Фрагмент днк alv 7, кодирующий синтез альфа-амилазы, способ его конструирования и штамм бактерий bacillus suвтilis - продуцент альфа-амилазы

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генетической инженерии. Целью изобретения является повышение термостабильности целевого продукта. Фрагмент ДНК ALV 7 сконструирован на основе фрагмента ДНК, кодирующего структурную час.ть гена а-амилазы B.licheniformis и фрагмента ДНК, содержащего регуляторные элементы а-амилазы B.amyloliquefaciens. Фрагмент ALV 7 кодирует синтез «-амилазы, термостабильность которой достаточна для промышленного применения. Разработан способ конструирования фрагмента ДНК, кодирующего синтез термостабильной а -амилазы клетками Bacillus subtilis. Получен штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-4766, являющийся продуцентом термостабильной а-амилазы. 3 с.п. ф-лы. 2 табл. k

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 15/18

ГОСУДАРСТВЕННЪ|И КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4794136/13 (22) 02,03.90 (46) 07.03.92. Бюл. N 9 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) B.Á. Баев, Д.Г. Попов, M.Н. Орлова, Ю.В.

Йомантас, А.В. Сорокин, Н.Ф. Рябченко, А.П. Болотин, В.А, Народицкая, Ю.И. Козлов, В,Э. Стеркин. А.Я. Стронгин, В,Г, Дебабов и Л.Д; Вольфович (53) 575.224.2:577.2/048(088,8) (56) Молекулярная биология, 1988, т..22, с.

1658. (34) ФРАГМЕНТ ДНК ALV 7, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ АЛЬФА-АМИЛАЗЫ, СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ.

БАКТЕРИЙ ВАС! Ю5 SUBTlLIS — ПРОДУЦЕНТ АЛЬФА-АМИЛАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и, в частности, к генетической инженерии, и представляет собой фрагмент ДНК, кодирующий" синтез термостабильной а-амилазы, способ его конструирования и штамм B.subtilis — продуцент термостабильной а -амилэзы. а -Амилаза — фермент, рэзлагающий амилозную компоненту крахмала, используется в пищевой промышленности для разжижения крахмалсодержащего сырья с целью получения глюкозно-фруктозных сиропов. Кроме того, а-амилэзэ применяется в текстильной промышленности для рас шлихтовки тканей. Эти процессы требуют протекания реакций при высоких темпера„„. Ж„„1717633 А1 (57) Изабретение относится к микробиологической промышленности и генетической инженерии, Целью изобретения является повышение термостабильности целевого продукта, Фрагмент ДНК ALV 7 сконструирован нэ основе фрагмента ДНК, кодирующего структурную часть гена а-амилазы

В.lichenifot mls и фрагмента ДНК, содержащего регуляторные элементы а-амилазы

В,amyioliquefaciens. Фрагмент ALV 7 кодирует синтез а-амилазы, термостэбильность которой достаточна для промышленного применения. Разработан способ конструирования фрагмента ДНК, кодирующегосинтез термостабильной а -амилазы клетками

Bacillus subtilis. Получен штамм Bacillus

subtitis ВКПМ В-4766, являющийся продуцентом термостабильной а-амилазы. 3 с,п. ф-лы. 2 табл. турах (до 105 С), что обуславливает необхоо ° вей димость повышения температуры термоинактивации фермента. Лучшими продуцентами бактериальныx разжижаю- (A) щих а -амилэз являются штаммы Bacillus (д)

amyloliquefaciens или штаммы Bacillus

subtilis, содержащие фрагмент ДНК, коде-, 1 и рующий а -амилазу из Bacillus

amylo.liquefaciens, например штамм В.

subtilis (pRT5).

Однако инактивация этой а-амилвзы происходит уже при 70 С.

