.

ii. Анализ, предусматривающий высвобождение молекулярных скоплений

Существуют виды применения анализов, где настоящее изобретение может быть использовано для обнаружения присутствия аналита как результата осуществления молекулярного, химического или другого процесса. Так, например, внутримолекулярные или межмолекулярные связи, сцепления или другие молекулярные структуры могут быть модифицированы так, чтобы происходили изменения всей геометрии молекулы или чтобы в результате этого процесса отдельная часть (части) молекулы распадалась. Так, например, пептиды, белки, нуклеиновые кислоты или фармацевтические агенты и т.п. могут быть присоединены к поверхности содержащего образец контейнера различными способами, известными специалистам. В некоторых из таких веществ имеется одна или несколько внутримолекулярных связей или сайтов связывания, которые могут быть расщеплены или как-нибудь иначе изменены под действием химических, биологических или других процессов. Так, например, присутствие специфического фермента или рибозима может быть обнаружено путем мониторинга количества продуктов расщепления, высвобождающихся в результате их активности. Рассеивающую свет частицу (частицы) непосредственно или опосредованно связывают с поверхностью молекулярного субстрата, так, чтобы его влияние на процесс расщепления был минимальным. Присутствие и количество свободных частиц в растворе или, альтернативно, снижение количества связанных частиц, присоединенных к контейнеру образца или к другим частицам, может быть связано с присутствием, количеством и активностью фермента. В другом примере рассеивающие свет частицы были покрыты антигенным веществом и смешаны с антителом так, чтобы все частицы были мультивалентно связаны вместе посредством связи типа "антитело-антиген". Этот структурированный или агглютинированный материал помещают в контейнер для образца, или, если необходимо, присоединяют к контейнеру для образца. Образец помещают в контейнер, который может содержать аналит (которым может быть либо антитело, либо антиген, либо конкурирующее антитело или антиген с до некоторой степени схожей структурой). В зависимости от присутствия и количества антиген или антитело специфического аналита, присутствующего в образце, определенные фракции антител и частиц, покрытых антигенами, будут диссоциировать из сетчатой структуры благодаря конкурентному связыванию. Количество присутствующего аналита может быть детектировано путем измерения количества частиц в растворе и/или количества частиц, которые сохранились в агглютинированной сетчатой структуре. Этот вариант метода может быть также осуществлен путем нанесения антител на частицы или с использованием других связывающих агентов, например, таких как нуклеиновые кислоты, пептиды, рецепторы, фармацевтические агенты, гормоны и т.п.

iii. Обнаружение и характеризация событий молекулярного связывания

В другом иллюстративном примере броуновское движение частицы, покрытой связывающим агентом, может быть использовано в варианте анализа изображений для обнаружения присутствия аналита и измерения количества присутствующего аналита.

Этот метод также был использован для исследования событий связывания и связывающих свойств партнеров по связыванию, где один партнер связывается с частицей, а другой партнер остается свободным в растворе. Такие характеристики являются исключительно важными для определения связывающих свойств антител, антигенов, фармацевтических агентов, рецепторов и любых веществ, где такое молекулярное связывание играет важную роль. Так, например, препарат, состоящий из золотых частиц размером 40 нм, изготавливают так, чтобы он содержал на своей поверхности либо антиген, либо фармацевтический агент, либо антитело.

После этого связывающиеся с частицами агенты наносят на предметное стекло микроскопа, и под микроскопом с использованием методов освещения и детекции DLASLPD наблюдают характер броуновского движения этих агентов и проводят количественную оценку. Затем добавляют раствор образца, который может содержать аналит, способный связываться с присоединенным к частице связывающим агентом. Если добавленный раствор содержит партнера связывающего агента, то он будет связываться со связанным на частице связывающим агентом, и в этом случае может наблюдаться изменение в броуновском движении. Альтернативно, для оценки конкретных применений известные концентрации вещества, молекулярные свойства которого подлежат характеризации, титруют при известных концентрациях в целях определения их связывающих свойств. Таким образом, могут быть исследованы процессы молекулярного связывания для большинства партнеров, связывающихся по принципу молекулярного узнавания (партнеров специфического связывания).

iv. Детекция путем амплификации аналитов

В некоторых аналитических и диагностических анализах может оказаться предпочтительным повысить детектируемость светорассеивающих свойств частиц так, чтобы эта детекция была значительно упрощена и не требовала специального оборудования. При использовании соответствующих пар специфического связывания и частиц можно значительно повысить уровень чувствительности детекции. Одноцепочечные гомополимерные последовательности, системы "авидин-биотин", "стрептавидин-биотин" и другие системы пар связывания могут быть использованы для "сцепления" и "конструирования" многих частиц. Так, например, может быть использован твердофазный анализ, в котором система "антитело-антиген-антитело" образует "сэндвич"-структуру. Одно антитело связывают с твердой фазой для захвата антигена-аналита. Затем добавляют другое антитело, которое содержит биотиновую группу. После этого частицы покрывают стрептавидином и в раствор добавляют свободный биотин. Из комплекса (твердая фаза-антитело)-антиген-(антитело-биотин) образуется структура... (стрептавидин-частица)-биотин-(стрептавидин-частица)-... , которая содержит много частиц, связанных вместе. Такие агрегаты или сетчатые структуры частиц продуцируют высокий уровень интенсивности, которую гораздо проще обнаружить, чем одну частицу. В другом примере полидезоксиадениловая кислота (Poly dA) и политимидиловая кислота (Poly dT) или другие гомополимерные одноцепочечные нуклеиновые кислоты могут быть использованы в анализе, где гомополимерную последовательность Poly dA вводят в область одноцепочечной молекулы "зонда". Частицы покрывают dТ-последовательностью, комплементарной этому гомополимеру, и добавляют к образцу, в который были добавлены "свободные" одноцепочечные dA для продуцирования структуры, содержащей множество частиц. Вышеуказанные примеры приводятся лишь в иллюстративных целях, и для каждого специалиста очевидно, что может существовать много вариантов этого аспекта изобретения в зависимости от аналитических и диагностических условий и требований.

Улучшенные реагенты, содержащие агент, связывающийся с частицей

Присоединение агентов связывания, которые имеют белковую природу, такие как антитела, к металлоподобным и неметаллоподобным частицам и к другим поверхностям методом адсорбции, хорошо известно специалистам (см., Horisbergwer, Scanning Electron Microscopy (1981), 2, р 9-31). Этот метод адсорбции может быть использован, например, для связывания молекулы антитела с веществом, которое способно связываться с частицей. В случае использования антител, связывание молекул антител с частицей также обеспечивает частичную химическую стабильность этой частице. Если условия адсорбции тщательно контролируются, то некоторые из молекул антител будут еще обладать способностью связываться с его соответствующим антигеном. Использование некоторых синтетических и биологических полимеров в качестве химических стабилизаторов для металлических частиц также известно специалистам (см., Heller et al., 1960. Journal of Polymer Science, , р 203-217). Методы адсорбции веществ на частицы и другие поверхности вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Точные механизмы и природа адсорбции веществ на частицы и другие поверхности пока не совсем ясны. При адсорбции молекул антитела на частицу или другие поверхности плотность и ориентация адсорбированных антител, очевидно, связаны с уровнем активности связывания. Из-за отсутствия контроля процесса адсорбции, очевидно, что многие из связанных молекул антител могут присоединяться таким образом, что область распознавания молекулярной структуры будет изменяться так, что их активность связывания будет значительно уменьшаться, либо они вообще будут терять свою активность.

Хотя метод адсорбции предусматривает присоединение к частицам белковых агентов связывания и других веществ, которые могут или не могут быть использованы в анализе аналитов, однако присоединять некоторые типы веществ, которые могут представлять интерес в тесте на аналиты и в других областях применения, достаточно трудно. Так, например, нуклеиновые кислоты, более мелкие белки и белковые вещества, такие как пептиды, и другие небелковые вещества, такие как низкомолекулярные антигенные вещества, гормоны, фармацевтические агенты и т.п., не могут быть эффективно присоединены к частицам благодаря процессу адсорбции. Дополнительные ограничения методов адсорбции заключаются в том, что для каждого типа вещества существуют уникальные условия адсорбции, которые должны быть тщательно проконтролированы. Даже если такие условия будут строго соблюдены, то могут появиться значительные отклонения в количестве белка и его целостности, а также в способности связывания этого вещества, которое адсорбируется на поверхность. Во многих случаях активность связывания (аффинность и специфичность) адсорбированного связывающего агента значительно меньше, чем его активность в неадсорбированной форме.

Наш эксперимент на связывание различных белковых связывающих агентов, таких как антитела, с поверхностью частиц с использованием метода адсорбции показал, что имеется огромное разнообразие связывающих свойств и стабильности полученных материалов агента, связывающегося с частицей. Аффинности связывания адсорбированных антител или других связывающих агентов в высокой степени зависит от условий мечения и может также значительно варьироваться от партии к партии.

Значительное снижение активности связывания антител, авидина, стрептавидина и других связывающих агентов, которые были адсорбированы на частицы, является общеизвестным фактом. Очевидно, что в некоторых препаратах некоторые фракции адсорбированного связывающего агента имеют тенденцию к отделению от частицы. В результате этого возникают серьезные проблемы, поскольку такой диссоциированный материал будет конкурировать с агентом, связывающимся с частицей, за связывание с аналитом в аналитическом или диагностическом анализе.

Такое отсутствие контроля за процессом связывания и вариабельностью активности связывания, а также ограничения в отношении типов веществ, которые могут быть присоединены к частицам методами адсорбции, ставит множество проблем для продуцирования и использования таких материалов в аналитических и диагностических целях. Самое главное, вероятно, заключается в том, что конъюгаты "частица-агент" могут не обладать достаточными качествами, необходимыми для многих аналитических анализов, где требуется обнаружение очень низких или сверхнизких концентраций аналитов.

Для специалистов очень важно иметь возможность использовать такой метод, где любой тип вещества, включая связывающие агенты различных размеров и концентраций, могут быть специфически связаны с частицей или поверхностью и где влияние на активность связывания присоединенного вещества будет минимальным. Для специалистов важно также разработать метод достижения нужной плотности агента на частицу (или, в общем случае, на любую поверхность). Кроме того, было бы желательно, чтобы в этих методах можно было осуществлять связывание более чем одного типа агента. С точки зрения промышленного производства и с экономической точки зрения, было бы крайне важно использовать простые и недорогостоящие процедуры синтеза, такие, чтобы в них с использованием тех самых основных процедур можно было осуществлять присоединение к частицам различных типов веществ широкого ряда.

Мы разработали новые методы, которые позволяют осуществлять специфическое связывание связывающих агентов и множество других веществ с металлоподобными частицами и другими поверхностями. Реагенты, содержащие частицы, продуцируемые с помощью этих новых методов, являются в высокой степени стабильными и обладают высокой аффинностью связывания, а также низкой способностью к неспецифическому связыванию. Эти новые методы позволяют устранить многие недостатки существующих методов адсорбции и имеют то преимущество, что процедуры осуществления этих новых методов являются простыми и недорогостоящими. В некоторых вариантах своего осуществления эти новые процедуры с помощью универсального химического линкерного носителя позволяют быстро и просто присоединять к частице или поверхности вещество любого типа с использованием тех же самых материалов и процедур. Это имеет исключительно важное значение для крупномасштабного промышленного производства реагентов, содержащих связывающийся с частицей агент и используемых для тестирования аналита.

Нижеследующие процедуры могут быть применены для любого вещества, которое включает связывающие агенты или другие вещества, например антигены, антитела, лектины, углеводы, биотин, авидин, стрептавидин, нуклеиновые кислоты, пептиды и белки, рецепторы, фармацевтические агенты и т.п. Эти методы могут быть использованы для присоединения многих веществ к металлическим, металлоподобным, и некоторым неметаллоподобным частицам и микроскопическим поверхностям. Так, например, неметаллоподобные поверхности и частицы включают структуры, которые могут состоять из органического или неорганического материала, такого как стекло, пластики и т.п.

Способы присоединения веществ к частицам и другим поверхностям

i.Способ с использованием молекул основного материала

Этот способ присоединения веществ к частицам или другим поверхностям включает две стадии, которые предусматривают использование молекул основного материала. Подходящими молекулами основного материала является любое вещество, которое может связываться и взаимодействовать с поверхностью путем адсорбции или посредством другого химического процесса и имеет подходящие функциональные группы, с которыми могут связываться другие вещества, например связывающие агенты. Эта молекула основного материала может также обладать дополнительными свойствами, обеспечивающими химическую стабильность частицы. В основном молекула основного материала представляет собой макромолекулярную форму (с молекулярной массой >1000 Mw), но она может быть меньших или гораздо больших размеров. Предпочтительными молекулами исходного материала являются такие молекулы, которые присоединяются к частице с высокой степенью аффинности, сообщают частице определенный уровень физической стабильности и имеют подходящие химические группы, которые могут быть легко конъюгированы с большинством веществ. Эти химические группы обеспечивают связывание связывающих агентов или других веществ посредством линкера связи, или посредством химической, ковалентной, или нековалентной связи. Так, например, ковалентное связывание может предусматривать фотохимическое или химическое связывание. Нековалетным связыванием может быть перекрестное сшивание с такими молекулами, как стрептавидин, или адсорбция посредством гидрофобного взаимодействия, связывание посредством водородной связи, или посредством электростатического взаимодействия. Молекула исходного материала может также содержать одну или несколько химических групп, которые могут быть также использованы для перекрестного сшивания нескольких основных звеньев молекулы на поверхности частицы с использованием соответствующих химических и перекрестносшивающих агентов.

Ниже приводятся выбранные примеры применения метода связывания молекулы основного материала для получения реагентов, которые содержат связывающийся с частицей агент и которые являются в высокой степени стабильными, обладают высокими аффинностями связывания по отношению к тем структурам, с которыми они связываются, и обеспечивают в высокой степени универсальный, простой в использовании и недорогостоящий способ присоединения почти любого вещества с частицами или другими поверхностями. Любому специалисту ясно, что может существовать множество вариантов этого общего метода синтеза реагентов, содержащих связывающийся с частицей агент, которые могут быть использованы в любых целях. Использование этого нового метода позволяет осуществлять связывание антител, пептидов, белков, нуклеиновых кислот, фармацевтических агентов и многих других веществ с частицей в условиях высокой степени контролируемости и предсказуемости.

В качестве примера нами было использовано производное полиэтиленгликолевого соединения с молекулярной массой (Mw) приблизительно 20000. Свойства этой молекулы (бис(полиоксиэтилен)-бис[3-амино-2-гидроксипропил])) позволяют использовать ее в качестве молекулы основного материала. Каждая молекула этого полимера имеет аминовые группы, которые могут служить в качестве сайтов связывания при конъюгирование других веществ. Гидрофобный остов полиэтиленового производного взаимодействует с частицей и связывается с поверхностью частицы путем адсорбции или какими-либо другими способами. Это взаимодействие является очень сильным, поскольку мы не обнаружили какого-либо отделения этого материала от поверхности частицы после мечения и использования в аналитическом и диагностическом анализах. Очевидно, что эти аминовые группы взаимодействуют с поверхностью частицы и являются пригодными в качестве сайтов для конъюгации других веществ, таких как, например, связывающие агенты. С использованием этого полимера в качестве основной молекулы мы получили два различных типа реагентов, содержащих связывающиеся с частицей агенты. Один реагент содержал в качестве связывающих агентов биотиновые группы, а другой реагент был изготовлен так, что он в качестве связывающихся агентов содержал одноцепочечные нуклеиновые кислоты. Биотин, используемый для связывания, представлял собой химически модифицированную форму, где он был ковалентно связан с аминовыми группами. Что касается нуклеиновых кислот, то они были модифицированы по своим 5’-концам так, чтобы они могли химически реагировать с аминовыми группами. При использовании этих реагентов в различных видах анализов мы установили, что оба указанных реагента, содержащих связывающиеся с частицами агенты, обладают высокой стабильностью в водных солевых растворах с низкой и высокой концентрацией соли и с исключительно высокой активностью связывания. В экспериментах с использованием реагента, содержащего связывающийся с частицами биотин, не было обнаружено какого-либо влияния на аффинность связывания. Это было установлено путем использования реагента "частица-биотин" при концентрации 6× 10¹⁴ в суспензии и путем погружения в этой раствор твердой фазы из пластика, которая была покрыта авидином. После 2-часового инкубирования твердую фазу удаляли и промывали. При исследовании под оптическим микроскопом с использованием методов освещения и детекции DLASLDP были обнаружены частицы, специфически связанные с твердой фазой, покрытой авидином, тогда как контрольная твердая фаза (не содержащая авидина) не обнаруживала связывания с частицами. При этих рабочих концентрациях реагента, содержащего связывающийся с частицами биотин, в том случае если связывающие свойства биотина, связанного с частицами, значительно снижаются, то связывания не должно обнаруживаться.

В другом примере в качестве основного материала использовали желатин, и этот желатин мог быть перекрестно сшит с поверхностью частицы путем использования иона хромата или других перекрестносшивающих агентов для минимизации возможной десорбции. Затем связывающие агенты или другие вещества связывали с частицей с использованием соответствующих методов химического конъюгирования для присоединения этих веществ к подходящим аминовым, карбоксильным или другим химическим группам, к которым может быть осуществлено присоединение.

В другом примере в качестве основного материала использовали стрептавидин или авидин. Вещества, такие как связывающие агенты и т.п., присоединяют к частице с использованием химически модифицированных форм молекулы, которая содержит, по крайней мере, одну биотиновую группу.

В другом примере полимероподобные материалы и другие материалы, которые обладают полимероподобными свойствами, такие как, например, углеводы, полиаминокислоты, белки и т.п. могут быть также полимеризованы из сополимерных звеньев в растворе прямо на поверхности частицы в соответствующих условиях.

Во всех вышеуказанных примерах связывающие агенты или другие вещества можно сначала конъюгировать с основным материалом, а затем нанести этот материал на поверхность частиц с использованием или без использования химического перекрестного сшивания основных материалов друг с другом. Кроме того, два или более различных типов молекул основного материала могут быть использованы с другими химическими молекулами-стабилизаторами так, чтобы количество химически реакционноспособных групп, подходящих для конъюгирования и химической стабилизации конъюгата "частица-связываающий агент", могло быть скорректировано в соответствии с большинством требований для проведения анализов.

В вышеуказанных примерах для использования в качестве молекул основного материала были выбраны подходящие материалы. Каждый специалист может синтезировать новые типы молекул основного материала в целях дополнительной оптимизации их использования для связывания этих веществ с частицами и другими поверхностями. Нижеописанные усовершенствования позволяют получить реагенты, содержащие связывающиеся с частицами агенты, которые могут быть химически более стабильными, и оптимизировать процесс конъюгирования с повышенной эффективностью связывания (с точки зрения аффинностей связывания) связывающих агентов с другими веществами. Так, например, к каркасной структуре полимера могут быть добавлены дополнительные химические группы, что приведет к увеличению стабильности связывания молекулы основного материала с поверхностью частицы. Для увеличения расстояния от частицы, при котором происходит присоединение связывающего агента или другого вещества и конечных остатков, могут быть добавлены линкерные "ножки" различной длины с соответствующими реакционноспособными химическими группами на конце или возле конца этой линкерной "ножки". Для дополнительного улучшения способности к перекрестному сшиванию или присоединению каким-либо другим способом отдельных молекул основного материала друг с другом на поверхности частицы к основному материалу могут быть добавлены различные типы реакционноспособных химических групп.

ii. Прямое присоединение веществ к частицам или другим поверхностям с помощью химических групп, которые адсорбируются на металлических поверхностях

Мы разработали дополнительные методы, которые позволяют осуществлять прямое присоединение различных веществ многих типов, включая связывающие агенты, к металлическим и металлоподобным частицам и поверхностям. Специалистам в области материаловедения и близких к ней областях известно, что некоторые типы небольших молекул (мол. масса <1000) могут связываться с металлическими поверхностями и т.п. Для большинства из этих небольших молекул имеются определенные типы специфически локализованных в молекуле химических групп, которые позволяют одной части небольшой молекулы связываться с металлической поверхностью, тогда как другие ее части остаются не связанными с этой поверхностью. Так, например, такое явление, как адсорбция тиол- и дисульфидсодержащих соединений и амфифильных соединений, таких как н-алконовые кислоты и некоторые молекулы детергентов, на металлических поверхностях известно специалистам (см., Nuzzo et al., (1983), Journal of the American Chemical Society, , p 4481-4483; Allara et al., (1984), Langmuir, 1, p 45-52; и Bain et al., (1989), Journal of the American Chemical Society, , p 321-335). Эти методы адсорбции веществ на металлические поверхности вводится в настоящее описание посредством ссылки. Поэтому свойства, которые позволяют осуществлять связывание вышеуказанных веществ, могут быть сообщены связывающим агентам и другим веществам путем введения соответствующих химических соединений в конкретный участок (участки) в молекулярной структуре присоединяемого вещества. Некоторые типы веществ легче присоединять именно этим методом, а не другим. Так, например, в этом конкретном варианте рассматриваемого метода могут быть, в основном, использованы вещества, молекулярная структура которых имеет заряд или является ионной, либо является поляризованной так, что в одном своем конце эта молекулярная структура является гидрофобной, а в другом своем конце она является гидрофильной.

Так, например, нуклеиновые кислоты содержат фосфатный остов, который имеет высокий отрицательный заряд. Одноцепочечную нуклеиновую кислоту метят по 3’- или 5’-концам тиолом или дисульфидом с дополнительным введением или без этого дополнительного введения гидрофобных групп, включенных в ту же самую область молекулы. Такая модифицированная нуклеиновая кислота связывается с металлической поверхностью или частицей на конце, меченном этими группами. Ионная часть нуклеиновой кислоты содержит главную цепь молекулярной структуры нуклеиновой кислоты, отстоящую от поверхности так, чтобы это позволяло молекуле взаимодействовать с большинством веществ, которые специфически связываются с ней.

С использованием этого метода к частице могут быть присоединены и другие вещества, такие как биотин, пептиды, фармацевтические агенты, полимеры и т.п. Обычно в этом методе могут быть использованы многие вещества, которые, в основном, не взаимодействуют с частицами или поверхностями в их природной форме. Для веществ, которые могут взаимодействовать с частицами или поверхностями, требуются другие методы. Так, например, некоторые небольшие молекулы, белки и т.п. могут взаимодействовать с частицей или поверхностью таким образом, что их активность связывания будет уменьшаться. В одном варианте этого метода частицу сначала метят, например, полимер-стабилизирующим агентом. После такого мечения обычно имеются открытые участки на поверхности частицы, с которыми могут связываться структуры небольших молекул. Затем к этой химически стабилизированной частице добавляют соответствующим образом модифицированное вещество для того, что сообщить этой частице нужную связывающую активность или другое свойство. Альтернативно, перед смешиванием с частицей или поверхностью химический стабилизатор и химически модифицированные связывающие агенты могут быть смешаны вместе в нужном сооотношении. При использовании этих методов количества и типы веществ, которые связываются с частицей или поверхностью, могут регулироваться с получением поверхностей или частиц с покрытием, имеющих нужную химическую стабильность и нужную активность связывания.

В молекулярные структуры могут быть также введены линкерные "ножки" различной длины и структуры. Так, например, в этих целях могут быть использованы молекулы низкомолекулярного основного материала, где структура этих молекул оптимизирована для связывания с частицей или поверхностью; причем связывание большинства веществ с этими молекулами может быть осуществлено в любой желаемой ориентации и с высоким уровнем активности. В качестве примера может служить линейный полипептид, который имеет длину в 20 аминокислот и который был модифицирован у одного своего конца путем добавления дисульфидных или тиоловых химических групп. Природный полипептид состоит из аминокислот, таких, что полипептидная цепь не взаимодействует с поверхностью за исключением химически модифицированного конца. На другом конце этого полипептида присутствует свободная аминогруппа, или альтернативно, этот конец может быть химически модифицирован для осуществления желаемого процесса конъгирования, такого, чтобы большинство веществ могло быть присоединено в этом положении. Затем эту молекулу низкомолекулярного основного материала используют в одном или нескольких вариантах описанных здесь методов.

Метод конъюгирования молекулы основного материала и метод прямого связывания, описанный в настоящей заявке, позволяет осуществлять более специфический контроль количества, типа и ориентации веществ, которые могут быть связаны с частицами или другими поверхностями. Еще одно преимущество этих методов заключается в том, что они позволяют осуществить синтез реагентов, содержащих связывающийся с частицей агент, где указанный присоединенный связывающий агент сохраняет высокие уровни аффинности связывания.

Важным отличительным признаком метода с использованием небольших молекул основного низкомолекулярного материала или материала с более высокой молекулярной массой является то, что благодаря нужному отбору и использованию молекул основного материала эти молекулы основного материала могут служить в качестве универсальной линкерной "платформы", на которой большинство веществ может связываться с частицей или поверхностью. Это свойство имеет особенно важное значение для крупномасштабного изготовления реагентов на основе частиц для проведения тест-анализов аналитов. При этом каждому специалисту ясно, что может существовать множество различных вариантов этих новых методов связывания, которые могут быть осуществлены путем варьирования используемых химических групп, молекулярных масс, молекулярной структуры, условий реакции мечения и типа химического конъюгирования (то есть перекрестного сшивания, ковалентного связывания, и т.п.).

Микроматричный и микроструктурный анализы с использованием частиц, рассеивающих свет

Микроматричный или микроструктурный метод анализа предусматривает использование дискретных пространственно адресуемых участков твердой фазы для детекции различных типов аналитов. Так, например, каждый пространственно адресуемый участок или микропятно могут содержать различные типы антител, рецепторов, нуклеиновых кислот или т.п. Расположение пространственно адресуемых участков на твердой фазе может быть детектировано в соответствии с размером твердой фазы, числа аналитов или различных детектируемых участков и методов детекции. Для образования микроматрицы каждое из пространственно адресуемых микропятен, которые содержат конкретный тип связывающего агента, может иметь форму квадрата, круга или любой другой конфигурации в зависимости от используемых методов. Размеры микропятен могут составлять в пределах от нескольких квадратных микрон до нескольких квадратных миллиметров или даже выше. Микроматричный метод может быть осуществлен с применением любого из множества твердофазных форматов, которые используются для детекции одного аналита, и в котором конечная количественная оценка может быть осуществлена путем измерения твердофазного сигнала, соответствующего количеству аналита, связанного с твердой фазой. Практическое осуществление общих аналитических стадий для микроматричного метода описано ниже. На микроматрицу наносят образец аналита, например сыворотку, и после соответствующего периода инкубирования матрицу промывают и наносят второй связывающийся с аналитом материал. В первом варианте метода второй связывающийся с аналитом материал связывается с рассеивающими свет частицами, светорассеивающие свойства которых подвергают детекции. Число рассеивающих свет частиц, связанных с каждым микропятном, рассматривается затем как мера количества аналита, присутствующего в каждом микропятне, и может быть соотнесена с концентрацией аналита в образце. В другом варианте анализа второй реагент, специфически связывающийся с аналитом, не связывают с рассеивающими свет частицами. В этом последнем варианте анализа со светорассеивающими частицами связывают третий компонент, который специфически связывается со вторым специфически связывающимся компонентом. Этим третьим компонентом может быть, например, стрептавидин, который специфически связывается с биотином, ковалентно связанным со вторым компонентом. Имеется много других методов анализа, которые могут быть использованы для детекции второго компонента, связанного с третьим компонентом, который присоединен к светорассеивающим частицам. В любом из этих вариантов анализа количество аналита, связанного с каждым микропятном, определяют путем измерения сигнала рассеяния света, который коррелирует с числом рассеивающих свет частиц, связанных с каждым микропятном.

Для обнаружения рассеивающих свет частиц на каждом микропятне в микроматрице могут быть использованы различные методы. Количество аналита, связанного с каждым пятном, определяют по числу рассеивающих свет частиц, связанных с каждым пятном в конечной стадии анализа. В основном для разделения сигналов рассеяния света от различных участков в матрице необходимо использовать определенный тип системы визуализации. Для визуализации и количественного определения частиц могут быть использованы многие типы систем. Выбор метода зависит от требуемой точности и числа образцов, анализируемых в день. Необходимая точность может быть как низкой, в случае когда необходимо получить лишь положительный или отрицательный ответ, так и очень высокой, в случае когда необходимо определить количество аналита с точностью до нескольких процентов. Примеры различных типов визуализации и количественного определения частиц описаны ниже.

Для осуществления метода визуализации в микроматрицу могут быть введены специальные отличительные признаки, например, некоторые микропятна в матрице могут быть наделены определенными химическими свойствами для получения фонового сигнала, либо некоторые микропятна в матрице могут быть наделены такими химическими свойствами, которые позволяют им служить в качестве калибровочных пятен, содержащих известные количества аналита. Сигналы от этих пятен могут быть использованы для коррекции изменений интенсивности падающего света, прохождения света между двумя носителями матрицы из микропятен, эффективности собирания света и чувствительности фотодетектора от одного образца к другому.

В настоящей заявке описаны некоторые специфические методы визуализации и количественной оценки рассеивающих свет частиц, применяемые к микроматрицам и элементам матрицы.

а. Метод DLASLPD с использованием простого оптического микроскопа

i. Низкая поверхностная плотность частиц (менее чем 0,1 частиц на мкм² на пятно

Если число тестируемых образцов невысоко, то число частиц в каждом пятне может быть определено визуально или другими методами подсчета частиц в каждом пятне. Было также проведено определение фонового значения. Подсчет частиц осуществляли на покрытых жидкостью или на сухих микроматрицах. Число частиц на микропятно, которое, как предполагается, является положительным, определяли, как в предыдущих экспериментах тестирования. Если рассматривается много образцов, то подсчет может быть проведен автоматически с использованием простого видеодетектора и программного обеспечения для подсчета объектов.

ii. Высокая поверхностная плотность частиц (более чем 0,1 частиц на мкм² на пятно

Для анализов положительного или отрицательного типа интенсивность от каждого пятна может быть зарегистрирована путем визуального наблюдения или фотодетекции. Результат является положительным, если интенсивность превышает фоновые значения. Если необходимо получить количественный результат и исследуется не слишком много образцов (например, у постели больного, в полевых условиях, в небольших клиниках или при тестировании в исследовательской лаборатории), то может быть использована мануальная техника с применением микроскопа с двумя смотровыми окнами, описанная ниже. Одно пятно освещают узким пучком света. Этот луч направляют на пятно путем визуального наблюдения через одно смотровое окно и определяют количество интенсивности с помощью фоточувствительного устройства с использованием или без использования пространственной фильтрующей апертуры в зависимости от уровня помех светового сигнала. Интенсивность рассеянного света, идущего от каждого пятна, измеряют путем мануального сканирования лучом каждого пятна. Альтернативно, этот луч может быть сканирован мануально, и свет, идущий от каждого детектируемого пятна и регистрируемый фотодетектром с большой амплитудой или фотодетектором с малой амплитудой, где площадь детектора является конфокальной с освещаемым пятном. Это может быть также осуществлено автоматически. Если анализируется много образцов, то микроматрица может быть освещена широким лучом света и изображение матрицы из микропятен оцифровывается с помощью видеокамеры и устройства для ввода и регистрации видеокадра. Затем определяют интенсивность каждого микропятна с помощью анализа путем визуализации с применением программного обеспечения. Нами было установлено, что эти методы являются очень чувствительными и позволяют определять аналит с широким интервалом концентраций в образце. Каждому специалисту понятно, что возможны и другие варианты этого метода.

Использование некоторых типов металлоподобных частиц в микроматрице и детекция аналита по элементу матрицы

В нашей работе с использованием микроматриц мы обнаружили, что предпочтительными светорассеивающими частицами являются металлоподобные частицы. Размер, форма, состав и гомогенность типа частиц, используемых в конкретной микроматрице, зависит, в основном, от следующих факторов: от количества неспецифического светового фона в образце; от того, является ли данная микроматрица сухой или покрытой жидкостью; от размеров площади связывания дискретной твердой фазы; от интервала количеств и концентраций детектируемого аналита (или аналитов); от того, осуществляется ли эта детекция путем визуального наблюдения или с помощью фотодетектора и от того, проводят ли измерение частиц путем их подсчета и/или путем определения интенсивности.

Так, например, мы могли легко обнаружить связывание отдельных золотых частиц диаметром 60 нм, покрытых BSA-биотином на пятнах диаметром 80 микрон, содержащих стрептавидин на твердой фазе из пластика, с использованием микроматрицы, покрытой буферным раствором. Мы использовали наш обычный осветитель в условиях DLASLPD и недорогостоящую микроскопическую систему, которую мы сами разработали. Мы подсчитывали число связанных частиц, присутствующих в стрептавидинсодержащих микропятнах в микроматрице с низкими плотностями связанных золотых частиц диаметра 60 нм, покрытых BSA-биотином. При более высоких плотностях мы измеряли интенсивность рассеянного света, продуцируемого частицами, связанными с отдельными стрептавидинсодержащими микропятнами. Мы регистрировали плотности частиц от около 0.06 частиц на 1 мкм² при отношении сигнал : шум = 13. Это свидетельствует о том, что для этого типа анализа могут быть обнаружены плотности до около 0.015 частиц на 1 мкм² при отношении сигнал : шум, составляющем около 3. Были также детектированы очень высокие плотности связанных частиц (при насыщении имеющихся сайтов связывания на каждое отдельное пятно диаметром 80 мкм). При осуществлении того же типа анализа с использованием сухой микроматрицы (не покрытой жидкостью) для достижения той же самой чувствительности может потребоваться использование золотых частиц более крупного диаметра или других металлоподобных частиц с более интенсивным рассеянием света. Кроме того, может быть использован источник света с более длинной длиной волны, такого как HeNe-лазер с излучением на длине волны выше 600 нм, и с пространственным фильтрованием.

Для детекции образцов путем использования небольшого портативного лабораторного устройства или устройства другого типа может оказаться необходимым использовать более крупные частицы в зависимости от уровня чувствительности, которая обычно требуется для использования источников света низкой мощности в таком устройстве.

Для детекции множества аналитов в формате мультиматричного анализа аналиты могут присутствовать в очень разных концентрациях на уровнях 1000-1000000 или даже в более высоких концентрациях. В этих случаях интенсивность рассеяния света и относительный размер частиц становятся очень важными факторами. Так, например, если анализируется один из множества аналитов на элементе матрицы или микроматрице, где отдельные дискретные участки связывания составляют около 100 мкм², то число частиц в высокой степени зависит от размера используемых частиц. Так, например, если используются частицы размером 40 нм при насыщении связывания, то на этом участке могут быть связаны около 79600 частиц. Однако, если используются частицы размером 120 нм, то на этом участке может быть связано только около 8800 частиц. В зависимости от количества неспецифического светового фона и неспецифического связывания частиц минимальное число, которое должно связываться с данным участком для получения надежных измерений, может очень сильно варьироваться. Так, например, в некоторых случаях для получения положительного результата детектирования с данным участком на микроматрице должно быть связано несколько тысяч частиц или более. Таким образом, использование более крупных частиц ограничивает детектируемость аналита. На участках связывания небольших размеров для того, чтобы получить адекватное отношение сигнал/шум, необходимо использовать самые мелкие частицы, которые только могут быть использованы. Кроме того, для повышения пределов детектирования могут быть оптимизированы оптическая и пространственная фильтрация и конфокальное изображение, а также могут быть использованы более мощные источники света и другие элементы оборудования. Аналогично, если имеется два или более аналитов в сильно отличающихся концентрациях, то в этом случае может оказаться необходимым использовать различные типы частиц соответствующего размера и с соответствующей способностью рассеивать свет.

Эти примеры не должны рассматриваться как некое ограничение изобретения, и они могут иметь различные варианты, причем выбор конкретных типов металлоподобных частиц предусматривает использование специфических тест-наборов для микроматричного анализа и детекции множества аналитов. При этом следует отметить, что существует много других вариантов этого способа настоящего изобретения для детекции нескольких аналитов на элементах матрицы и на микроматрицах.

Применение некоторых аспектов настоящего изобретения с использованием других методов освещения и детекции

Разработка этого метода означает, что можно использовать различные аспекты настоящего изобретения с применением диагностических методов детекции и аппаратуры даже без использования оптимального освещения, методов детекции и систем, описанных в настоящей заявке. Так, например, методы лазерной конфокальной микроскопии, методы светлопольной микроскопии и методы микроскопии с эпи-освещением, а также методы отражательной контрастной микроскопии и дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии могут быть использованы с определенными типами металлоподобных частиц для измерения множества аналитов на элементах микроматрицы и т.п.