Известны штаммы-продуценты а-амилазы; В.subtilis BRB89, В.subtilis ВПВ360 и

В.subtilis BRB361. Штамм В.subtilis BRB89 содержит фрагмент ДНК, кодирующий а1717633 амилазу из Bacillus amyloliquefaciens, и настыла-амилазы В.ticheniformis. Для кажидентичен штамму В.subtilis (pRT5). дого фрагмента ДНК представлена также

В.subtilis BRB360 и В,subtilis BRB361 со- кодируемая им аминокислотная последовадержат плазмиды со слитым геном а-ами- тельность. Последовательности BRB360 и лаза B,amyloliquefaciens — а-амилаза 5 ALV 7 кодируют полноразмерную зрелую

B.lichenlformis и обеспечивают синтез фер- форму термостабильной а-амилазы мента с термостабильностью не хуже термо- В.licheniformis. однако BRB 360 имеет обстабильности фермента из В.licheniformis, ласть стыковки, различаю дуюся на 9 нуклеОднако место стыковки последовательно- отидов (соответственно аминокислоты: стей, кодирующих сигнальный пептиди эре- 10 валин, аспарагин и глицин), в то время как лую форму а -амилазы не является ALV 7 только 3 нуклеотида, соответствуюоптимальным по структуре, поэтому продук- щие аминокислоте аланин. Наличие аланиция термостабильного белка составляет на в месте стыковки наиболее эффективно, лишь 17 Д от продукции мезофильной а- так как эта же аминокислота является лоамилазы (из В.amylollquefaclens) в подо- 15 следнейаминокислотойсигнального пептибной конструкции. Штамм BRB360 да а-амилазы B.licheniformis. рассматривают в качестве аналога по сход- Для достижения цели используют споству в методе конструирования, структуре соб конструирования фрагмента ДНК ALV7, фрагмента ДНК, кодирующего термоста- кодирующего синтез термостабильной абильную а-амилазу, и термостабильности 20 амилазы, заключающийся в том, что ДИК получаемого белка, плазмиды pVS1 гидролизуют эндонуклеазаИзвестен штамм — продуцент а-амила- ми рестрикции EcoRI и Bg8l„достраивают зы с повышенной температурой инактива- однонитевую ДНК до двунитевой Кленовым ции, B котором произведены мутации фрагментомДНКполимеразы1Е.со!1,затем гена а-амилазы В.amylollquefaciens в об- 25 смешивают с EcoRI линкером, имеющим поласт, ответственной за термостабиль- следовательность GGAATTCC, обрабатываность белка, Термостабильность белка ют ДНК-лигазой фага Т4, полученной увеличена на 13 градусов, что.однако на смесью трансформируют клетки В subtilis

7 градусов ниже термостабильности а — известного штамма 21гесЕ4аеу4 трансфор30 манты высевают на среду с эритромицином, Целью изобретения является повыше- иэ полученных трансфор 4антов выделяют ние термостабильности целевого продукта. плаэмидную ДНК и гидролизуют эндонуклеЦель достигается использованием азой рестрикции EcoRI и экзонуклеазой

Baf31, продукты гидролиза обрабатывают

Фрагмент ДНК ALV7 кодирует синтез 35 Кленовым фрагментом ДНК полимеразы 1 термостабильной а -амилазы. Этот Е,со1! и ДНК-лигазой фага Т4, трансформифрагмент получают подстыковкой фраг- Руют клетки В.subtiiis штамма мента ДНК, кодирующего зрелую фор- 21recE4amy4, трансформанты высевают на му й-амилазы Bacillus Ilcheniformis к среду с эритромицином и амилопектиназуфрагменту ДНК, содержащему регу- 40 ром и отбирают клоны, продуцирующиеАляторные элементы (промотор, об- амилазу. Выбор штамма .subt s

В, и iliз ласть связывания с рибосомой) гена 21гесЕ4аву4 в качестве реципиентного а-амилазы в В,amyioliquefaciens и кодиру- . обусловлен тем, что этот штамм имеет мутающему сигнальный и т и нальный пептид а -амилазы цию в хромосомном гене а-амилазы и соотВ.amyloliquefaciens, из плазмиды РЯТ5, 45 ветственно может продуцировать только

Фрагмент ДНК ALV7 кодирует синтез Ю -амилазу, кодируемую рекомбинантной термостабильной а -амилазы и содержит плазмидой. Анализ нуклеотидной последоег ляторные области гена а-амилаэы вательности ДНК полученных плазмид поВ.amyloliquefaclens: промотор (нуклеотиды зволяет выявить плазмиду, сод р щу ежа ю