Так, например, может быть использован конфокальный микроскоп, описанный Ekins в патенте США 5432099 (который вводится в настоящее описание посредством ссылки). В основном такая конфокальная микроскопия основана на точечном освещении, а не на полевом освещении и обычно работает по флюоресцентному типу с эпи-освещением. Обычно детектором является фотоумножитель, поскольку детектируемый сигнал является очень слабым. Источником света часто является лазер. В настоящем изобретении, даже если сигнал является очень сильным (по сравнению с обычной конфокальной микроскопией) и источник света не должен быть лазером, может быть использована уже более сложная аппаратура, чем конфокальный микроскоп. Как было нами установлено, использование такой аппаратуры, очевидно, позволит осуществлять даже более чувствительную детекцию частиц, описанных в настоящем изобретении, и минимизировать проблемы, связанные со световыми помехами.

Так, например, в другом примере может быть также использована методика Fodor et al. (364 Nature, 555, 1993) для детекции молекул-мишеней с использованием биологических элементов.

Эти методы вместе с применением одного или нескольких аспектов настоящего изобретения могут быть использованы в некоторых микроматричных анализах, в которых стоимость и простота методов и оборудования не имеют большого значения. Нам не известен какой-либо исследователь, кто использовал бы вышеописанную технику с применением металлоподобных частиц, и/или метод увеличения показателя преломления и/или автометаллографии, и/или любые другие аспекты настоящего изобретения. Поэтому нами заявлено применение этой предварительно описанной техники с использованием существующих методов детекции и аппаратуры, описанной в одном или нескольких аспектах настоящего изобретения.

Другие адаптации способов настоящего изобретения, применяемых к микроматрицам

Способы настоящего изобретения дают прекрасное средство для детекции одного или нескольких аналитов с использованием формата микроматриц. Нижеследующие методы дают дополнительные варианты, которые могут быть использованы в некоторых аналитических целях.

Мы можем миниатюризировать наши методы освещения и детекции для того, чтобы сконструировать аппаратуру на основе моно- и мультиоптического волокна. Это дало бы возможность использовать альтернативные методы визуализации для осуществления детекции.

Одна проблема, связанная с использованием двухмерной матрицы или твердофазной пространственно адрессуемой системы другого типа, заключается в помехах, возникающих между различными участками микроматрицы. Помехи, яркий свет или другие аналогичные проблемы могут возникать в результате нескольких факторов, например: (1) отдельные участки, содержащие светорассеивающий флюоресцентный материал(ы), могут находиться так близко друг от друга, что они будут наблюдаться как один участок; или (2) один участок содержит высокое количество рассеивающих свет частиц или флюоресцентного материала, а другие близко расположенные участки содержат очень низкие количества рассеивающих свет частиц или флюоресцентных материалов. В зависимости от того, насколько близко эти участки расположены друг от друга, некоторая часть света, идущего от участков с высокой интенсивностью, будет регистрироваться детектором в тех участках, от которых идет свет с более низкой интенсивностью.

Одно возможное решение этих проблем заключается в освещении каждого отдельного пространственно адресуемого твердофазного сайта с использованием процесса сканирования и регистрации световых сигналов, идущих от отдельного каждого пространственно адрессуемого сайта при его освещении. Это может быть осуществлено путем сканирования различных участков, одного за один раз, путем перемещения луча света или образца. Однако эти механизмы сканирования обычно сложны, что значительно повышает стоимость и усложняет процедуры осуществления аналитического метода, которые могут быть также слишком дорогостоящими и не слишком надежными для каждодневной трудоемкой работы клинических исследовательских лабораторий или активно действующей научно-исследовательской лаборатории.

Пример другого варианта настоящего изобретения описан ниже. Оптическое волокно, один конец которого, очевидно, находится под соответсвующим углом, используется как дискретный источник излучения, такой, что при перенесении его близко к измеряемому участку испускаемый флюоресцентный или рассеянный свет, идущий от этого участка, детектируют с другой стороны поверхности образца. Эта конфигурация позволяет осуществлять специфическое освещение данного участка и позволяет устранить вышеуказанные проблемы, связанные с помехами. Были также решены проблемы, связанные с использованием детектора визуализирующего типа, такого как видеокамера, в результате чего теперь может быть использован фотодетектор другого типа. В качестве примера для матрицы в 24 микропятна или отдельных измеряемых участков использовали 24 отдельных излучающих волокна, одно на каждое пятно. Все, что требовалось для этого, это то, чтобы отдельные пятна освещались в разное время по отношению друг к другу. Таким образом могут быть измерены некоторые небольшие пространственно адресуемые участки, диаметр которых составляет примерно 1/2 от диаметра оптического волокна.

В другом варианте этого способа, где желательно использовать эпи-освещение или аналогичные методы, например конфокальное изображение, используемую систему можно миниатюризировать путем помещения на конце оптического волокна очень маленьких изображающих линз, а затем добиться конфокальных условий, где рассеянный или флюоресцентный свет может быть измерен в нужном участке микроматрицы. Для любого участка, измеряемого на поверхности микроматрицы, одно оптическое волокно используют с микролинзами для подачи падающего света и собирания детектируемой излучаемой флюоресценции или детектируемого рассеянного света. Если необходимо за один раз детектировать более чем один участок на поверхности, то может быть использовано множество оптических волокон, как описано выше.

Каждому специалисту ясно, что предыдущие иллюстративные примеры являются только некоторыми из многих возможных вариантов настоящего изобретения.

Скринирование библиотеки комбинаторных синтезированных молекул

Серьезная проблема, существующая в настоящее время в развивающейся области комбинаторного синтеза молекул, имеющих важное значение, заключается в отсутствии высокочувствительной и простой технологии использования и детекции сигнала и видов анализа для детекции нескольких копий вновь синтезированных комбинаторных молекул.

Мы установили, что наша технология продуцирования и детекции сигнала может быть легко использована на твердых фазах, которые имеют пространственно адресуемые участки, такие как 2-мерные матрицы или любая пространственно адресуемая твердая фаза. Поэтому наши методы в одной или другой форме могут быть непосредственно использованы для скрининга и детекции одного или нескольких комбинаторных или биокомбинаторных молекул в анализе этого типа. Метод анализа может быть любым из методов, известных специалистам.

Настоящее изобретение в том виде, как оно описано здесь, может быть также использовано для детекции и количественной оценки одной или нескольких специфических комбинаторных, биокомбинаторных или других синтезируемых молекул на пространственно адресуемой твердой фазе. Так, например, хорошо известно, что широкое разнообразие биокомбинаторных и комбинаторных молекул может быть синтезировано путем использования методов "синтеза по частям", "параллельного синтеза" и подобных методов (которые вводятся в настоящее описание). Обычно широкое разнообразие комбинаторных молекул синтезируют на мелких частицах или других элементах твердого субстрата, где каждая частица или элемент субстрата содержит одну уникальную серию комбинаторных синтезируемых молекул. Связанные с этим проблемы заключаются в идентификации и очистке тех элементов или частиц, которые содержат "активные" серии синтезированных молекул.

Существует несколько способов использования нашей системы подачи и детекции сигнала для обнаружения этих специфических и нужных комбинаторных продуктов. В нашем способе анализа связывающий агент (который является специфичным для нужного аналита) наносят на металлоподобные частицы выбранного типа. Если покрытые таким образом частицы добавить к образцу, то он будет связываться с аналитом. Альтернативно, непрямой метод предусматривает использование меченного биотином связывающего агента, который сначала связывают с аналитом, а затем детектируют путем добавления перед детекцией металлоподобных частиц, покрытых стрептавидином. Рассеивающие свет частицы связаны либо в одной, либо в другой форме с нужным аналитом, который присутствует на синтетической твердой фазе. В данном способе нужные молекулы идентифицировали, выделяли и очищали из образца путем фильтрации, центрифугирования, диализа или какими-либо другими известными методами. Альтернативно, связывающие агенты, меченные частицами, покрытыми связывающими агентами, могут быть добавлены для того, чтобы между синтетическими частицами, содержащими специфическую молекулу, и металлоподобными частицами образовывались агрегаты или сетчатые структуры. Для идентификации и очистки нужных молекул использовались способы, описанные выше.

Многоаналитный анализ для различных комбинаторных синтезированных молекул осуществляли с использованием двух или более типов металлоподобных частиц, каждая из которых была покрыта различными типами связывающего агента. Могут быть также использованы методы увеличения показателя отражения и методы контрастного видеоусиления DLASLPD.

В другом методе анализа металлоподобные частицы также содержат ферромагнитную или магнитную составляющую, такую, что эти частицы могут быть подвергнуты манипуляции в трехмерном пространстве с использованием ЭДС, прилагаемой к реакционному контейнеру. Таким образом, частицы субстрата, содержащие "активные" комбинаторные молекулы, могут быть легко очищены и детектированы из всего или из части материала. При этом следует отметить, что смешанная композиция из ферроэлектрических или магнитных и других металлоподобных составляющих конкретных частиц могут быть использованы в других областях, включая диагностические анализы, а также для выделения и очистки нужных молекул. Использование методов увеличения показателя преломления в сочетании с вышеуказанными методами способствует увеличению чувствительности детекции.

Металлоподобные частицы, используемые в качестве твердофазных синтетических носителей

Металлолодобные частицы, при их покрытии соответствующими веществами являются прекрасными субстратами для осуществления химического или биохимического синтеза, например, комбинаторного синтеза. Специфическое покрытие металлоподобных частиц может состоять, например, из полимеров, антител, белков, нуклеиновых кислот, аминокислот, реакционноспособных химических групп, и т.п. Так, например, металлоподобные частицы покрывают полиэтиленгликолевым соединением, содержащим химически реакционные аминовые группы. Затем инициируют синтез на этих аминовых группах, которые во множестве присутствуют на поверхности металлоподобных частиц с покрытием. Вместо аминовых групп могут быть использованы и другие реакционноспособные химические группы, или группы, которые могут быть специфически активированы. В другом примере аминокислоты или небольшие пептиды наносят непосредственно на поверхность металлической или металлоподобной частицы, либо их химически связывают с полимером или макромолекулой другого типа, которую наносят на поверхность металлоподобной частицы. Затем на металлоподобных покрытых частицах инициируют синтез.

В еще одном примере реакционноспособные группы связывают с поверхностью металлоподобной частицы так, чтобы мог быть осуществлен синтез белка, нуклеиновой кислоты либо химический или биохимический синтез. Число реакционноспособных групп на поверхности частицы также может быть модифицировано следующим образом. Смесь полиэтиленгликолевых соединений (Mw 20000), содержащих и не содержащих реакционноспособные аминовые группы (или другие реакционноспособные группы), смешивают в соответствующем соотношении для достижения нужного числа реакционноспособных групп на поверхности одной частицы. Таким образом, на металлоподобные частицы наносят конкретное количество химических синтетических сайтов или сайтов связывания на металлоподобную частицу. Конкретное число сайтов и тип реакционноспособных групп может варьироваться, если это необходимо, например, для последующего химического синтеза или для получения диагностического реагента. Так, например, для диагностических целей добавление дискретного числа молекул агента специфического связывания на одну металлоподобную частицу может иметь важное значение для эффективного осуществления нужного анализа. Кроме того, два или более реактивных синтетических сайтов или сайтов связывания различных типов могут быть нанесены на ту же самую металлоподобную частицу в определенном количестве с использованием того же самого метода, который был описан выше для полиэтиленового соединения, путем смешивания в соответствующих соотношениях нужных веществ (то есть различных агентов связывания или химических групп и т.п.). Эти типы частиц с покрытием могут быть использованы, например, для выделения, очистки и обнаружения двух или более различных молекул с использованием той же самой частицы. Высокая плотность (грамм/см²) металлоподобных частиц многих типов имеет также много преимуществ в отношении очистки, выделения и идентификации нужных молекул. Частицы типа MLSP имеют еще те преимущества, что они поддаются более легкой манипуляции в среде. Вышеуказанные примеры являются лишь некоторыми из многих возможных вариантов этого метода. Другие варианты будут понятны каждому специалисту из нижеследующего описания.

Практическое применение различных аспектов изобретения находится за пределами области аналитической диагностики.

Настоящее изобретение представляет способы детектирования одного или более аналитов в образце путем детектирования свойств светорассеяния частицы. Следует отметить, что различные аспекты изобретения, которые здесь раскрываются, непосредственно применимы ко многим другим специфическим применениям вне диагностической области. Специалист в этой или других областях техники, таких как оптическая информация и память, формирование и обработка изображения, электрооптическое преобразование сигнала и переключатели, телесвязь, преобразователи информации и много других связанных применений, получил возможность благодаря этому описанию практически применять различные аспекты настоящего изобретения для решения специфических проблем и создания новых изделий в областях, лежащих за пределами аналитического диагностического анализа.

Один аспект настоящего изобретения, который очень полезен для применений к другим областям, состоит в способности идентифицировать специфические металлоподобные частицы некоторого размера, формы, состава и однородности посредством уникальной оптической сигнатуры, которая является характеристикой этого типа частицы. Воплощение таких специфических оптических сигнатур в очень маленькой структуре позволяет использовать эти характеристики сигнала частицы в многочисленных областях. Например, они могут использоваться в индустриальном контроле качества, маркерах или метках, необходимых для идентификации или отслеживания любого изделия, материала, вещества или объекта, который содержит частицу. Частицы в том или другом виде могут использоваться как средство идентификации, подобное способу "штриховое кодирование", известному в технике. Например, покрытие, содержащее один или более типов частиц, может наноситься на потребляемое изделие, чтобы идентифицировать подлинность, дату или другую уместную информацию. Аналогично купюры, акции, облигации и т.п. могут иметь в покрытии на поверхности или в самом материале бумаги некоторые типы частиц, которые могут детектироваться с целью определения подлинности объекта. Другие примеры включают внесение маленьких количеств частиц специфического типа в рецепт или на медикаменты для подтверждения подлинности или отслеживания медикаментов. Кроме того, частицы могут использоваться в качестве экологических, индустриальных, фармацевтических или биологических индикаторов для исследования физических свойств системы, такой как расположение текучих сред, материалов и т.п. Специалист поймет, что это только небольшая часть из многих возможностей.

Другой аспект настоящего изобретения, которое непосредственно применимо к другим областям, представляет собой использование светорассеивающих частиц, которые могут физически управляться электрическими, магнитными или связанными полями. Мы называем такие частицы управляемыми светорассеивающими частицами (УСРЧ) и они описаны подробно позже. Такие УСРЧ частицы могут ориентироваться в различные конфигурации в одно-, двух- или трехмерном пространстве посредством приложения магнитного, электрического или связанного электромагнитного поля. Таким путем уникальные свойства светорассеяния частиц могут использоваться для формирования некоторых структур, изображений или цветов. Специфические ориентации одной или более УСРЧ частиц используются для хранения или преобразования информации посредством свойств светорассеяния отдельной частицы или результирующей информации о светорассеянии, то есть оптическая сигнатура двух или более частиц, выстроенных в определенной ориентации. Например, три различных типа частиц, которые рассеивают синий, красный и зеленый свет, помещаются внутри маленькой площади или объема типа "пиксела" на экране, который содержит определенное число пикселей в двумерной матрице. Экран формирует цветное или черно-белое изображение или перемещение картины, которое подобно появлению телевизионного изображения, видеоизображения, изображения кинофильма и т.п., при освещении экрана белым светом. Каждый пиксел или группа пикселей пространственно адресуема электрическим или магнитным полем (ЭМП) так, что если прикладывать соответствующее поле, то отдельные частицы, которые рассеивают синий, красный и зеленый свет, ориентируется, чтобы произвести специфический цвет с некоторым оттенком и интенсивностью при подходящем освещении. Например, при некотором приложенном поле ЭМП, красные и зеленые частицы концентрируются в крошечное пятно, в то время как частицы, рассеивающие синий свет, свободно распределены во всем внутреннем объеме пиксела. Этот пиксел будет тогда казаться синим. Другое поле ЭМП может затем прикладываться, чтобы вызвать такой же эффект для частиц, рассеивающих красный или зеленый свет. Таким образом, если определенным образом ориентировать различные частицы в каждом пикселе, то получается цветное изображение. Этот способ и устройство предполагают много привлекательных преимуществ для современной технологии формирования изображения на основе электронно-лучевой трубки и т.п.

В другом примере УСРЧ частицы переключаются от одной специфической ориентации к другой путем соответствующей настройки поля ЭМП. Например, асимметричные серебряные частицы, которые могут производить зеленый или красный рассеянный свет и/или также имеют два различных уровня интенсивности рассеянного света, используются следующим образом. Одна или более частиц помещаются в определенное положение в материал либо жидкого типа, либо твердого типа, где частица способна вращаться, то есть переориентировать себя, когда поле ЭМП прикладывается к материалу или устройству, содержащему частицы. В зависимости от того, сколько частиц используется, и от желаемой функции устройства различные ориентации частиц будут выражать различные типы информации. Например, в одной ориентации свойства светорассеяния асимметричных УСРЧ частиц(-ы) показывают "выключено" или число 0 в двоичной системе, в то время как в другом положении или ориентации свойства светорассеяния показывают "включено" или число 1 в двоичной системе. Ориентация асимметричных УСРЧ частиц изменяется путем изменения ЭМП, чтобы достичь желаемой ориентации частиц в материале или устройстве. Когда свет взаимодействует с частицами в специфической ориентации, свойства рассеянного света выражают специфический тип информации, как описано выше. Таким образом могут быть выполнены простые и многокомпонентные оптические переключатели, которые применимы в телекоммуникации и связанных областях. Аналогично ряд таких переключателей может быть собран последовательно или параллельно способом для более сложного хранения и обработки информации.

Новые типы устройств хранения информации могут быть выполнены путем шифрования или сохранения информации посредством использования различных типов и/или ориентации светорассеивающих частиц и УСРЧ частиц. Например, оптический запоминающий диск может быть сделан подобно известным в технике "компакт-диску" или диску "CD-ROM". Вместо использования выпуклостей, которые выступают над поверхностью, чтобы кодировать информацию, используются светорассеивающие частицы. Частицы могут быть помещены на или в любом материале, из которого могут детектироваться свойства светорассеяния частиц. Таким образом, возможно сохранение намного большей специфической информации и при более высоких плотностях.

Специалист может представить себе многие различные типы устройств, которые могут быть сконструированы с использованием различных светорассеивающих частиц в специфическом применении. Вышеупомянутые примеры - только небольшая часть из множества способов, которыми используются такие металлоподобные и УСРЧ частицы вне области аналитического и диагностического детектирования. Эти применения становятся возможными благодаря раскрытому здесь описанию и формуле изобретения для практического применения различных частей изобретения к областям, не относящимся к области диагностического аналитического анализа.

Описание спектрометра SpectraMetrix, предназначенного для жидких образцов, и принципа его действия

Фотометр SpectraMetrix - фотометр наблюдения под прямым углом к падающему лучу, который измеряет интенсивность света, рассеянного или испускаемого под прямыми углами к возбуждающему световому лучу. Схема прибора изображена на фиг.21. Источник света - осветитель микроскопа или источник света любого другого типа. Прибор может использоваться с монохроматором или без него. В нем обеспечены адаптеры для соединения различных источников света с фотометром. Рассеянный или испускаемый свет детектируется фотоумножителем (ФЭУ). Фотометр имеет ручной оптический затвор, чтобы предотвратить попадание света на ФЭУ при замене образцов. Оптические фильтры или поляризаторы вставляются на пути падающего или испускаемого света согласно требованиям. Цилиндрические кюветы (например, пробирки) различных диаметров используются в качестве кювет для образцов. Однако с подходящим держателем может также использоваться любой тип оптически прозрачного контейнера для образца. Для получения изложенных здесь данных использовались пробирки диаметром 6 мм и длиной 50 мм и осветитель микроскопа с инфракрасным (тепловым) фильтром.

Осветитель может соединяться со спектрофотометром непосредственно или через монохроматор. Монохроматор, используемый для изложенных здесь измерений, представляет собой монохроматор на основе дифракционной решетки. Осветитель работает от источника питания постоянного тока при 6 В и 3 А.

В этом параграфе мы описываем оптику прибора, который мы использовали без использования монохроматора. Объектив × 10 фокусирует свет от осветителя на пробирку. Светособирающая линза (с фокусным расстоянием 23 мм, диаметром 19 мм), которая расположена под прямым углом к возбуждающему световому лучу (на расстоянии приблизительно 3,81 см (1.5 дюйма) от центра кюветы для образца), фокусирует изображение пробирки на расстоянии приблизительно 106 мм от центра пробирки. Это расстояние позволяет помещать оптический затвор и держатель фильтра между собирающей линзой и ФЭУ. В плоскости изображения располагается диафрагма с отверстием диаметром 3.25 мм (сделанным сверлом = 020). ФЭУ помещается позади диафрагмы. Диафрагма задерживает свет, отраженный от стенок кюветы, и пропускает на ФЭУ только рассеянный свет из центра объема образца. Диафрагма, снижая величину рассеянного света, который достигает ФЭУ, максимизирует отношение сигнал/фон. Чтобы дополнительно минимизировать детектирование света, отраженного от пробирки, пробирка помещается под углом приблизительно 40-50 градусов относительно вертикального направления так, чтобы отраженный свет не достиг собирающей линзы. Из-за этого угла и эффектов показателя преломления свет, выходящий из пробирки, не проходит вдоль центральной оси собирающей линзы, и луч рассеянного света в плоскости изображения смещается вниз от центральной оси собирающей линзы. Это требует, чтобы апертура диаметром 3.25 мм и ФЭУ были смещены вниз от оси собирающей линзы. Прибор сконструирован так, чтобы смещение вниз можно было вручную регулировать для наиболее эффективного детектирования рассеянного света.

При использовании монохроматора оптика такая же, как описано выше, за исключением того, что вводится дополнительная линза (с фокусным расстоянием 23 мм, диаметром 19 мм) между объективом × 10 и выходной щелью монохроматора. Линза находится на расстоянии 10,16 см (4 дюйма) от центра пробирки. Выходная щель монохроматора находится на расстоянии 14,224 см (5.6 дюймов) от центра пробирки. Осветитель соединен с адаптером на входной щели монохроматора.

Настройка оптической системы фотометра

а. Помещают пробирку 6× 50 мм с коллоидным раствором золотых частиц диаметром 60 нм, с концентрацией 4× 10 М^-12 в держатель образца спектрометра. Регулируют угол пробирки относительно вертикальной линии так, чтобы он составлял между 40 и 50 градусами. Располагают наклоненную пробирку так, чтобы сфокусированный луч возбуждающего света проходил через центр кюветы. Не допускается, чтобы возбуждающий свет падал на переднюю поверхность пробирки (поверхность, обращенная к собирающей линзе), поскольку это увеличит количество света, отраженного в сторону системы детектирования.

б. Расстояние собирающей линзы от центра пробирки регулируется так, чтобы сформировать резкое изображение стенок пробирки на расстоянии 106 мм от центра пробирки. Изображение луча рассеянного света и стенок пробирки может быть ясно видно на куске белой бумаги, помещенном на расстоянии приблизительно 106 мм от центра пробирки. Изображение пробирки имеет в плоскости изображения диаметр приблизительно от 8 до 10 мм. Линза должна помещаться так, чтобы получалось острое изображение стенок кюветы. Луч рассеянного света кажется несколько размытым в плоскости изображения из-за конечной ширины. Лучшее положение линзы - приблизительно на расстоянии 3.81 см (1.5 дюйма) от центра кюветы с образцом. Возбуждающий луч можно ясно видеть, когда он пересекает рассеивающий раствор.

в. Вышеупомянутая юстировка положения собирающей линзы выполняется с системой, которая содержит оптический затвор, держатель фильтра и держатель диафрагмы, выведенные из прибора. После правильного позиционирования линзы упомянутая структура заменяется и вставляется диафрагма с отверстием 3.25 мм для блокировки света. ФЭУ вставляется на место.

г. После шагов а, б и в положение апертуры относительно оптики собирающей линзы юстируется следующим образом. Кладут кусок белой бумаги на то место, где должна располагаться плоскость ФЭУ после его вставки. Имея светорассеивающие золотые частицы в камере для образца, юстируют положение апертуры до тех пор, пока не будет наблюдаться максимальное количество света на месте ФЭУ. Когда отверстие расположено должным образом, свет на бумаге появляется в виде пятна диаметром 0.32 дюйма (8 мм).

ПРИМЕРЫ

Примеры с 1 по 10 включают измерение света, рассеянного от частиц или испускаемого от флюоресцентных молекул, или то и другое. Для измерения светового сигнала использовался фотометр, изготовленный SpectraMetrix, как описано выше.

Для примеров 1-3 частицы полистирола, используемые для этих измерений, представляли собой сферы нанометрового диаметра, предназначенные для мечения, сертифицированные институтом стандартов NIST, полученные от корпорации Duke Scientific Corp., Palo Alto, CA. Золотые частицы получали от компании Goldmark Biologicals, Phillipsburg, N.J., дистрибьютор для British Biocell Intl., Cardiff UK.

Для примеров 4 до 10 флюоресцеин получали от компании Molecular Probes Inc., Eugene Oregon, золотые частицы получали от компании Goldmark Biologicals, Phillipsburg, N.J., дистрибьютор для British Biocell Zntl., Cardiff UK, а частицы полистирола получали от компании Interfacial Dynamics Inc., Portland, Oregon.

Относительные светорассеивающие способности частиц одинаковой формы и размера, но разного состава могут непосредственно сравниваться путем сравнения интенсивностей светорассеяния под прямыми углами к пути падающего света. Если измерение интенсивности светорассеяния для известной концентрации каждой частицы, представляющей интерес, выполняется под прямым углом наблюдения, то интенсивности светорассеяния для идентичных концентраций частиц того же самого размера и формы, но различного состава могут непосредственно сравниваться и могут определяться относительные полные светорассеивающие способности различных частиц.

Примеры 1, 2 и 3 - расчитанная и измеренная относительная рассеивающая способность сопоставимых полистироловых и золотых частиц

Результаты представлены в таблицах 6, 7 и 8. Вычисления были выполнены, используя известные зависимости светорассеяния и наши недавно определенные зависимости, которые описаны выше. Экспериментальные измерения были выполнены для частиц в воде путем детектирования света, рассеянного свободными частицами в растворе, при заданной освещенности и длине волны, используя Фотометр SpectraMetrix. Были выполнены следующие шаги:

(а) Освещение образцов с частицами контролируемых и сопоставимых размеров падающим светом одинакового состава и интенсивности.

(б) Определение светового сигнала, испускаемого из эталонной пробирки, содержащей воду без частиц.

(в) Определение светового сигнала, испускаемого из пробирки, содержащей частицы при известной концентрации.

(г) Вычитание значения (б) эталонного светового сигнала из значения (в) светового сигнала.

(д) Сравнение световых сигналов для равных концентраций частиц из полистирола и из золота.

Пример 4. Измеренная относительная мощность генерации сигнала флюоресцеина и золотых частиц, освещаемых белым светом

Результаты показаны в таблице 10. Одинаковый способ детектирования света практически применялся для определения сигнала света, испускаемого из всех образцов в пробирках 6× 50 мм. Никакие оптические фильтры не использовались в измерении светового сигнала от золотых частиц или флюоресцеина.

Все измерения были выполнены в воде. Раствор, содержащий флюоресцеин, имел показатель рН, составляющий 8-9. Значение светового сигнала пробирки, содержащей только воду, вычиталось из значения сигнала золотой частицы или флюоресцеина, чтобы получить световой сигнал, обусловленный только флюоресцеином или золотыми частицами.

Для измерения светового сигнала от частиц были выполнены следующие шаги:

А. (а) Освещение всех образцов падающим светом одинакового состава и интенсивности.

(б) Определение светового сигнала, испускаемого из эталонной пробирки, содержащей воду без частиц.

(в) Определение светового сигнала, испускаемого из пробирки, содержащей частицы при известной концентрации.

(г) Вычитание значения (б) эталонного светового сигнала из значения (в) светового сигнала.

Для измерения светового сигнала от флюоресцеина были выполнены следующие шаги:

Б. (а) Освещение всех образцов падающим светом одинаковой интенсивности и состава, как описано выше.

(б) Определение светового сигнала, испускаемого из эталонной пробирки.

(в) Определение светового сигнала, испускаемого из флюоресцеина при известной концентрации в пробирке.

(г) Вычитание значения (б) эталонного светового сигнала из значения (в) светового сигнала.

В. (а) Сравнение световых сигналов, полученных от молекул флюоресцеина и от частиц при известных концентрациях.

Пример 5. Измеренная относительная мощность генерации сигнала флюоресцеина и золотых частиц, освещаемых монохроматическим светом

Результаты даются в таблице 11. Эти результаты получены без поправки на различия в интенсивности падающего света.

Монохроматический падающий свет использовался на длинах волн, на которых наблюдается максимальное световое излучение от флюоресцеина (490 нм) и максимальное световое рассеяние от золотых частиц. Интенсивность падающего света на длине волны 490 нм была незначительно ниже, чем интенсивность для золотых частиц, и находилась в диапазоне приблизительно от 86 процентов от интенсивности на длине 520 нм до 80 процентов от интенсивности на длине 565 нм. С другой стороны, квантовый выход фотоэлектронного умножителя составлял 0.34 на длине волны первичного излучения флюоресцеина (520 нм), в то время как на длине волны 560 нм он составлял приблизительно 0.18.

Без учета длины волны падающего света один и тот же способ детектирования света использовался для всех образцов в пробирках размерами 6× 50 мм. При измерении светового сигнала и от золотых частиц, и от флюоресцеина никакие оптические фильтры не использовались.

Все измерения были выполнены в воде. Раствор, содержащий флюоресцеин, имел показатель рН 8-9. Для получения светового сигнала, обусловленного только флюоресцеином или золотыми частицами, значение светового сигнала пробирки, содержащей только воду, вычиталось из значения сигнала от золотых частиц или от флюоресцеина.

Для измерения светового сигнала от частиц были выполнены следующие шаги:

А. (а) Определение светового сигнала, испускаемого из эталонной пробирки, содержащей воду без частиц.

(б) Определение светового сигнала, испускаемого из пробирки, содержащей частицы при известной концентрации.

(в) Вычитание значения (а) эталонного светового сигнала из значения (б) светового сигнала.

Для измерения светового сигнала из флюоресцеина выполнены следующие шаги:

Б. (а) Определение светового сигнала, испускаемого из эталонной пробирки.

(б) Определение светового сигнала, испускаемого из флюоресцеина при известной концентрации в пробирке.

(в) Вычитание значения (а) эталонного светового сигнала из значения (б) светового сигнала.

В. (а) Сравнение световых сигналов, полученных от частиц и от молекул флюоресцеина при известных концентрациях.

Пример 6. Измеренная относительная мощность генерации сигнала флюоресцеина, полистирола, соединения полистирол-флюоресцентное соединение и золотых частиц

Результаты даются в таблице 12. Эти результаты получены без поправки на различия в интенсивности падающего света.

Все образцы освещались монохроматическим падающим светом. Золотая частица диаметром 100 нм освещалась падающим монохроматическим светом с длиной волны, близкой к той, на которой наблюдается максимальное светорассеяние. Образец с частицами из полистирола - флюоресцентного соединения освещался монохроматическим падающим светом с длиной волны, на которой наблюдается максимальное возбуждение флюоресценции (490 нм). Максимальное излучение флюоресценции для этого флюоресцентного соединения оказалось на длине волны 515 нм. Интенсивность падающего света на длине 490 нм составляла приблизительно 80 процентов от интенсивности на 555 нм. Квантовый выход фотоумножителя на длине волны 555 нм составлял приблизительно 60 процентов от квантового выхода на длине волны 515 нм.

Не считая длину волны падающего света, один и тот же способ детектирования света использовался для всех образцов в пробирках размерами 6× 50 мм. При измерении светового сигнала и от золотых частиц, и от флюоресцеина никакие оптические фильтры не использовались. Все измерения были выполнены в воде. Для получения светового сигнала, обусловленного только полистиролом или золотыми частицами, значение светового сигнала пробирки, содержащей только воду, вычиталось из значения сигнала от золотых частиц или частиц полистирола.

Для измерения светового сигнала от частиц были выполнены следующие шаги:

А. (а) Определение светового сигнала, испускаемого из эталонной пробирки, содержащей воду без частиц.

(б) Определение светового сигнала, испускаемого из пробирки, содержащей частицы при известной концентрации.

(в) Вычитание значения (а) эталонного светового сигнала из значения (б) светового сигнала.

Для измерения светового сигнала из частиц флюоресцеина были выполнены следующие шаги:

Б. (а) Определение светового сигнала, испускаемого из эталонной пробирки.

(б) Определение светового сигнала, испускаемого из частиц флюоресцеина при известной концентрации в пробирке.

(в) Вычитание значения (а) эталонного светового сигнала из значения (б) светового сигнала.

В. (а) Сравнение световых сигналов, полученных от частиц при известных концентрациях.

Пример 7. Детектирование золотых частиц диаметром 59.6 нм и флюоресцеина при высокой концентрации сыворотки

Результаты даются в таблице 17. Сыворотку получали от компании Biowhittaker Inc., Walkerville, MD. Сыворотка перед продажей фильтровалась через одномикронный фильтр и была прозрачная и соломенного цвета. Сыворотка адаптировалась для измерений флюоресцеина и доводилась до показателя рН, равного приблизительно от 9 до 9.5.

Раствор, содержащий золотые частицы, освещался монохроматическим падающим светом с длиной волны 543 нм, близкой к длине волны, на которой происходит максимальное светорассеяние от частицы. Раствор, содержащий флюоресцеин, освещался на длине волны 490 нм, на которой происходит максимальное возбуждение флюоресценции.

Не считая длину волны падающего света, один и тот же способ детектирования света использовался для всех образцов в пробирках размерами 6× 50 мм. При измерении светового сигнала и от золотых частиц, и от флюоресцеина никакие оптические фильтры не использовались.

Все измерения были выполнены в воде. Раствор, содержащий флюоресцеин, имел показатель рН 8-9. Для получения светового сигнала, обусловленного только флюоресцеином или золотыми частицами, значение светового сигнала пробирки, содержащей только воду, вычиталось из значения сигнала от золотых частиц или от флюоресцеина.

Измерения были выполнены при определенной концентрации сыворотки. Значение светового сигнала пробирки, содержащей только сыворотку нужной концентрации, вычиталась из значения сигнала от золотой частицы или флюоресцеина, чтобы получить световой сигнал, обусловленный только флюоресцеином или золотыми частицами.

Для измерения светового сигнала от частиц были выполнены следующие шаги:

А. (а) Определение светового сигнала, испускаемого из эталонной пробирки, содержащей сыворотку нужной концентрации без частиц.

(б) Определение светового сигнала, испускаемого из пробирки, содержащей частицы при известной концентрации.

(в) Вычитание значения (а) эталонного светового сигнала из значения (б) светового сигнала.

Для измерения светового сигнала от флюоресцентного раствора были выполнены следующие шаги:

Б. (а) Определение светового сигнала, испускаемого из эталонной пробирки.

(б) Определение светового сигнала, испускаемого из частиц флюоресцеина при известной концентрации в пробирке.

(в) Вычитание значения (а) эталонного светового сигнала из значения (б) светового сигнала.

В. (а) Сравнение световых сигналов, полученных от частиц при известных концентрациях.

Пример 8. Нижний предел детектирования флюоресцеина, золотых и полистироловых частиц при концентрации сыворотки 92.8%

Результаты даются в таблице 18. Для измерения флюоресцеина сигнал света, испускаемый из образца, содержащего флюоресцеин, пропускали через фильтр типа Wratten Kodak №16 перед попаданием фотоэлектронный умножитель. Максимальная интенсивность света из раствора флюоресцеина наблюдалась на длине волны 498 нм падающего монохроматического света, в то время как максимальное светорассеяние от золотых частиц наблюдалось на 554 нм. При измерении светового сигнала от частиц полистирола и золотых частиц никакие оптические фильтры не использовались. Для измерений флюоресценции показатель рН сыворотки доводился до значения рН 9. Не считая длину волны падающего света, один и тот же способ детектирования света использовался для всех образцов в пробирках размерами 6× 50 мм. Сыворотка описана в примере 7.