200 —.270), область связывания с рибосомой 50 фРагмент ДНК со структурой ALV7. Плазми(нуклеотиды 1055 — 1070) и кодирует сигналь- да, содержащая этот фрагмент и сконструиный пептид а-амилазы B.amyloliquefaciens Рованная по предлагаемому способу, (нуклеотиды 1077-1169) и зрелую форму — является плазмидой РО/7. Особенность амилазы Bacillus licheniformis (нуклеотиды фрагмента А1-Ч7 состоит в том, что он коди55 рует оптимизированный синтез термостаФрагмент ДНК А! >7 кодирует сингез бильнойа-амилазы. ПлаэмиднаЯ ДНК Рl Ч7, белка, оптимизированного по структуре об- о У е аЯ ак с особом, содержит пороцессинга сигнального пептида, следовательность ALV7, которая может обладающего структурой и термостабиль- быть изолирована на Н!п4 l фрагменте Д

1717633 и перенесена на любой вектор, имеющий ющей полную зрелую часть а-амилазы . Hindi ll сайт для клонирования фрагментов В.licheniformls к последовательности, кодиДНК и способный рэплицироваться в клет- рующей сигнальный пептид а-амилаэы ках бацилл, B.amyloiiquefaciens.

Для достижения цели используют 5 Известный фрагмент amyamyl nortштамм В.subtilis ВКПМ В-4766-продуцент учен заменой в последовательности ДНК, термостабильной а-амилазы. Штамм пол- кодирующей мезофильную а-амилазу учают трансформацией клеток В.subtilis В.amyioliquefaclens, 128 нуклеотидных ос21гес E4amy4 плазм идой pLV7. татков на гомологичный фрагмент, кодируПолученный штамм депонирован во 10 ющий часть термофильной а-амилазы

Всесоюзной коллекции промышленных В.licheniformis. В результате произведенмикроорганиэмов и имеет регистрацион- ной мутации фрагмент ДНК amyamyllchl ный номер ВКПМ 8-4766. обеспечивает синтез и секрецию а-амиШтамм В.subtills ВКПМ 8-4766характе- лазы с термостабильностью, увеличенриэуется следующими и ризнакэми. 15 ной на 13 градусов, что однако на 7

Морфологические признаки. градусов ниже термостабильности а-амиКлетки прямые, палочковидной формы лазы В,llcheniformis. а-Амилаза, кодируе1,2 — 1,6х2,0х6,0 мкм, подвижные. грэмполо- мая предлагаемым фрагментом ДНК ALV7, жительные, спорообразующие. по своим свойствам (молекулярная масса.

Культуральные признаки. 20 термостабильность, РН-оптимум) не отличаКлетки хорошо растут на простых пита- ется от а -амилазы В.licheniformls. После тельных средах. прогрева культурэльной жидкости штамПри росте на мясо-пептонном агаре, пи- мов, продуцирующиха-амилазу, при 90ОС в тательном агаре "Дифко" колонии шеРохо- течении 45 мин сохраняется 95% амилаэной ватые, круглые, прижаты, серые, край 25 активности при использовании штамма неровный, мУтные, В .subtilis ВКПМ-4766 и только 5% — при

При росте в жидких средах: мясо-пеп- использовании известного В,subtills ВКПМтонном бульоне, L-бульоне образуют ров- 4632. ную интенсивную муть. Выход белка при использовании штамФизиолого-биохимические признаки. 30 ма В.subtilis ВКПМ-4766 такой же как и в

Клетки растут в пределах от 10 до 50 С случае известного В,subtilis ВКПМ-4632— при оптимуме РН от 6,5 до 8,0. 15 мг/л в условиях ферментации по примеру

В качестве источника углерода исполь- 3, зуют многие углеводы, спирты, органиче- Сравнение продуктивностей штамма ские кислоты, в частности: О-глюкозу, 35 В subtiiis BKflM-4766 с аналогом ВЯВ 360

D-фруктозу, глицерин, сахарозу. Хорошо ус- приведено в табл. 1 и 2, Поскольку иэ-эа вэивают крахмал. недоступности аналога не имеется воэможВ качестве источника азота используют ности произвести прямые измерения, сравкэк минеральные соли в эммонийной и нит- нение произведено косвенно, flo ратной форме, так и в органической форме 40 литературным данным, через штаммы в виде пептона, аминокислот. В.subtilis BR889 и В.subtflis (pRT5), являюНитрэты восстанавливают до нитритов; щихся исходными соответственно для