Измерения были выполнены при определенной концентрации сыворотки. Значение светового сигнала пробирки, содержащей только сыворотку нужной концентрации, вычиталось из значения сигнала от золотой частицы или флюоресцеина, чтобы получить световой сигнал, обусловленный только флюоресцеином или золотыми частицами.

Для измерения светового сигнала от частиц были выполнены следующие шаги:

А. (а) Определение светового сигнала, испускаемого из эталонной пробирки, содержащей сыворотку нужной концентрации без частиц.

(б) Определение светового сигнала, испускаемого из пробирки, содержащей частицы при известной концентрации.

(в) Вычитание значения (а) эталонного светового сигнала из значения (б) светового сигнала.

Для измерения светового сигнала от флюоресцентного раствора были выполнены следующие шаги:

Б. (а) Определение светового сигнала, испускаемого из эталонной пробирки.

(б) Определение светового сигнала, испускаемого из частиц флюоресцеина при известной концентрации в пробирке.

(в) Вычитание значения (а) эталонного светового сигнала из значения (б) светового сигнала.

В. (а) Сравнение световых сигналов, полученных от частиц при известных концентрациях.

Пример 9. Пределы детектирования полистирола, соединения полистирол-флюоресцентное соединение и золотых частиц при высокой концентрации сыворотки 92.8%

Результаты даются в таблице 19. Измерения были выполнены при определенной концентрации сыворотки. Значение светового сигнала пробирки, содержащей только сыворотку нужной концентрации, вычиталось из значения сигнала от золотой частицы или частицы полистирола, чтобы получить световой сигнал, обусловленный только полистироловыми или золотыми частицами. Никакой оптический фильтрации не производилось.

Для измерения светового сигнала от частиц были выполнены следующие шаги:

А. (а) Определение светового сигнала, испускаемого из эталонной пробирки, содержащей сыворотку нужной концентрации без частиц.

(б) Определение светового сигнала, испускаемого из пробирки, содержащей частицы при известной концентрации.

(в) Вычитание значения (а) эталонного светового сигнала из значения (б) светового сигнала.

(г) Сравнение световых сигналов, полученных от частиц при известных концентрациях.

Не считая длину волны падающего света, один и тот же способ детектирования света использовался для всех образцов в пробирках размерами 6× 50 мм. Сыворотка описана в примере 7.

Пример 10. При низких концентрациях золотых частиц сыворотка не влияет на светорассеивающие свойства золотых частиц

Результаты представлены в таблице 20. 95.7%-ная сыворотка прозрачная и соломенного цвета и имеет поглощение приблизительно 0.14 на длине пути = 1 см и на длине волны падающего света = 543 нм. Измерения светорассеяния выполнялись в стеклянной пробирке 6× 50 мм с внутренним диаметром приблизительно 5 мм. На основе разности в поглощении падающего и рассеянного света с длиной волны 543 нм сигнал светорассеяния от золотых частиц, находящихся в образце сыворотки, должен составлять приблизительно 80 процентов от сигнала золотых частиц с такой же концентрацией, но находящихся в воде. Никакие оптические фильтры не используются в этом примере.

Выполнялись следующие шаги:

(а) Освещение всех образцов падающим светом одинакового состава и интенсивности.

(б) Определение светового сигнала, испускаемого из эталонной пробирки, содержащей сыворотку без частиц.

(в) Определение светового сигнала, испускаемого из пробирки, содержащей частицы при известной концентрации.

(г) Вычитание значения (б) эталонного светового сигнала из значения (в) светового сигнала.

(д) Сравнение световых сигналов для равных концентраций золотых частиц в сыворотке и воде.

Пример 11. Получение суспензии, содержащей частицы золота 16 нм

2,5 мл стерилизованной воды добавляли к 0.1 г HAuCl₄×3Н₂O и получали раствор 4% HAuCl₄×3Н₂О. Раствор центрифугировали для удаления твердых частиц. В отдельной колбе 10 мл стерилизованной воды добавляли к 0.1 г цитрата натрия и получали 1% раствор цитрата натрия. Цитратный раствор фильтровали через поликарбонатный мембранный фильтр в 0.4 микрон для удаления твердых частиц. В очень чистую 250-миллилитровую колбу Эрленмейера добавляли 100 мл стерилизованной воды и 0.25 мл 4% HAuCl₄×3Н₂О. Колбу помещали на горячую пластину для перемешивания на отметке 4 и накрывали 100-миллилитровым химическим стаканом. После того как смесь начинала кипеть, к ней добавляли 2 мл 1% цитрата натрия. Через одну минуту после добавления цитрата раствор приобретал черную окраску. Затем он становился пурпурным и наконец темно-красным. Приблизительно через 2 минуты после добавления нитратного раствора этот раствор приобретал красный цвет. Полученный раствор смеси кипятили более 30 минут, а затем охлаждали до комнатной температуры и добавляли стерилизованную воду с получением полного объема до 100 мл. Конечная концентрация золота составляла около 0.005%, а концентрация частиц составляла 1.2× 10¹² частиц/мл, с учетом того, что вся соль золота была превращена в золотые частицы.

Пример 12. Стабилизацция частиц металла с использованием полиэтиленового соединения

1 г полиэтиленгликолевого соединения (молекулярная масса = 20000) добавляли к 100 мл стерилизованной воды, в результате чего образовывался 1%-ный раствор полиэтиленгликолевого соединения, и этот раствор фильтровали через поликарбонатный фильтр 0.4 микрон с использованием 50 мл шприца. Для стабилизации нужного объема частиц этот объем раствора частиц добавляли к объему 1%-ного раствора полиэтиленгликолевого соединения, в результате чего получали конечную концентрацию полиэтиленгликоля, составляющую 0.1%.

Пример 13. Получение частиц размером 30 нм из золотых частиц диаметром 5 нм путем их покрытия серебром

10 мл стерилизованной воды доводили до кипения в 30-миллилитровом химическом стакане. Затем медленно добавляли 2 мг желатина, и раствор продолжали кипятить при размешивании до тех пор, пока весь желатин не был растворен. Полученный раствор охлаждали до комнатной температуры. Затем добавляли 2 мл 47% цитратного буфера с рН 5. После этого добавляли 0.18 мл раствора, содержащего золотые частицы диаметром 5 нм (при концентрации около 0.005% золота, 3.8× 10¹³ золотых частиц/мл), а затем добавляли 3 мл 5.7% раствора гидрохинона. Полученную смесь тщательно размешивали, а затем добавляли стерилизованную воду до конечного объема 20 мл. Затем с 10 мкл приращением добавляли 50 мкл 4% раствора лактата серебра и полученную смесь быстро перемешивали вручную. Конечная концентрация серебра составляла около 0.005%, а конечная концентрация частиц, покрытых серебром, составляла приблизительно 3.4× 10¹¹ частиц/мл. С учетом того, что все добавленное серебро равномерно осаждалось на каждой частице золота, вычисленный размер частиц составлял 30 нм. После конечного добавления при комнатном освещении золь приобретал ярко-желтую окраску. В основной массе раствора свет, рассеянный разведенным объемом золя, находящегося в стеклянной пробирке размером 6× 50 мм, приобретал синюю окраску, если освещение проводилось узким лучом белого света. При наблюдении разведения серебряного золя под микроскопом SpectraMetrix в условиях DLASLPD с 10х-объективом и 12. 5х-окуляром, можно было легко видеть смесь ярких частиц с различными цветами. Преобладающими частицами были пурпурно-синие частицы. Также присутствовали желтые, зеленые и красные частицы. После коррекции концентрации золотых частиц размером 5 нм, которые мы использовали в описанной здесь процедуре, нами были получены покрытые серебром частицы с диаметром в пределах от 20 до 100 нм.

Пример 14. Светорассеивающие свойства не сферических серебряных частиц, полученных и оцененных на предметном стекле микроскопа

Небольшую каплю разбавленного золя серебряных частиц, полученных, как описано в Примере 13, помещали на предметное стекло микроскопа и покрывали покровным стеклом, в результате чего образовывалась очень тонкая пленка золя между покровным стеклом и предметным стеклом микроскопа. При освещении пятна тонкой пленки серебряного золя очень узким лучом света и наблюдении невооруженным глазом под углом, который предохранял от попадания в глаза падающего света, освещенное пятно имело цвет голубого рассеянного света. Затем пленку серебряного золя оценивали под оптическим микроскопом в условиях DLASPLD с 10х-объективом и 12,5х-окуляром. Через несколько минут было обнаружено, что большинство частиц было связано или было иммобилизовано на поверхности предметного и покровного стекла. Наиболее преобладающими были частицы, имеющие синюю окраску. Затем нами было обнаружено, что в том случае, если на точку на покровном стекле нажать острием зонда в виде тонкой иглы, то частицы на этом сдавленном иглой участке стабильно меняли окраску на их первоначальную синюю окраску (детекция рассеянного света). Центр в сдавленной области частиц имел красный цвет. Это центральное пятно было окружено концентрическими кружками, имеющими различную окраску. Начиная от центра, цвета менялись с красного на зеленый, с зеленого на желтый, и с желтого на синий. Красные, зеленые и желтые частицы имели очень яркую окраску. Проведенные нами теоретические вычисления указывали на то, что небольшие серебряные частицы имели синюю окраску. Было выявлено, что нажатие иглой меняет форму частиц. Следовательно, наши результаты показали, что первоначальная синяя окраска света, рассеянного небольшими серебряными частицами, в результате изменения их формы может быть превращена в другую окраску рассеянного света. Нами было обнаружено, что в области сдавливания различно окрашенные частицы могут быть диспергированы в жидкую фазу. В этой фазе частицы подвергаются броуновскому движению, и свет, рассеянный зелеными и красными частицами, мерцает, как и ожидалось для несферических частиц.

Пример 15. Получение золотых частиц более крупного диаметра из частиц диаметром 16 нм

2.4%-ный раствор гидрохлорида гидроксиламина был приготовлен путем добавления 24 мг гидрохлорида гидроксиламина к 1 мл стерилизованной воды с последующим размешиванием и фильтрованием через поликарбонатный мембранный фильтр (4 микрона), которым был снабжен 10 мл шприц. Раствор 4% HAuCl₄·3H₂O был приготовлен путем добавления 2.5 мл стерилизованной воды к 0.1 г HAuCl₄·3H₂O в аналитической пробирке с последующим смешиванием и центрифугированием для удаления твердых частиц. В 250-миллилитровую колбу Эрленмейера добавляли 25 мл стерилизованной воды, а затем добавляли объем золотых частиц размером 16 нм, показанных в Таблице 21 в зависимости от нужного размера частицы. Затем добавляли объем раствора 4% HAuCl₄·3Н₂О, указанного в Таблице 21. И, наконец, добавляли стерилизованную воду и получали полный объем до 100 мл. После этого при быстром перемешивании вручную добавляли объем раствора гидрохлорида гидроксиламина, указанного в Таблице 21, а затем полученную смесь перемешивали в течение 30 минут. Через несколько секунд после добавления раствора гидрохлорида гидроксиламина раствор менял светлую слегка розоватую окраску на конечную светлую красную или темно-коричневую окраску в зависимости от размера частиц. Наименьшие размеры частиц окрашивали растворы в красный цвет.

Таблица 21

Нужный диаметр частиц Аu, нм	Золь золотых частиц размером 16 нм,мл	Раствор HauCl4×3H2O, мл	Раствор гидроксиламина, мл
40	6.4	0.234	1.25
60	1.9	0.245	1.25
80	0.8	0.248	1.25
100	0.41	0.249	1.25

Затем были получены частицы большего диаметра при помощи той же самой процедуры, описанной выше, но с использованием определенных объемов растворов, описанных в Таблице 22, и с использованием раствора золотых частиц диаметром 100 нм вместо раствора золотых частиц диаметром 16 нм.

Таблица 22

Нужный диаметр частиц Аu, нм	Золь золотых частиц размером 16 нм, мл	4% раствор НаuСl4×3Н2О, мл	Раствор гидроксиламина, мл
200	12.5	0.219	1.25
400	1.56	0.246	1.25
600	0.436	0.249	1.25
800	0.195	0.25	1.25
1000	0.1	0.25	1.25
2000	0.012	0.25	1.25

Пример 16. Получение покрытых серебром частиц из золотых частиц размером 16 нм

В 250-миллилитровую колбу Эрленмейера добавляли 25 мл стерилизованной воды, а затем добавляли 6.4 мл 0,005% золя золотых частиц диаметром 16 нм и полученный раствор смешивали. После этого добавляли 0.234 мл 40 мг/мл раствора серебряной соли L (+)-молочной кислоты. После добавления сразу появлялась темно-пурпурная окраска. После добавления достаточного количества стерилизованной воды получали полный объем до 100 мл. При быстром перемешивании вручную было добавлено 1.25 мл 24 мг/мл раствора гидрохлорида гидроксиламина, и полученный золь приобретал бледно-сиреневую серебряную окраску. Небольшую каплю этого золя помещали на предметное стекло, покрывали покровным стеклом и оценивали при помощи оптического микроскопа в условиях DLASLPD. В результате наблюдались красные, зеленые, пурпурные и желтые частицы. Цвет рассеянного света в разбавленном растворе этих частиц в тест-пробирке при освещении белым светом имел холодно-голубой оттенок.

Пример 17. Приготовление предметных стекол, покрытых BSA

Для изучения параметров сигнала и детекции для различных комбинаций частиц и методов освещения и детекции частиц на твердой фазе в качестве твердофазного анализа применяли моделированную систему.

Эта система включала сначала покрытие предметных стекол альбумином бычьей сыворотки (BSA), а затем осаждение различных количеств золотых частиц на определенных участках для изучения параметров. В этом описании мы обсуждаем метод, который был использован для покрытия предметных стекол альбумином бычьей сыворотки.

10%-ный раствор BSA в воде получали путем добавления 1.5 г BSA к 15 мл стерильной сверхчистой воды с последующим размешиванием и фильтрованием раствора через поликарбонатную мембрану размером 0.44 мм. 0.02%-ный раствор BSA (200 мкг BSA/мл) получали путем добавления 20 мкл 10%-ного раствора BSA к 10 мл стерильной воды с последующей фильтрацией раствора BSA через поликарбонатную мембрану размером 0.4 мм.

Стандартные предметные стекла микроскопа очищали путем их соскабливания щеткой, пропитанной метанолом. После обработки щеткой предметное стекло очищали путем подачи струи стерильной воды с использованием пластиковой распылительной колбы. Предметное стекло покрывали BSA путем погружения этого стекла в химический стакан, содержащий 0.02% BSA в стерильной воде, а затем инкубировали в течение одного часа. Затем предметное стекло удаляли из химического стакана и промывали путем подачи струи стерильной воды из распылительной колбы. Были промыты обе стороны предметного стекла. После этого предметное стекло погружали приблизительно на 10 минут в 150-миллилитровый химический стакан, наполненный стерильной водой. Затем его снова промывали струей воды. Наиболее важным является удаление свободного BSA с предметного стекла, поскольку свободный BSA препятствует связыванию металлических частиц с покрытым предметным стеклом. После этого предметное стекло, покрытое BSA, сушили и хранили в сухих условиях в чистом пластиковом ящике.

Пример 18. Осаждение золотых частиц на предметное стекло, покрытое BSA

На предметных стеклах, покрытых BSA, при помощи алмазного резца размечали небольшие круги (диаметром около 8 мм) для того, чтобы отметить участки, на которых будут осаждаться золотые частицы. На одной из отмеченных участков предметного стекла осаждалось 3 мкл раствора незащищенных золотых частиц с нужной концентрацией этих золотых частиц. Раствор золотых частиц осаждали на противоположной стороне меток, сделанных резцом, для предупреждения взаимодействия раствора золотых частиц с разметочной маркировкой.

Для получения ряда пятен золотых частиц на предметном стекле, в котором плотность золотых частиц систематически снижалась, желательно, чтобы этот ряд пятен располагался на одной линии в центре предметного стекла. Для получения ровного ряда мы закрепили предметное стекло на сделанном нами держателе, что позволяло нам осаждать золотые пятна в ровный ряд. При этом следует отметить, что эти пятна могут быть видны при комнатном освещении (то есть плотность частиц является такой низкой, что они не дают окраски при комнатном освещении). Для идентификации положения пятен нами была сделана отметка на одной стороне предметного стекла. Эти отметки были нами сделаны по мере осаждения частиц. Для получения пятна частиц мы добавляли 3 мкл раствора незащищенных золотых частиц, разбавленного до нужной концентрации частиц. После этого предметное стекло инкубировали в течение определенного промежутка времени в закрытом пластиковом ящике. Внутренние стенки и дно ящика покрывали влажными бумажными салфетками для предупреждения испарения золя золотых частиц на предметном стекле. Затем предметное стекло вынимали и промывали струей стерильной воды при помощи пастеровской пипетки. Нами было установлено, что для наиболее эффективного связывания золотых частиц с BSA на предметном стекле рН раствора золотых частиц должен быть доведен до р1 BSA (р1=4.58-5.45).

Пример 19. Аналитический тест с использованием микроматриц - Связывание золотых частиц диаметром 60 нм, покрытых BSA-биотином с дискретными отдельными стрептавидиновыми пятнами диаметром 80 микрон на пластиковом субстрате

Были получены нижеследующие растворы. 1 мг/мл раствор BSA-биотина получали путем добавления 2 мг ВSА-биотина в 2 мл стерильной воде с последующим диализом против дистиллированной воды в 500-миллилитровой колбе Эрленмейера в течение нескольких часов при комнатной температуре. Воду меняли 4 раза. Последней заменой была стерильная вода. Был также приготовлен буфер (20 мМ трис-физиологический раствор, 0,1% полиэтиленгликолевое соединение и 0,02% азид натрия) с рН 7,4. Все растворы были отфильтрованы через поликарбонатный мембранный фильтр 0.4 микрон. Аналитические пробирки из полистирола очень тщательно промывали стерильной водой при помощи распылительной колбы, наполняли 4 миллилитрами раствора золотых частиц диаметром 60 нм, и наконец, центрифугировали в медицинской центрифуге в течение получаса.