Желатину разжижают. штэммов В.зоЬОИз BR8360 (аналога) и

Устойчивость к антибиотикам.. предлагаемого штамма В.subtilis ВКПМПроявляется устойчивость к эритроми- 45 4766. Щтэммы В.зцЬт1Пз SRB89 и В,subtllls цику, обусловленная наличием плазмиды (РКТ5) содержат фрагменты ДНК, выделенpLV7. ные из В.amyloliquefaclens и обеспечивают

На среде с амилопектиназуром образу- синтез мезофильной Q-амилазы, направляют вокРУг колоний зоны гидролиза.. емои.собственными регуляторными элеменПредлагаемый штамм В.subtiiis ВКПМ 50 тами, поэтому их активность принята эа

8-4766,содеРжащийРекомбинантнУюплаэ- 100% Щтэммы В.знЩПз ВЯВ360 и 8-4766 миду PLV7 О У е УюнаосновефРагмен- содержат фрагменты ДНК, полученные на та АШ7, характеРизУетсЯ более высокой основе фрагментов ДНК иэ соответс-венно термостабильностыю продуцируемой а- штаммов B.subtills BRB89 и B.subtllis амилазы, по сРавнению с известным 55 -(РРТ5)

В.subtlHs ВКПМ 8-4632. Эффект получен за Определение активности а-амилазы счет того, что в предлагаемом фрагменте производятизвестнымспособом. ТемпераДНК ALV7 произведена оптимальная под- турный оптимум для а-амилазы, кодируестыковкапоследовательностиДНК,кодиру- мой фрагментом ДНК А . /7, сОставляет

1717633

10

75-85"С. Меньшая продуктивность штамма, синтезирующего термостабильную а -амилазу связана с меньшей удельной активностью термостабильного белка из

В.iicheniformis. измеренной в неоптимальных условиях (37 С).

Пример 1, Конструирование фрагмента ДНК ALV7, кодирующего синтез термостабильной а -амилазы.

Клетки бактерий В.subtilis (pVS1), содержащие плазмидную ДНК рЧЯ1, выращивают в 10 мл L-бульона (триптон 10 г/л; дрожжевой экстракт 5 г/л; ЙаС! l0 г/л; рН 7,5) с добавлением эоитромицина (0,02 мг/мл) до титра 1х10 кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (5000g, 5 мин, 4 Со) и ресуспендируют в 0,1 мл лизирующего раствора (лизоцим 2 мг/мл; трис-НС! (рН 8,0) 25 мМ; ЭДТА 10 мМ; глюкоза 50 мМ), выдерживают 5 мин при 0 С.

Далее прибавляют 0,2 мл раствора (йаОН

0,2 М; додецилсульфата натрия 1 Д) и перемешивают до просветления лизата. 150 мкл раствора уксуснокислого натрия (рН 4,8) вносят в осветленный лизат, осторожно перемешивают до заметного снижения вязкости !.:створа, выдерживают 1 ч при 4 С и образовавшийся осадок отделяют центрифугированием (1000 g, 5 мин, 4 С). К полученному супернатанту добавляют 2,5 объема охлажденного при -40 С этилового спирта и выдерживают при -40 С. Образовавшийся осадок плазмиднвй ДНК собирают центрифугированием (5000 g, 5 мин, 20 Со} и ресуспендируют в 0,2 мл буфера (10 мМ трис-HCI (ðÍ 8,0), 1 мМ ЭДТА).

ДНК плаэмиды ИЧ51 подвергают гидролизу эндонуклеазами рестрикции Есор! и

Вд1!! в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCi (pH 7;6), 50 мМ йаС!, 10 мМ МдС!г, 1 мМ

2-меркаптоэтанол. "Липкие" концы полученных фрагментов достраивают до доунитевой ДНК Кленовым фрагментом ДНК полимеразы 1 Е.со!! в буфере, содержащем