Затем частицы промывали, как описано ранее. Мягкие осадки ресуспендировали в 10 мл стерильной воды.

рН раствора золотых частиц доводили следующим образом. В промытую поликарбонатную аналитическую пробирку добавляли 100 мкл 1%-ного раствора полиэтиленгликолевого соединения. В эту пробирку добавляли 1 мл золя золотых частиц диаметром 60 нм и смесь инкубировали в течение 2 минут. К золотому золю добавляли 0.02 М К₂СО₃ с 2 мкл приращением до тех пор, пока рН не достигнет значения 6.6. Затем число микролитров 0,02 М К₂СО₃, необходимых для доведения до нужного рН, вычисляли путем добавления к оставшимся миллилитрам золотого золя, в данном случае 80 мкл. К 1.15 мл 1 мг/мл раствора BSA-биотина в поликарбонатной пробирке добавляли 9.5 мл золотого золя с рН 6.6, а затем инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. После этого раствор центрифугировали в течение получаса в медицинской центрифуге, а затем супернатант декантировали. Оставшийся мягкий осадок ресуспендировали в 3 мл стерильной воды, а затем центрифугировали, как описано ранее, после чего супернатант декантировали, ресуспендировали в 0.1% растворе полиэтиленгликолевого соединения и, наконец, снова центрифугировали. После декантирования супернатанта осадок ресуспендировали в растворе, содержащем 20 мМ трис-физиологический раствор и 0.1% раствор полиэтиленгликолевого соединения и, наконец, центрифугировали. После декантирования супернатанта оставалось около 200 мкл мягкого осадка. 50 мкл этого раствора добавляли в пластиковые сосуды, которые содержали стрептавидиновые пятна диаметром 80 микрон, и содержимое этих сосудов инкубировали в течение ночи в увлажнительной камере. Затем сосуды промывали несколько раз стерильной водой с использованием пастеровской пипетки для впрыскивания и удаления воды из сосуда. Для осуществления детекции при помощи микроскопа сосуды наполняли 60 мкл стерильной воды.

Пример 20. Детекция связывания золотых частиц диаметром 60 нм, покрытых ВSА-биотином с микроматрицей, состоящей из пятен-участков связывания, покрытых стрептавидином диаметром 80 микрон

Суспензию ВSА-биотин-Аu-связывающего агента (золотые частицы диаметром 60 нм) добавляли в пластиковые лунки, на поверхности дна которых находилась микроматрица, состоящая из пятен стрептавидина диаметром 80 микрон. После соответствующего периода инкубирования лунки промывали и визуально оценивали при помощи разработанной нами системы оптического микроскопа в условиях DLASLPD. Нами было обнаружено, что частицы, меченные BSA-биотином-Аu, связывались с отдельными пятнами (80 микрон). Стрептавидиновые пятна 80 микрон, которые визуально не были обнаружены перед добавлением частиц, появлялись в виде ярких почти круглых пятен. Отдельные пятна, содержащие BSA-биотин-Аu-частицы с различной поверхностной плотностью, получали путем инкубирования в различные периоды времени или с использованием различных концентраций BSA-биотин-Аu. С помощью окуляра нашего микроскопа с увеличением около 200х легко обнаружить, что отдельные частицы связаны со стрептавидиновыми пятнами при низких плотностях связывания. Для автоматического подсчета и суммирования результатов измерений интенсивности света от отдельных пятен (80 мкм) мы протестировали видеоизображения с использованием программного обеспечения, которое нам было предоставлено на 24 часа нашей компанией в Сан-Диего. Мы принимали видеоизображения при помощи недорогостоящей черно-белой видеокамеры, устройства ввода и регистрации стоп-кадра и изображение на дисплее настольного компьютера, которое содержали 25 отдельных пятна, которые находились в матрице, находящейся на лунке. С помощью программного обеспечения можно провести измерение суммарной интенсивности света каждого пятна, а также числа частиц на отдельное пятно. Например, стрептавидиновое пятно, которое было помечено ВSА-биотин-Аu-связывающим агентом с низкой плотностью, было проанализировано при помощи системы воспроизведения видеоизображения в режиме подсчета частиц. Для получения соответствующего отношения сигнал/шум пятно диаметром 80 мк на твердофазном участке, не покрытом стрептавидином, анализировали для определения фонового сигнала. В этой предварительной системе модели отношение сигнал/шум составляло 317/25=13 при плотности мечения на пятне, составляющей от около 0.06 частиц/мкм², в условиях неоптимизированного освещения и детекции. Исходя из этих предварительных неоптимизированных данных, был сделан вывод, что при отношении сигнал/шум 311 может быть детектирована плотность частиц, составляющая 0.015 частиц/мкм². При более оптимальных условиях нижний предел чувствительности может быть гораздо ниже.

Пример 21. Чувствительность детекции золотых частиц в тонких пленках

60 нм золотого золя разводили в 10 раз и 20 мкл каждого разведения осаждали в виде пятен на предметное стекло, покрытое BSA. Затем предметное стекло, не содержащее покровного стекла, помещали на призму Порро с иммерсионным маслом. Каждое пятно золотого золя имело диаметр около 4 мм. В нижеследующей таблице дана соответствующая информация о каждом пятне.

Золь Au, M	Частицы/мл	Диаметр пятна (мм)	№ частиц	Наблюдения
3× 10-11	2.3× 1010	12.4	4.6× 108	Очень интенсивная желтая окраска
1× 10-13	2.3× 109	12.8	4.6× 107	Интенсивная желто-зеленая окраска
3,8× 10-23	2.3× 10s	11.4	4.6× 108	Слабая, но обнаружимая зеленая окраска
* Обнаружимая глазом.

В представленной ниже таблице вышеуказанные данные приводятся в единицах, которые являются наиболее важными для клинического анализа. Высота жидкости в пятне может быть вычислена по уравнению

h=V/A,

где V обозначает объем жидкости в пятне (20 мл=0,02 см³), а А обозначает площадь пятна (в см²) пятна. С использованием А=1.2 см² получим h=0,016 см=160 мкм. Эта высота гораздо меньше глубины поля, наблюдаемого глазом или нашими электронными и оптическими устройствами для детекции, а поэтому каждое пятно ведет себя (с геометрической точки зрения) так, как если бы все частицы были на поверхности предметного стекла, и чувствительность, приведенная в таблице, аналогична чувствительности, ожидаемой для частиц, осажденных на поверхности.

Аu, М	Площадь пятна, см2	Площадь пятна, мкм2	Частиц на пятно	#Частиц на мкм2	""Интенсивность на пятно
3.8× 10-11	1.2	1.2× 108	4.6× 108	3.83	Очень интенсивная желтая окраска
3.8× 10-12	1.2	1.3× 108	4.6× 107	0.35	Интенсивная желто-зеленая окраска
3.8× 10-11	1.2	1.2× 108	4.6× 106	0.38	Слабая, но детектируемая зеленая окраска

* Обнаруживается глазом

 ^# Этот столбец был вычислен путем деления числа частиц в пятне на площадь пятна.

Пример 22. Золотые частицы размером 60 нм, осажденные на поверхность предметного стекла, покрытого BSA

Получали серию разведении раствора золотых частиц размером 60 нм и 3 мкл каждого разведения осаждали в виде небольшого пятна на предметном стекле, покрытом BSA. Пятна на этом стекле были расположены рядами. Предметное стекло инкубировали в увлажняющей камере в течение 6,5 часов, а затем промывали стерильной водой. Плотность частиц на каждом пятне определяли путем подсчета частиц в условиях DLASLPD при помощи оптического микроскопа, который снабжен окуляром с градуировочной сеткой. Результаты представлены в нижеследующей таблице.

№ участка	Концентрация осадка* Частица/мл	Полное число осажденных частиц	#Частиц на 100 микрон2
1	2.3× 1010	2.3× 108	460
2	2.1× 109	2.1× 107	41.8
3	7× 106	7× 106	13.9
4	3.5× 106	3.5× 106	7
5	1.75× 106	1.75× 106	3.48
6	8.75× 107	8.75× 105	1.74

* Концентрация осадка равна концентрации раствора незащищенного золотого золя, который наносили на пятно.

# Частицы на микрон² - Число частиц на площадь 100 микрон, если все частицы в растворе, осажденном на определенной поверхности, связываются с предметным стеклом. Площадь, покрытая раствором, имеет диаметр около 8 мм. Площадь: А=3,1416 · 4² см=0,5 см²=0,5× 10⁸ микрон².

Через 6,5 часа предметное стекло промывали путем мягкого опрыскивания стерильной водой каждой поверхности предметного стекла, содержащей золотые частицы. Это предметное стекло сушили бытовым феном после холодного осаждения. Осушенное предметное стекло визуально оценивали при помощи оптического микроскопа в условиях DLASLPD, и плотность частиц на каждой поверхности определяли при помощи градуировочной сетки окуляра микроскопа для подсчета площади частиц на квадрат сетки. Результаты представлены в нижеследующей таблице.

Образец	Глаз*	Осажденные частицы/100 микрон2	Частицы, подсчитанные с использованием сетки (площадь, микрон2)#	Частицы, подсчитанные на 100 микрон2
1	Очень интенсивная зеленая окраска	460	20**(39)	51,2
2	Интенсивная желто-зеленая окраска	41,8	7(39)	18
3	Слабая желто-зеленая окраска	13,9	13(100)	13
4	Интенсивности не обнаружено	7	0	0
5	Интенсивности не обнаружено	3,48	0	0
6	Интенсивности не обнаружено	1,74	0	0

* Глаз - Этот столбец соответствует интенсивности, вызываемой освещением микроскопа в условиях DLASLPD и наблюдаемой глазом как интенсивность света, идущего от золотых частиц на конкретном участке предметного стекла.

** - Частицы в этой области были слишком многочисленны для подсчета, и ошибка указанного здесь значения может превышать 2х.

# - Участок, указанный в скобках, представляет собой участок в 1 квадрат сетки для объективного и оптимально варьируемого режима, используемого для подсчета частиц.

Образец	Частицы, присутствующие на микрон2	Глаз*
1	0,512	Очень интенсивная желто-зеленая окраска
2	0,18	Интенсивная желто-зеленая окраска
3	0,13	Достаточно интенсивная желто-зеленая окраска
4	0	Интенсивность не обнаруживалась
5	0	Интенсивность не обнаруживалась
6	0	Интенсивность не обнаруживалась

Пример 23. Чувствительность для визуального обнаружения интенсивности от небольшого жидкого пятна золотых части размером 60 нм

Было получено два разведения 3,4× 10^-12 М (0,005% золота) золотых золей с размером частиц 60 нм, и 2 мл каждого разведения осаждали в виде отдельного пятна на предметном стекле. Каждое пятно имело диаметр около 4 мм (площадь = 6,28× 10⁶ мкм²).

Различные пятна располагались рядами в середине одного предметного стекла. Концентрации частиц и плотностей в каждом пятне приводятся в нижеследующей таблице.

Золотой золь, М	Частицы/мл	Частицы/мкл	Частицы/мкм2
3,4× 10-12 М	2,1× 109	2,1× 106	0,31
1,05× 10-12 М	1,05× 109	1,05× 106	0,155
0,5× 10-12 М	0,5× 109	0,5× 106	0,077
0,25× 10-12 М	0,25× 109	0,25× 106	0,0385

Для определения самой низкой плотности частиц по интенсивности рассеянного света, наблюдаемой невооруженным глазом, мы поместили предметное стекло на призму Порро с помощью иммерсионного масла. Каждое пятно еще в жидкой форме было затем освещено светом от осветителя Бош-Ломба. Этот осветитель имеет × 10 обьектив на конце волокна. Это пятно, продуцируемое осветителем, составляло около 4 мм в диаметре. В темной комнате, ночью, мы могли наблюдать до 0,0385, хотя позже оно едва лишь было видно.

Пример 24. Чувствительность для фотодиодной детекции золотых частиц размером 60 нм (в суспензии) при различных концентрациях в лунках иммунологического пластикового планшета для микротитрования

Различные разведения золя из золотых частиц размером 60 нм помещали в разные лунки Immulon (200 мкл на каждую лунку). Для измерения интенсивности рассеянного света дно лунок освещали белым светом, идущим от осветителя микроскопа Leica, который был снабжен объективом × 10. Дно лунки находилось на расстоянии в несколько миллиметров от объектива. Свет из объектива продуцировал луч, который фокусировался в центре лунки. Диаметр луча в главном фокусе составлял около 5 мм. Рассеянный луч детектировался фотодиодом, который располагался так, что он позволял регистрировать свет, идущий через боковую стенку лунки (детекция под прямым углом). Рассеянный луч детектировали через небольшое отверстие (диаметром около 1 мм), которое было расположено перед фотодиодом для ограничения детекции фонового излучения. Лунки, содержащие различные разведения золотого золя, были соединены друг с другом, и каждая лунка могла быть последовательно расположена при освещении и детекции. Излучение на выходе фотодиода измеряли с помощью операционного усилителя, который работал в токовом режиме. Фотодиод работал в фотогальваническом режиме. Получали две серии разведений 60 нм золота, и интенсивности измеряли с помощью фотодиода.

а. Первая серия разведений

Маточный раствор (3,8× 10^-12 М) подвергали двукратному разведению. Были получены нижепривиденные величины. Эти величины были измерены с использованием резистора 5 мегаом в контуре обратной связи операционного усилителя.

Концентрация золотых частиц	Интенсивность (Вольт)
1,9× 10-11 М	3,27
0,95× 10-11 М	1,6
4,75× 10-12 М	0,89
2,38× 10-12 М	0,44
1,2× 10-12 M	0,24
0	0,075

b. Второе разведение

Раствор с разведением х11 (3,4× 10^-12 М) разводили вдвое.

Получали следующие результаты:

Концентрация золотых частиц	Интенсивность (Вольт)
34× 10-12 M	0,614
1,7× 10-12 М	0,378
8,5× 10-13 М	0,198
4,25× 10-13 М	0,147
2,13× 10-13 М	0,100
1,06× 10-13 М	0,086
0	0,075

Эти результаты указывают на то, что в лунках мы можем обнаруживать золотые частицы диаметром 60 нм в интервале концентраций 1,9× 10^-11-1× 10^-13 М. Верхний предел диапазона может быть увеличен.

Пример 25. Воспроизводимость осаждения и визуальной детекции (суммарная интенсивность рассеянного света) золотых частиц размером 600 нм, осажденных на предметном стекле, покрытом ВSА

3 мкл 2х разведения раствора, содержащего 0,005% золотых частиц (60 нм), осаждали, каждый, в виде 5 пятен на предметное стекло, покрытое BSA. Это предметное стекло инкубировали в течение пяти минут, а затем вводили в лабораторный сосуд, содержащий 150 мл дистиллированной воды. Вода смывала несвязанное золото с предметного стекла. Затем пятна освещали светом, идущим от осветителя (белый свет, осветитель SpectraMetrix). Золотые частицы в каждом пятне были расположены в виде кольца (то есть частицы не были однородно распределены по пятну, а были сосредоточены в кольце), которое рассеивало зеленый свет и могло быть ясно видно в темной комнате невооруженным глазом.

Этот эксперимент повторяли снова со стеклом, вновь покрытым BSA, за исключением того, что во время инкубирования пятен золотых частиц это предметное стекло слегка постукивали пальцем с боковой стороны так, чтобы перемешать жидкость в пятнах, содержащих золотые частицы. Через 5 минут предметное стекло вводили в 150 мл стерильной воды в лабораторном сосуде и свет, рассеянный каждым пятном, наблюдали по очереди с использованием белого света, идущего из осветителя SpectraMetrix. Этот осветитель продуцировал на предметном стекле пятно света диаметром около 5 мм. Золотые пятна можно было ясно наблюдать посредством рассеянного света, где золотой золь был осажден на предметное стекло. Пятна наблюдали при погружении предметного стекла в воду, при котором рассеяние уменьшалось вследствие нарушения структуры пятна на предметном стекле.

Все пятна рассеивали зеленый свет и имели ту же самую интенсивность, которая наблюдалась при визуальной оценке. В центре каждого пятна имелось небольшое не рассеивающее свет пятно (темное пятно).

Пример 26. Цвет света, рассеянного золем, состоящим из золотых частиц диаметром 60 нм, при различных концентрациях золотых частиц

Шесть 8× 50 мм (1,6 мл) полистироловых пробирок промывали путем подачи струи стерильной воды из колбы-распылителя. Избыток воды удаляли из каждой пробирки с помощью центрифужного шейкера, но эти пробирки не осушали. Затем раствор золотых частиц (60 нм, 0,005%) серийно разводили в 1, 1, 4, 8, 16 и 32 раза. Каждая пробирка содержала 500 мл раствора золотых частиц. Разведенный золотой золь был стабильным (рассеянный свет не изменял своего цвета после отстаивания) в полистироловых пробирках. Не наблюдалось какой-либо агрегации. Свет, рассеянный различными разведениями, имел цвета, указанные ниже. Золотой золь, использованный в этих исследованиях, промывали несколько раз стерильной водой для удаления солей (которые использовали для получения золотого золя), которые, очевидно, дестабилизируют частицы золота.

Разведение	Цвет
1	Желто-зеленый
2	Желто-зеленый
4	Светло-зеленый
8	Светло-зеленый
16	Светло-зеленый
32	Светло-зеленый

Пример 27. Стабилизация золотых частиц с использованием ВSА

Мы обнаружили, что для стабилизации золотого золя в целях предохранения его от агглютинации под действием 1% NaCI необходимо использовать 900 мг BSA на 1 мл 0,005% золя золотых частиц размером 60 нм.

Пример 28. Осаждение золотых частиц размером 60 нм с высокой плотностью частиц на предметных стеклах, покрытых BSA

Этот пример иллюстрирует способ осаждения пятен из золотых частиц с различной поверхностной плотностью (25-100 частиц/мкм²) на предметном стекле. Эти пятна были использованы в Примерах 30 и 31 для определения интенсивности, цвета и гомогенности света, рассеянного этими пятнами (освещение белым светом) и наблюдаемого невооруженным глазом и под оптическим микроскопом с использованием методов DLASLPD.