50 мМ трис НС!(рН 7,5), 10 мМ МдС!г, 10 мМ

ДТТ, 10 мкг/мл АТФ, затем обрабатывают

ДН К-лигазой фага Т4 в буфере, содержащем

50мМ трис HCi(pH 7,5); 10мМ МдС!г, 10 мМ

ДТТ, 10 мкг/мл АТФ, и смесью рекомбинантных молекул трансформируют компетент,ные клетки В.subtilis 21гесЕ4аау4, трансформанты высевают на агариэованную среду LB С эритромицином. ДНК плазмиды, выделенной из клеток-трансформантов, подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции EcoRl, и в буфере, содержащем 20 мМ трис НС((рН 8,1), 12,5 мМ

МдС!г, 125 мМ СаС!г, 0,6 M NaCL 1 мМ

ЭДТА. — экзонуклеазой ВаЬ1. После обработки ДНК Кленовым фрагментом.дНКполимеразы 1 Е.coll и ДНК-лигазой фага Т4, полученной смесью трансформируют клетки В,subtilis 21recE4amy4, трансформанты высевают на среду с эритромицином и амилопектиназуром и отбирают клоны,,йроду-. цирующие а -амилазу. Плазмидную ДНК, выделенную из клеток-трансформайтов проверяют на наличие в бэставе большего

Н!пб!!! фрагмента последовательности

ALV7, Анализ последовательности ДНК проводят методом дидезокситерминаторов

Сэн гера, Пример 2, Получение штамма

В.subtilis ВКПМ В-4766.

Ночную культуру клеток В. s ubtili s

21 гесЕ4аглу4 разводят в 10 раз в 10 мл бульона Спицайэена (КгНР04 18,3 r/ë; КНгРО4

6 г/л; (ИН4)г304 2 г/л; натрий лимоннокислый 1,2 г/л; глюкозы 0,5g„ каэаминовых кислот 0,2 г/л; дрожжевого экстракта 1 г/л;

MgS04 50 мг/л) и культивируют 45 ч при

37 С с аэрацией. 1 мл полученной куаьтуры смешивают с 6 мл бульона Спицайзена и культивируют в тех же услоВиях 1;5ч, К 1 мл полученных компетентных клеток добавляют ДН К плазмидь р! Ч7, инкубируют 30 мин при 37 С беэ встряхивайия,- разводят в два раза средой LB (триптон 10 r/n; дрожжевой экстракт 5r/ë; NàCi 10 r/ë; рН 7,5)с добавлением эритром щина(0,02 мг/мл) и культивируют 30 мин при интеНсивной аэрации при 37 С. Трансформанты высевают на агаризованную-с1 еду1 В с эритромицином (20 мг/мл) и амилопектйназуром (0,15%). Отбор трансформантов производят по наличию зон гидролиза амилопектиназура.

Клетки, получеййые таким образом, несут плаэмиду рЮ7:и являются клетками штамма В.subtitis BKflM В-4766.

Пример 3. Ферментация штамма

ВяЫ!!з ВКПМ В-4766, получение термостабильной а-амилазы и оценка ее термостабильности.

Культуру штамма В.зоЬМИз ВКПМ-4766 засевают петлей: в пробирку со средой LB (триптон 10 г/л; дрожжевой экстракт 5 г/л; йаС! 10 r/л.; pH 7,5) с добавлением эритромицина (20 мг/мл) и выращивают при 37 С в течение йочи при сильной. аэрации. Ночную культуру разводят в 100 раэ средой LB с добавлением мальтозы (до 2 j), СаС!г (до

10 мМ), МдС!г(до 10 мМ) и эритромицина (до

20 мг/мл) в обьеме 250 мл и проводят ферментацию в течении 48 ч при 37ОC в колбах при интенсивной аэрации, По окончании ферментации клетки осаждают центрифугированием(10000д, 15 мин), а в надосадочной жидкости проверяют уровень амилолитической активности по стандарту. Активность

1717633

10 фермента, полученного таким образом, по- точников, таких, например, как а-амилаза вышается до 0,8 ед/мл. В.licheoiformis. что позволяет проводить

Для проверки термостабильности а- гидролиз крахмала при 85 — 95 С без потери амилазы, синтезируемой клетками его активности и при 105 С (при пов .subti is ВКПМ-4766, 100 мкл супернатанта 5 ном давлении) в течение времени, необхоклеток делят на 4 части и прогревают О, 15, димого для разжижения крахмала.

ЗО и 45 мин при 90 С. Затем определяют Полученный положительный эффект активность а -амилазы, для чего образцы предлагаемых изобретений достигается за. инкубируют с ЗОО мкл 1 -ного раствора счет свойств сконструированного фрагменамилопектиназура. 0,03 M AcNa, РН 8,0, 4 10 та ДНК ALV7, кодирующего синтез термомМ CaCIz при 37 С втечение ЗО мин. Затем, стабильной а -амилазы, Предлагаемый раствор разбавляют до 1 3 мл водой, цент- фрагмент ДНК позволяет также конструирорифугируют при 12000 об/мин и проверяют вать штаммы других микроорганизмов. крооптическую плотность супернатанта при ме В.subtilis npo з, продуцирующие термоста600 нм. Она должна быть одинаковой у каж- 15 бильные а-амилазы. дой пробы, что свидетельствует о термоста- Формула из б ормулаизобретения бильности фермента, кодируемого 1. Фрагмент ДНК Al V7, ко и ю ий фрагментом ALV7. т, кодирующий синтез альфа-амилазы, содержащий регуляПредлагаемые изобретения позволяют торн ые зле мен менты гена а-амилазы повысить термостабильностьа-амилаэы. сек- 20 В.amyloliquefaciens . гпу о оие ас епв и структурную часть геретируемой клетками B,subtilis. Термоста- на а-амилазы В.llchenlforml бильность п о и м ь Р дуц Руемого феРмента не ной последовательностью фрагмента ДНК . с еп orm s с нуклеотидотличается от термостабильности лучших . Al V7. ферментов, выделенных из природных ucgatcatccgcaaagggcgcattcaagtatcagtatcaacaagcggggñàà 50

gcaccccgcataggaaaagactggctgaaaacattgagcctttgatgаct 100

gatgatttggctgaagaagtggatcgattgtttgagaaaagaagaag cc 150

ataaaaataccttgtctgtcatcagacagggtattttttatgctgtcсац 200

actgtccgctgtgtaaaaataaggaataaaggggggttgttattatt11а 250

ctgatatgtaaaatataatttgtataagaaaatgaggtaatgactccаас 300

ttattgatagtgttttatgttcagataatgccegatgactttgtcatgca З50

gctceaecgattttgagaacgacagegacttccgtcecagcegtgccаgg 400

tgetgectcagatteaggttatgcegeteaattcgctgcgtatatcgett 450

getgattacgtgcagcttteccttcaggcgggattcatacageggecaОс 500

catccgtcatceatatcaecacgteaaagggtgacagcaggctcataаga 550

cgccccagcgtcgceatagtgcgttcaccgaatacgtgcgcaacaacсц 600

ettccggagactgteatacgcgtaaaacagceagcgctggcgcgatttag,650

eccegacatagceccactgttcgtceatttcegcgeagacgatgacgссо 700

ctgcccggctgtatgcgcgaggttaccgactgcggcetgagttttttаag 750

tgacgtaaaatcgtgttgaggccaaegeecataatgcgggctgttgcссц 000

gcatccaacgccattcatggccatatcaatgattttctggtgcgtacссиз 850

gttgagaagcggtgtaagtgaactgcaqttgccatgttttacggcaцtga 900

gagcagagatagcgctgatgtccggcggtgcttttgccgttacgcacсac 950

cccgtcagtagctgaacaggngggacagctgatngaancagaagccaсtg 1000 цаусасс1;сааааасасса са асас ааа сау аау ; щспс са t e 1 05 0

accagaaaatgagagggagaggaaacatgattcaaaaacgaaagcggаса 1100

gtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgttatttgtcagtttцсс 1150

gattacaaaaacatcagcggcggcaaatcttaatgggacgctgatgcаgt 1200

1717633

attttgaatggtacatgcccaatgaeggccaacattggaagcgcttgсаа 1250

aacgactcggcatatttggctgaaeacggtattactgccgtctggattсс 1300

cceggcata ааццдаасдацссаацсцда gtgggctaeggtgcttаcg 1350

acctttatgatttaggggagtttcatcaaaaagggacggttcggacааац 1400

tacggcacaaaaggagagctgcaatctgcgatcaaaagtcttcattcссд 1450

cgacattaacgtttacggggatgtggtcatcaaccacaaaggcggcgс д 1500

atgegaccgaagatgtaaccgcggttgaagtegatcccgctgaecgcаac 1550 сдсдсаасс1:садцацаасассцаа11aaagcctggacacatt ttca1t t 1600 т;ссдццдсдсцдсацсаса асадсда 1:11ааа ццса 1:цц асса . «б50