4 мл золя золотых частиц размером 60 нм (0,005%, 2× 10^-10 частиц на 1 мл) центрифугировали в клинической центрифуге при максимальной скорости до тех пор, пока золотые частицы не осаждались на дно пробирки (около 30 минут). Супернатант удаляли, и мягкий осадок разводили в 1, 2 и 4 раза. По нашим оценкам, твердый осадок имел концентрацию около 3× 10^-11 частиц на 1 мл. 4 мл каждого разведения осаждали отдельными пятнами на BSA-покрытое предметное стекло, и жидкость в каждом пятне оставляли для испарения при комнатной температуре. Число частиц, осажденных в каждом пятне (предполагая, что × 1 золотого золя имеет концентрацию 3× 10¹¹ частиц/мл), указано в нижеприведенной таблице. При этом следует отметить, что максимальная плотность частиц, которая может быть достигнута при размере частиц 60 нм (насыщенный монослой частиц), составляет 354 частиц/мк².

После выпаривания растворителя каждое пятно исследовали на его внешний вид при комнатном освещении и в условиях освещения DLASLPD (наблюдаемого невооруженным глазом). Освещение DLASLPD получали с помощью осветителя микроскопа Leica, который имел × 10 фокусирующие линзы микроскопа и продуцировал узкий луч света, который фокусировался в небольшое пятно на расстоянии около 10 мм от объектива. Эти пятна также наблюдали под оптическим микроскопом с использованием методов DLASLPD с объективами × 2,5, × 10, × 25 и × 40 и с дополнительным увеличением × 1,25, × 1,6 и × 2. С объективами × 10 и × 20 за один раз был виден лишь небольшой участок каждого пятна. Для определения поверхностной плотности частиц для каждого пятна мы подсчитали количество частиц, наблюдаемых через микроскоп на данной площади, и полученное значение делили на эту площадь. Площадь определяли с помощью сетки, имеющейся в окуляре микроскопа, которая была калибрована с помощью микрометровой шкалы предметного стекла. Так, например, при подсчете частиц с использованием объектива × 40 и дополнительного увеличения 1,25 и 2 (перед окуляром), один квадрат в сетке окуляра, используемый для подсчета частиц, составлял соответственно, 6,25 мкм × 6,25 мкм (площадь квадрата = 39,1 мкм²) и 10 мкм × 10 мкм (площадь = 100 мкм²). Эти значения равны площадям в плоскости объекта.

Пример 29. Наблюдения пятен золотых частиц с высокой поверхностной плотностью на воздухе

В этом примере пятна золотых частиц получали, как описано в Примере 29, и оценивали визуально и с помощью микроскопа с использованием освещения DLASLPD. Пятна были сухими, и поэтому золотые частицы были в воздухе.

а. Пятно с × 1-развдением

При комнатном освещении пятно имело вид темно-пурпурного пятна с более светлым пятном в центре, имеющим диаметр менее 1 мм. В условиях освещения DLASLPD пятно имело более однородную беловато-оранжевую окраску. Пятно имело высокую интенсивность. В условиях DLASLPD под микроскопом (объектив × 10, дополнительное увеличение окуляра × 2, × 12,5), пятно, наблюдаемое через окуляр, имело высокую интенсивность оранжевого цвета. Могли легко наблюдаться отдельные частицы. Могли наблюдаться некоторые частицы, очень близко расположенные друг от друга или даже перекрывающиеся друг с другом. Большинство частиц имело оранжевый цвет, но некоторые частицы имели зеленый цвет. Две или более частиц, которые расположены друг от друга на расстоянии, меньшем, чем пространственное разрешение микроскопа, были видны как одна частица. Если пространство между частицами было настолько мало, что эти частицы оказывали влияние на светорассеивающие свойства друг друга, то группа частиц казалась одной частицей, имеющей цвет, который отличался от цвета действительно одной частицы. При высокой плотности частиц исходя из теоретических вычислений предполагается, что многие частицы будут отделены друг от друга расстояниями, которые меньше разрешения микроскопа. При этом вид пятна значительно не меняется при наблюдении с объективом × 10 или × 20. Площадь на предметном стекле, которая находилась за пределами пятна (фон), была очень темной по сравнению с интенсивностью пятна. С объективом × 2,5 могло наблюдаться все пятно. При этом пятно имело интенсивный оранжевый цвет с небольшим зеленым кольцом по периферии. Цвет казался почти однородным в оранжевой области, хотя те же самые участки казались светлее, чем остальные. Поверхностная плотность частиц в зеленом кольце была значительно ниже, чем плотность в оранжевой области.

b. пятно с × 2-разведением

При комнатном освещении пятно имело пурпурную середину, окруженную внешним кольцом с темным пурпурным пятном около 2 нм в центре. При освещении в условиях DLASLPD пятно имело довольно однородную беловато-желтоватую окраску. Это пятно имело высокую интенсивность. В условиях DLASLPD под оптическим микроскопом (объективы × 10 и × 20, дополнительное увеличение × 2, окуляр 12,5) пятно, наблюдаемое через окуляр, имело в высокой степени интенсивную оранжевую окраску, но этот цвет не был однородным, как при разведении × 1. Наблюдались участки, которые имели зеленоватый цвет. Были видны частицы, очень близко расположенные друг к другу. Большинство частиц имело оранжевый цвет, но присутствовали также зеленые частицы, которые в подавляющем большинстве находились в зеленых участках. По своему виду пятно было не очень интенсивным при его наблюдении с объективами × 10 или × 20. Площадь за пределами пятна была очень темной по сравнению со светлым пятном. При наблюдении с объективом 2,5 все пятно не было видно. Оно имело интенсивную оранжевую окраску с небольшим зеленым кольцом на периферии. Как было заметно, окраска в оранжевой области была почти однородной, хотя некоторые пятна казались светлее, чем остальные. Некоторые из этих неоднородностей обусловлены негомогенностью системы освещения, которая не была оптимизирована.

с. пятно с × 4-разведением

При комнатном освещении пятно имело очень светлую пурпурную окраску с небольшим темным пятном (диаметром около 1 нм), расположенным на одной стороне окружности пятна. При освещении в условиях DLASLPD пятно имело довольно однородную беловато-зеленую окраску. Это пятно имело высокую интенсивность. В условиях DLASLPD под оптическим микроскопом (объективы × 10, дополнительное увеличение × 2, окуляр 12,5) наблюдаемое пятно было в высокой степени неоднородным, вероятно, из-за неравномерного испарения растворителя. Центр пятна имел в высокой степени интенсивную оранжевую или сиреневую окраску. В этой центральной области частицы были расположены очень близко друг к другу или даже перекрывались, при этом большинство частиц имело оранжевый цвет, а некоторые из них имели зеленый цвет. Дальше от центра пятно имело зеленоватую окраску с преобладанием зеленых частиц, где остальные частицы имели оранжевый цвет. Наблюдались чередующиеся кольца зеленого и желтого цвета на периферии. Площадь за пределами пятна (фон) была очень темной по сравнению с интенсивным пятном. Все пятно можно было видеть с объективом × 2,5. Пятно имело овальную форму с оранжевым или сиреневым пятном (диаметром около 1,5 мм) в центре. Это пятно было окружено яркими кольцами с чередующимися желто-зелеными и зелеными участками. Небольшое кольцо на периферии было менее ярким (но все же интенсивным) и имело явно выраженную зеленую окраску. В этой периферической области почти все частицы были зеленого цвета и могли быть подсчитаны с использованием объектива × 40 с дополнительным увеличением × 2. Поверхностная плотность частиц в зеленой области составляла примерно 20 частиц/39,1 мкм², или 0,5 частиц на 1 мкм². На самой периферии число частиц резко падало, и мы подсчитали около 7 частиц на 100 мкм² или 0,07 частиц/мкм². Градиент частиц в этом пятне позволял нам предположить, что предел подсчета частиц составляет вплоть до около 1 частица/мкм².

Выводы, сделанные относительно иммобилизованных частиц в воздухе

а. Процедура, описанная выше, позволяет осаждать частицы золота с высокой плотностью на небольших пятнах (4 мм). Эти осажденные частицы не являются абсолютно однородными при наблюдении при комнатном освещении, как и ожидалось для процесса испарения, который мы использовали для образования пятен.

b. В условиях DLASLPD под оптическом микроскопом пятна разведений × 1 и × 2 были почти однородны. Пятно разведения х4 являлось более неоднородным.

с. Плотность частиц пятен является, очевидно, слишком высокой для того, чтобы можно было подсчитать частицы (частицы находятся на расстоянии, слишком близком по сравнению с разрешением микроскопа). Однако на периферии пятна с разведением × 4 частицы можно было подсчитать и их плотность составляла около 0,5 частиц/мкм². Плотность частиц близка к максимальной плотности частиц, которые могут быть подсчитаны при разрешающей способности нашего микроскопа.

Пример 30. Наблюдения пятен золотых частиц с высокой поверхностной плотностью в воде

Предметное стекло, используемое в Примере 30, погружали в 150 мл стерильной воды в лабораторном сосуде. Частицы не должны смываться с предметного стекла. С использованием осветителя микроскопа с объективом 10х пятна золотых частиц на погруженном в воду предметном стекле должны освещаться отдельно узким лучом света. Цвет пятен (при наблюдении невооруженным глазом) не изменялся при их погружении в воду. Стеклянное предметное стекло вынимали из сосуда с водой и покрывали покровным стеклом. Золотые частицы были окружены тонкой пленкой воды. Наблюдения под микроскопом дали следующие результаты:

а. пятно с разведением × 1

При наблюдении в условиях DLASLPD с помощью оптического микроскопа с объективом × 2,5, дополнительным увеличением × 1,25 и окуляром × 12,5 пятно имело почти однородный оранжево-сиреневый цвет. На периферии пятна находились яркие почти зеленые частицы. Частицы по краям могут быть легко заметны с использованием 10х - 40х- объективов. Поверхностная плотность частиц была очень высокой для всех пятен даже по краям за исключением очень тонких колец совсем на периферии, где отдельные частицы могли быть легко различимы как светлые объекты.

b. пятно с разведением х2

Через окуляр 12,5х с использованием объективов × 2,5 и дополнительного увеличения х1,25 можно было наблюдать все пятно. Пятно имело очень интенсивную желтую окраску и казалось почти однородным. Большая часть пятна была желтой, но по направлению к периферии оно имело желто-зеленую окраску. С использованием объектива × 40 и дополнительного увеличения × 1,25 частицы имели очень высокую поверхностную плотность.

Большинство частиц имело желто-зеленую окраску. Несколько частиц было зеленого или красного цвета. Пятно имело почти однородную интенсивность за исключением периферии, где плотность частиц очень резко снижалась до нуля (темный фон). При этом на периферии, где поверхностная плотность частиц была очень мала, можно было наблюдать и подсчитать отдельные частицы с темным пространством между ними.

с. пятно с разведением × 4

С использованием объектива × 2,5 и дополнительного увеличения × 1,25 можно было наблюдать все пятно. Пятно имело очень интенсивную желтую окраску и было очень однородным в отличие от наблюдений на воздухе, где пятно имело много зеленых участков. Отдельные частицы можно было легко наблюдать с объективом × 40 и дополнительным увеличением × 1,25. Частицы в воде были гораздо более интенсивными или имели бриллиантовый оттенок, чем это казалось при наблюдении на воздухе. Частицы на периферии не были преимущественно зелеными, но в воде большинство частиц были зелеными, а некоторые частицы имели красный и оранжевый цвет. Большая часть пятна имела очень интенсивный желтый цвет. При наблюдении с объективом × 40 были видны отдельные частицы, но они были очень плотными и перекрывались друг с другом. В большей части яркого участка пятна частицы, наблюдаемые с объективом × 40 и дополнительным увеличением, имели плотность около 25 частиц на 39,1 мкм², или около 0,6 частиц/мкм². Это число не может представлять истинную поверхностную плотность частиц из-за ограниченной разрешающей способности микроскопа.

Выводы, сделанные относительно иммобилизованных частиц, покрытых водой

При помещении золотых частиц в воду было выявлено, что это придает им более однородную интенсивность. При наблюдении невооруженным глазом с освещением оптического микроскопа в условиях DLASLPD (предметное стекло, установленное на призме и приклепленное к призме с помощью иммерсионного масла) было установлено, что пятна с разведениями × 2 и × 4 имели желтый цвет. Пятно с разведением х1 казалось оранжевым.

Пример 31. Связывание реагента, содержащего конъюгат "60 нм - частицы золота - ВSА - биотин" с магнитными сферами

Этот пример демонстрирует возможность детекции и количественной оценки специфического связывания золотых частиц с магнитными сферами путем измерения интенсивности рассеяния света в суспензии, а также детекции отдельных золотых частиц, связанных с магнитными сферами, при помощи оптической микроскопии в условиях DLASLPD.

Золотые частицы размером 60 нм покрывали BSA, который был ковалентно помечен биотином (BSA - биотин - Аu). В каждую из пяти микроцентрифужных пробирок добавляли 500 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (рН 7,4), содержащего 0,1% раствор BSA. Пробирки маркировали 0, 1, 2, 3, 4. В каждую пробирку добавляли раствор BSA - биотин - Аu при концентрации золотых частиц 3,8× 10^-11 М и эти пробирки встряхивали. Затем в каждую пробирку добавляли дополнительные количества раствора BSA - биотин - Аu для получения концентрации конъюгата "золотые частицы - BSA - биотин", равной 8× 10^-13 М. Затем в каждую пробирку добавляли еще некоторое количество (мкл) суспензии сфер стрептавидина Dyna beads M280 (сферы, содержащие стрептавидин диаметром 2,8 микрон, ковалентно связанный с поверхностью этих сфер), содержащей 6,7× 108 сфер Dyna beads/ мл (10 мг/мл) или молярную концентрацию около 1× 10^-12 М сфер и растворенной в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), рН 7,4, содержащем 0,1% BSA и 0,02% NaN₃.

Пробирки инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем помещали одну за один раз, начиная с пробирки 0, в концентратор магнитных частиц для отделения магнитных сфер от раствора. Через 2 минуты раствор супернатанта осторожно удаляли вместе с пробиркой, находящейся в магнитной центрифуге. Супернатант помещали в 1 мл пробирку для микрокультивирования. Пробирку 5 оставляли на 5 минут в магнитном концентраторе, а другие пробирки оставляли на 2 минуты. Затем измеряли интенсивность света, рассеянного супернатантами в фотометре SpectraMetrix, в следующем режиме: резистор РМ на выходе = 0,1 Мегаом, фильтр на стороне возбуждения = оранжевый фильтр CS 3-67, × 10 аттенюатор нейтральной плотности = на выходе.

Были измерены следующие интенсивности рассеяния света:

Пробирка #	Интенсивность (Вольт)
0	1,21
1	1,04
2	0,644
3	0,49
4	0,362

Супернатанты возвращали в их соответствующие пробирки, содержащие магнитные сферы, а затем оставляли для инкубирования еще на 2 часа. Через 2 часа пробирки приготавливали, как описано выше, и получали интенсивности рассеяния света для супернатантов:

Инкубирование в течение более 2 часов не привело к более эффективному связыванию золотых частиц-ВSА-биотина с магнитными сферами.

Каплю магнитных сфер со связанными золотыми частицами осаждали на предметном стекле микроскопа и покрывали покровным стеклом. После этого предметное стекло оценивали в условиях DLASLPD при помощи оптического микроскопа. Магнитные сферы могли быть легко различимы благодаря сильно рассеивающим объектам, а золотые частицы на сферах были с трудом различимы в результате сильного рассеивающего действия крупных магнитных сфер. Однако, если водную среду заменить на среду бани с показателем преломления около 1,4-1,5, частицы могут быть видны более отчетливо. Кроме того, если луч светового освещения наклонен под большим углом по отношению к линии, перпендикулярной предметному стеклу, то золотые частицы могут быть видны более отчетливо.

Пример 32. Детекция гибридизации нуклеиновой кислоты с меченными нуклеиновой кислотой частицами золота (Аu) диаметром 40 нм

1. Получение частиц золота (Аu), покрытых химически активированным комплексом полиэтиленгликоля-амина.

Реакционноспособные аминогруппы для конъюгирования нуклеиновых кислот с частицами Аu получали следующим образом. Частицы золота диаметром 40 нм покрывали полиэтиленовым соединением (бис(полиоксиэтилен-бис[3-амино-2-гидроксипропилом]) способом, описанным в Примере 12. В результате были получены золотые частицы диаметром 40 нм с тонкой пленкой полиэтиленового соединения, которые имели несколько химически реакционноспособных аминовых групп для конъюгирования нуклеиновых кислот с частицами.

2. Получение нуклеиновых кислот для конъюгирования с золотыми (Аu) частицами диаметром 40 нм.

Гомополимеры полицитидиловой кислоты (Poly (С)) и полиинозиновой кислоты (Poly (I)) химически модифицировали следующим образом. 0,8 мг и 1,3 мг Poly (I) и Poly (С) помещали в отдельные пробирки. В каждую пробирку добавляли 1,0 мл 0,1 М раствора 1-этил-3,3-диметиламинопропилкарбодиимида (CDI) в имидазоловом буфере, рН 8,5, а затем проводили инкубирование в течение 1 часа. Полученные нуклеиновые кислоты осаждали этанолом и ресуспендировали в буфере для гибридизации (20 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCI, 1 мМ EDTA, рН 7,6).

3. Конъюгирование активированных нуклеиновых кислот с активированными частицами золота (Au).

Ту же самую схему использовали для получения Poly (I)- и Poly (С)-препаратов. К 50 мкл раствора нуклеиновой кислоты добавляли 20 мкл раствора активированных частиц (40 нм-Au-ПЭГ) и 100 мкл Hepes 0,2 М, рН 8,0, а затем инкубировали в течение одного часа при 50° С. После реакции конъюгаты Poly (С) и Poly (I)-40 нм Аu-нуклеиновой кислоты собирали путем центрифугирования, промывали и ресуспендировали в буфере для гибридизации.