ttgacggaaecgattgggacgagtccegaaagctgaaccgcatcLa ац 1/ОО

tttcaaggaaaggcttgggattgggaagtttccaatgaaaaeggcaaс а 1750

tgattatttgatgtatgecgacategattatgaccateetgatgtegсац 1800 садааа1:Саацада1ддццсас11цд1а цссаа1цаас цсаа11ццас 1850

ggttteegtettgatgctgteaaacaeattaaattttettttttgcgцца «900

ttgggttaateatgteagggaaaaaaeggggaaggaaatgtttaeggtag 1950

etgaatattggcagaatgacttgggegcgctggaaaactatttgaacааа 2000

acaaattttaatcattcagtgtttgacgtgccgcttcattatcagttcca 2050

t. ."gtcàtcgàñàcaggäàggcggctatgatatgaggaaattgctgaaса 2«00

gtacggtcgtttccaagcatccgttgaaagcggttacatttgtcgatаас 2150

catgatacacagccggggcaatcgcttgagtcgactgtccaaacatgцtt 2200

1аацссцс дс11асдс :tttattctcacaagggaatctggataccс с 2250 адц 1 1:с1=асццццаса1ц1асцддасцаааццадасссссацсцсцаа 2300 ат:ссс дсс1:1:цааасасаааа с сцаассда1=с : аааадсцадааааса 2350

gtatgcgtacggagcacagcatgattatttcgaccaccatgacattg сд 2400

gctggacaagggaaggcgacagctcggttgcaaattcaggtttggcg ca 2450

ttaataacagacggacccggtggggcaaagcgaatgtatgtcggccgцса 2500

aaaegccggtgagaeatggcatgacattaccggaaaecgttcggageсцд 2550 ст:цт;са1 саа1: :сццаадцссдцддацад 1йсасц ааасцдсццсфац 2 б 00 ц1 саасс1;а1:ц1 :сааацасадаацадсацадацдасдда cctga 2650 адцааа ссд 11 11 а1111:дсссц1;с 1а1ааа1 1 .с1: 1:ца аса 2700

ttttataat taattttaacaaagtgtcatcagcccteaggaaggacttgc 2750

tgaeagtttgaatcgcataggtaaggcggggatgaaatggcaacgtta1с 2800

tgatgtagcaaagaaagcaaatgtgtcgaaaatgacggtatcgcggg да 2850

tca, 2. Способ конструирования фрагмента

ДНК ALV7, кодирующий синтез альфа-амилазы, эаклЮчающийся в том, что ДНК плаэмиды pVS1 гидролизуют зндонуклеаэами рестрикции EcoRI и 896l, достраивают концы ДНК до двунитевых Кленовым фрагментом ДИК полимеразы 1 Е,соб, смешивают с

EcoRI линкером, имеющим последовательность GGAATTCC, обрабатывают ДНК-лигаэой фага Т4, полученной смесью трансформируют клетки ВлоЫИэ штамма

21 гесЕ4аеу4, трансформанты высевают

55 на среду с эритромицином, из полученных трансформантов выделяют плазмидную

ДНК, гидролиэуют эндонуклеазой рестрикции EcoRI и экзонуклеазой Baf231, продукты гидролиза обрабатывают Кленовым фрагментом ДНК полимераэы 1 Е.соб и

Таблица 1

Таблица 2

Составитель В.Баев

Техред M.Ìîðãåíòàë

Корректор Н.Король

Редактор И.Дербак

Заказ 853 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб;. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

13 1717633 14

ДНК-лигазой фага Т4, полученной смесью амилазу, из которых выделяют плазмидную трансформируют клетки B.subtills ДНК, включающую фрагмент ДНК ИМ7.

21recE4amy4, трансформанты высевают на 3. Штамм бактерий Bacillus subtilis среду с эритромицином и амилопектиназу- ВКПМ В-4766-продуцент а- амилазы. ром, отбирают клоны, продуцирующие а