4. Эксперименты по гибридизации

Были исследованы гибридизационные свойства конъюгата "нуклеиновая кислота-40 нм-частицы Аu" (золотые частицы диаметром 40 нм с нуклеиновыми кислотами ковалентно связывались с покрытой полимером поверхностью частицы). Были использованы методы с применением оптического микроскопа в условиях DLASLPD. Было также использовано экспериментальное устройство "предметное стекло - жидкость - покровное стекло", показанное на Фиг.9. Каплю препарата на основе конъюгата Poly(С)- частиц] Аu помещали на предметное стекло и покрывали покровным стеклом. Одну каплю иммерсионного масла наносили на конденсате микроскопа, а затем предметное стекло помещали на верхнюю часть конденсатора. Был использован 10х объектив. Раствор становился почти гомогенным, и конъюгаты Poly(С) - частицы А могли быть заметными при прохождении раствора через поле. Очевидно, что их броуновское движение было слабее, чем то, что мы предварительно наблюдали для золотых частиц (40 нм), не меченных нуклеиновыми кислотами. Очевидно, что несколько агрегатов "Poly(С) - частицы Аu" прилипали к поверхности предметного стекла. Ими были несколько агрегатов Poly(С) - частицы Аu, главным образом, от 2 до 4 агрегата Poly(С)-частицы Аu Эти агрегатные структуры перемещались как единое целое при и прохождении через поле наблюдения. Нами было отмечено, что плотность агрегатов Poly(С)-частицы Аu, связанных с поверхностью предметного стекла, увеличивалась по мере наблюдения этого предметного стекла в течение нескольких минут. Окраска рассеянного света, идущего от агрегатов Poly(С)-частицы Au, была зеленой. Затем покровное стекло удаляли, и одну каплю poly(I)-Au препарата помещали на влажную поверхность предметного стекла, содержащего каплю Poly(C)-Au. Контакт между двумя пятнами достигался путем использования металлического зонда для задерживания потока жидкости из капли Poly(I)-Au в целях смачивания части предметного стекла, содержащей Poly(С)-Аu. Сверху помещали покровное стекло, а затем это предметное стекло снова помещали под микроскоп и исследовали. Все это время мы наблюдали образование возрастающего числа агрегатов Poly(I)-Au-Poly(С)-частицы Аu. Через примерно 20 минут мы сканировали предметное стекло и установили, что присутствовало очень небольшое число отдельных частиц, и большинство частиц были в агрегатах, состоящих из нескольких частиц, причем многие из них прикреплялись к предметному стеклу. Как было видно, агрегаты имели определенную форму, то есть было заметно, эти частицы агрегируют в соответствующие скопления частиц, где некоторые из них были похожи на катушки с произвольно намотанной нитью, а другие имели вид сетей с разветвленными цепочками. Вид этих множественных агрегатов очень отличался от вида нескольких агрегатов, которые мы наблюдали на контрольном предметном стекле с Poly(C)-Au. При наблюдении с х40 объективом в некоторых агрегатах некоторые частицы по своему цвету казались скорее желтыми, чем зелеными. Затем мы удаляли покровное стекло с предметного стекла, содержащего реакционную смесь Poly(Au)-Poly(I)-Au, а затем на предметное стекло добавляли каплю 10^-5 М этидийбромида и покрывали покровным стеклом. Мы наблюдали едва заметную оранжевую окраску, продуцируемую агрегатами частиц на предметных стеклах, то есть такую окраску, которая образовалась бы, если поместить зеленые и желто-зеленые частицы на фон, окрашенный светло-оранжевым цветом. В областях, находящихся за пределами агрегатов, оранжевой окраски не наблюдалось. Эта слабая оранжевая окраска свидетельствовала о том, что вблизи и внутри агрегатов частиц имеются двухцепочечные структуры. Этот факт мы интерпретировали как гибридизацию конъюгатов "Poly(C)-Au" с конъюгатами "Poly(I)-Au". Это предметное стекло удаляли, а контрольное стекло, содержащее каплю Poly(I)-Au, наблюдали под микроскопом. Мы провели аналогичные наблюдения для сравнения с контрольным предметным стеклом с Poly(C)-Au, в результате чего было установлено, что этот Poly(I)-Au-препарат имел примерно в два раза больше мелких агрегатов, чем контрольное предметное стекло с Poly(C)-Au. Цвет рассеянного света казался зеленым, тогда как у некоторых агрегатов он казался желто-зеленым.

В этом варианте анализа обе комплементарные цепи были помечены золотыми частицами. Поскольку комплементарные нити гибридизовались, то появлялись агрегаты частиц. Связывание нуклеиновых кислот может быть детектировано путем регистрации рассеянного света, идущего от золотых частиц или аналогичных частиц. Было также обнаружено, что в том случае, когда две или более частиц Аu находятся в непосредственной близости друг от друга, цвет рассеянного света может меняться. Это изменение цвета рассеянного света может быть также использовано как способ детекции события связывания. При этом следует отметить, что частицы Аu или любая другая частица, которая достаточно рассеивает свет, может быть использована в многочисленных вариантах анализа для определения связывания нуклеиновых кислот или любой другой пары "лиганд-рецептор" в формате анализа с выделением или без выделения.

Пример 33. Детекция золотых частиц, связанных с крупными полистироловыми сферами

Мы наносили каплю раствора сферических полистироловых частиц диаметром около 2 микрона, покрытых биотином, на предметное стекло микроскопа и наблюдали через оптический микроскоп в условиях DLASLPD. Эти полистироловые частицы были легко заметны в виде ярких белых светящихся точек. Затем мы наносили каплю препарата, содержащего покрытые стрептавидином золотые частицы размером 60 нм, на каплю полистироловых частиц и наблюдали этот препарат в микроскоп. Мы наблюдали яркие белые полистироловые частицы, и вокруг этих частиц было заметно слабое гало желто-зеленого цвета. Затем мы выпаривали раствор с предметного стекла и наносили на препарат каплю иммерсионного масла, после чего исследовали под микроскопом. Можно было легко видеть отдельные золотые частицы и большие круговые кольцевые области золотых частиц желто-зеленого цвета. Полистироловые частицы казались почти темным или черным пятном, окруженным гало или кольцом желто-зеленого цвета. Этот метод может быть использован для детекции золотых частиц или других металлоподобных частиц, связанных с поверхностью твердого материала и небольшими твердыми фазами, такими как стекло или другие сферы, и биологические клетки и т.п.

Пример 34. Светорассеивающие свойства золотых частиц, покрытых полиэтиленовым соединением

Были использованы золотые частицы диаметром приблизительно 100 нм, приготовленные нитратным методом. Часть этого раствора помещали в отдельный контейнер и частицы покрывали полиэтиленгликолевым соединением (Mw=20000) с использованием процедуры, описанной выше.

Для сравнения рассеяния света частицами с покрытием и частицами без покрытия образцы разводили в воде до тех пор, пока каждый раствор не принимал слабый розовато-красный оттенок. Интенсивность рассеянного света по отношению к профилям длины волны падающего света для образцов регистрировали с использованием фотометра SpectraMetrix.

Для проведения этих измерений монохроматор помещали между источником света и образцом, и рассеянный свет регистрировали при увеличении длины волны на 10 нм в диапазоне от 400 до 700 нм при соответствующем режиме работы монохроматора. Полученные данные были скорректированы на длину волны в зависимости от характеристик монохроматора и фотодетектора как функций длины волны с помощью калибровочной кривой, которая была построена с использованием частиц двуокиси кремния размером 12 нм. Эти данные были проанализированы с использованием калибровочной кривой. Полученные данные представлены на Фиг.16.

Эти данные показали, что золотые частицы диаметром 100 нм с покрытием и без покрытия давали почти одинаковую интенсивность рассеянного света в зависимости от профилей длины волны падающего света. Поэтому множество различных типов макромолекулярных веществ, таких как антитела, нуклеиновые кислоты, рецепторы или т.п., могут быть нанесены на поверхность частиц без какого-либо значительного изменения их светорассеивающих свойств.

Другие варианты осуществления изобретения приводятся в формуле изобретения.

1. Способ детектирования одного или более аналитов в образце с использованием частиц в качестве метки, заключающийся в том, что соединяют любой упомянутый один или более аналитов в образце с частицей, обнаружимой по рассеянному свету; используют частицу, которая содержит по меньшей мере 0,1 вес.% материала, выбранного из группы, состоящей из металла, металлического соединения, окиси металла, полупроводника, сверхпроводника, или их смесь, при этом частица содержит по меньшей мере один слой покрытия, обеспечивающий химическую стабильность указанной частице, освещают частицу, связанную с аналитами, светом при условиях, которые производят рассеянный свет от частицы и при которых свет, рассеянный от одной или более частиц, может быть обнаружен человеческим глазом с увеличением менее чем в 500 раз и без электронного усиления; детектируют упомянутый свет, рассеянный частицами при упомянутых условиях, в качестве меры присутствия упомянутого одного или более аналитов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что частица имеет размер, подходящий для генерации света определенного цвета при наблюдении человеческим глазом и освещении белым светом.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что цвет окрашенного света обеспечивает меру присутствия или количества упомянутого одного или более аналитов.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при детектировании осуществляют измерение интенсивности рассеянного света в качестве меры концентрации одного или более аналитов.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что при детектировании определяют цветовые характеристики рассеянного света в качестве меры концентрации одного или более аналитов.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутая частица имеет состав, подходящий для создания специфически окрашенного света при наблюдении упомянутым человеческим глазом и при освещении белым светом.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что частицы соединяются с аналитом, зафиксированным на твердой фазе.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что частицы находятся в жидкой фазе при детектировании.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что аналит связан с твердой фазой.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что аналит находится в свободном состоянии в жидком растворе.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что образец является микроматрицей или элементом матрицы, содержащим дискретные участки, каждый из которых содержит упомянутый один или более аналитов.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют свет, представляющий собой немонохроматический белый свет.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что для обеспечения света используется монохроматический источник светового освещения.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют множество различных частиц, каждая из которых имеет различное видимое проявление при наблюдении человеческим глазом.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что частицы используются в гомогенном анализе, при этом две или более частиц помещают достаточно близко друг к другу так, чтобы свойство светорассеяния любой частицы изменилось, а изменение является мерой присутствия упомянутого одного или более аналитов.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что частицы используются в анализе, при этом две или более частиц помещают достаточно близко друг к другу так, чтобы свойства светорассеяния двух или более частиц могли быть различимы от единичных частиц, а рассеяние света является мерой присутствия упомянутого одного или более аналитов.

17. Способ по п.1, отличающийся тем, что частицы используют в гомогенном анализе, при этом две или более частиц помещают достаточно близко друг к другу так, чтобы свойства светорассеяния двух или более частиц могли быть различимы от единичных частиц, а рассеяние света является мерой присутствия упомянутого одного или более аналитов.

18. Способ по п.1, отличающийся тем, что частицы используют в гомогенном анализе, при этом две или более частиц, которые держатся вплотную друг к другу, заставляют отделиться так, чтобы свойство светорассеяния любой одной частицы изменилось, а изменение является мерой присутствия упомянутого одного или более аналитов.

19. Способ по п.1, отличающийся тем, что частицы используют в гомогенном анализе, при этом две или более частицы связаны между собой посредством одного или более молекулярного взаимодействия, причем молекулярное взаимодействие, удерживающее частицы между собой, разрывается так, чтобы одна или более частиц были высвобождены от молекулярного взаимодействия, при этом высвобождение является мерой присутствия упомянутого одного или более аналитов.

20. Способ по п.1, отличающийся тем, что частица является золотой или серебряной частицей.

21. Способ по п.1, отличающийся тем, что частица имеет размер в диапазоне 1-500 нм включительно.

22. Способ по п.1, отличающийся тем, что свет направляют к частице призмой или другой светонаправляющей системой.

23. Популяция светорассеивающих частиц для детектирования одного или более аналитов в образце, сформированных по меньшей мере из одного светорассеивающего материала, отличающаяся тем, что упомянутая популяция содержит множество частиц, каждая из которых содержит по меньшей мере 0,1 вес.% материала, выбранного из группы, состоящей из металла, соединения металла, оксида металла, полупроводника и сверхпроводника, причем каждая частица содержит на своей поверхности по меньшей мере один покрывающий слой для обеспечения химической стабильности и способности упомянутой частицы связываться с одним или более аналитов, при этом упомянутая популяция частиц адаптирована к требуемой однородности размеров так, что одно или более свойств светорассеяния отдельных частиц в популяции подобны от частицы к частице.

24. Популяция по п.23, отличающаяся тем, что частицы имеют смешанный состав.

25. Популяция по п.23, отличающаяся тем, что частицы имеют покрытие, выбранное из группы, состоящей из полимера, неорганического материала, органического материала, материала протеиназы, материала базовой молекулы связующего агента.

26. Популяция по п.23, отличающаяся тем, что упомянутые частицы имеют сферическую форму.

27. Популяция по п.26, отличающаяся тем, что частицы имеют овальную или эллипсоидальную форму.

28. Популяция по п.27, отличающаяся тем, что частицы асимметричны.

29. Популяция по п.23, отличающаяся тем, что частицы имеют распределение размеров с коэффициентом вариации менее 5%.

30. Популяция по п.23, отличающаяся тем, что частицы имеют распределение размеров с коэффициентом вариации менее 10%.

31. Популяция по п.23, отличающаяся тем, что частицы имеют распределение размеров с коэффициентом вариации менее 15%.

32. Популяция по п.23, отличающаяся тем, что частицы содержат золото.

33. Популяция по п.23, частицы имеют смешанный состав из золота и серебра.

34. Популяция по п.23, отличающаяся тем, что частицы содержат серебро и магнитный или сегнетоэлектрический материал.

35. Популяция по п.23, отличающаяся тем, что частицы содержат золото и магнитный или сегнетоэлектрический материал.

36. Популяция по п.23, отличающаяся тем, что частицы содержат смесь металлоподобных материалов и магнитного или сегнетоэлектрического материала.

37. Популяция по п.23, отличающаяся тем, что частицы составляются из золота с поверхностным покрытием, выбранным из группы, состоящей из полимера, протеина, нуклеинокислотного неорганического соединения и органического соединения, материала базовой молекулы, связующего агента, и в которой упомянутые частицы имеют диаметр 10-50 нм включительно и производят зеленый рассеянный свет при освещении белым светом.

38. Популяция по п.23, отличающаяся тем, что частицы составляются из золота с поверхностным покрытием, выбранным из группы, состоящей из полимера, протеина, неорганического соединения и органического соединения, материала базовой молекулы, связующего агента, причем частицы имеют диаметр 50-70 нм включительно и производят рассеянный свет от желто-зеленого до желтого цвета при освещении белым светом.

39. Популяция по п.23, отличающаяся тем, что частицы составляются из золота с поверхностным покрытием, выбранным из группы, состоящей из полимера, протеина, неорганического соединения и органического соединения, материала базовой молекулы, связующего агента, и в которой упомянутые частицы имеют диаметр приблизительно 70-120 нм, и производят рассеянный свет от оранжевого до оранжево-красного цвета при освещении белым светом.

40. Популяция по п.23, отличающаяся тем, что частицы составляются из золота с поверхностным покрытием, выбранным из группы, состоящей из полимера, протеина, неорганического соединения и органического соединения, материала базовой молекулы, связующего агента, причем частицы имеют диаметр более 120 нм и менее 1 мкм и производят рассеянный свет от оранжевого до оранжево-красного цвета при освещении белым светом.

41. Популяция по п.23, отличающаяся тем, что частицы составляются из серебра с поверхностным покрытием, выбранным из группы, состоящей из полимера, протеина, неорганического соединения и органического соединения, материала базовой молекулы, связующего агента, и в которой упомянутые частицы имеют диаметр 5-50 нм и производят рассеянный свет синего цвета при освещении белым светом.

42. Светорассеивающий реагент, содержащий буферный раствор, одну или более популяций частиц из светорассеивающего материала по п.23, имеющих диаметр 1-500 нм, отличающийся тем, что содержит связующий агент, способный связываться с аналитом, а покрывающий слой на поверхности частицы содержит базовую молекулу, адаптированную для связи с поверхностью частицы из светорассеивающего материала и для связи со связующим агентом.

43. Реагент по п.42, отличающийся тем, что покрытие выбрано из группы, состоящей из полимера, неорганического материала, органического материала, материала протеиназы, материала базовой молекулы, связующего агента.

44. Реагент по п.42, отличающийся тем, что упомянутые частицы имеют сферическую форму.

45. Реагент по п.42, отличающийся тем, что частицы овальные или эллипсоидальные.

46. Реагент по п.45, отличающийся тем, что частицы асимметричны.

47. Реагент по п.42, отличающийся тем, что частицы имеют распределение размеров с коэффициентом вариации менее 5%.

48. Реагент по п.42, отличающийся тем, что частицы имеют распределение размеров с коэффициентом вариации менее 10%.

49. Реагент по п.42, отличающийся тем, что частицы имеют распределение размеров с коэффициентом вариации менее 15%.

50. Устройство для анализа твердофазного образца, содержащее источник света для освещения твердофазного образца, который содержит один или более аналитов и одну или более светорассеивающих частиц, отличающееся тем, что свет, рассеянный от одной или более частиц, может быть обнаружен человеческим глазом с увеличением менее чем в 500 раз и без электронного усиления, причем источник света размещен под таким углом, что свет передается к твердофазному образцу, а свет, отраженный от твердофазного образца, содержащего одну или более частиц, может детектироваться в максимальной степени, детектор для обнаружения света, отраженного от твердофазного образца, при этом источник света и детектор находятся на противоположных сторонах твердофазного образца или детектор размещен под углом к перпендикуляру к поверхности твердофазного образца, который меньше критического угла, при этом источник света и детектор размещены таким образом, чтобы обеспечить снижение обратного отраженного света и осуществить детектирование света, отраженного твердофазным образцом, содержащим один или более аналитов.

51. Устройство по п.50, отличающееся тем, что собирающая линза детектора помещена вне огибающей распределения интенсивности света, рассеянного от образца, в прямом направлении.

52. Устройство по п.50, отличающееся тем, что содержит счетчик частиц, имеющий необходимое программное обеспечение или программно-аппаратные средства, разработанные и установленные для детектирования рассеянного света.

53. Устройство по п.51, отличающееся тем, что собирающая линза размещена, по существу, перпендикулярно поверхности, на которую должен помещаться упомянутый образец.

54. Устройство по п.51, отличающееся тем, что обеспечена возможность анализа микроматрицы, в которой каждый отдельный участок имеет размер от десяти квадратных микрон до одного квадратного миллиметра.

55. Устройство по п.50, отличающееся тем, что твердотельный образец содержит аналит и светорассеивающие частицы.