Рекомбинатная плазмидная днк рвgнтrр 3, кодирующая гормон роста крупного рогатого скота, и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент гормона роста крупного рогатого скота

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, генетической инженерии и биотехнологии. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Сконструирована плазмидная ДНК pBGHtrp3, содержащая ген, кодирующий гормон роста крупного рогатого скота (ГР КРС), находящийся под контролем промотора trp-оперона Е.соМ, и фрагмент бактериального 153-элемента, расположенный после гена ГР КРС. Штамм-продуцент получен траснформацией плазмидой pBGHtrp3 штамма Б.соИ ДН1. Наличие в плазмиде фрагмента 133-злемента стабилизирует продуктивность штамма-продуцента и позволяет достичь высокого уровня синтеза целевого продукта, не прп/1бегая к индукции, не менее 50-60 мкг/мл культуры. 2 с.п. ф-лы.•^•^Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 15/18, 1/21

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕДЪСТВУ (21) 4800406/13 (22) 20.11.89 (46) 30.01.92. Бюл. ¹ 4 (71) Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта (72) П.М.Рубцов, B.Ã.Ãîðáóëåâ, П.С,Свердлова, С.Т.Садиев, А,А.Шульга. В.B.×óïååâà.

Б.К.Чернов, Г.Е.Позмогова. Ю.6,Голова, К.Г.Скрябин и А.А.Баев (53) 575.224,2:577.2/048 (088,8) (56) ЕПВ N. 0111814, кл, С 12 N 15/00, 1983.

EBB N 007544, кл. С 12 N 15/00, 1983.

DNA, 1983, v. 2, р, 37 — 45. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДНК PBGHTRP 3. КОДИРУЮЩАЯ ГОРМОН

РОСТА КРУПНОГО РОГАТОТО СКОТА, И

ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI—

Изобретение относится к микробиологической промышленности генетической инженерии и биотехнологии.

Цель изобретения —. повышение выхода целевого продукта, Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pBGHtrp3, кодирующая гормон роста (ГР) крупного рогатого скота (KPC) под контролем промотора trp-оперона

Е.coll и содержащая фрагмент бактериального ISÇ-элемента,. расположенный после гена ГР КРС. Плазмидой трансформирован штамм E.coll DH1. Наличие в плазмиде фрагмента ISÇ-элемента стабилизирует продуктивность штамма продуцента и позволяет достичь высокого уровня синтеза целевого продукта, не прибегая к индукции.

Уровень синтеза ГР KPC составляет около.. Ж „1708847 А1

ПРОДУЦЕНТ ГОРМОНА РОСТА КРУПНОГО

РОГАТОГО СКОТА (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, генетической инженерии и биотехнологии, Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Сконструирована плазмидная

ДНК рВСНтгрЗ, содержащая ген, кодирующий Гормон роста крупного рогатого скота (ГР КРС), находящийся под контролем промотора trp-оперона Е.coll, и фрагмент бактериального ЯЗ-элемента, расположенный после гена ГР KPC. Штамм-продуцент получен траснформацией плазмидой рВОН(грЗ штамма F.coll ДН1. Наличие в плазмиде фрагмента ISÇ-элемента стабилизирует продуктивность штамма-продуцента и позволяет достичь высокого уровня синтеза целевого продукта, не прибегая к индукции, не менее

50-60 мкг/мл культуры. 2 с.п. ф-лы, 20 $ от суммарного белка клетки или 50-60 мкг на 1 мл ночной культуры.

Рекомбинантная плазмида pBGHtrp3 содержит репликон и гены устойчивости к 0 ампициллину и тетрациклину плазмиды ОО

pBr322, промотор trp-оперона E.coli, фраг- фв мент, кодирующий ГР КРС, и фрагмент ISÇэлемента бактерии состоит из следующих элементов:

ЕсоВ-Hind 1И вЂ” фрагмента плаэмиды

pSTH2191 размером 5300 п.о., включающего участок начала репликации, гены устойчивости к ампициллину (bla) и тетрациклину (tet) и промотор trp-оперона Е.coli;

EcoRI — Hind ill — фрагмента, кодирующего ГР КПС, размером 601 п.о.;

Hind III — фрагмента ISÇ элемента размером 916 п.о.

1708847

Размер плазмиды pBGHtrp3 составляет

6819 п.о, Копийность плазмиды около 20 молекул на клетку.

ДНК плазмиды рВОН1грЗ содержитуникальные сайты рестрикции ЕсоИ, Нра!, 5

SmaI, ВагпН 1, SalGI. EcoRV, 2 сайта рестрикции Hind!È и 3 сайта рестрикции Pstl.

Штамм-продуцент ГР КРС получен трансформацией клеток Е.соИ DH1 плаэмидой рВОНтгрЗ, 10

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки прямые палочковидной формы грамотрицательные неспороносные. 15

Культуральные признаки: клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах, При росте на питательной агаре "Дифко" колонии гладкие круглые блестящие серые. Края колоний ровные, 20

При росте в жидких средах YT, LB, M9 образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки: оптимальная температура культивирования

37ОС. оптимум рН от 6,8 до 7,5. В качестве 25

AATTCTATGTTCCCAGCTATGTCTCTATCTGGÒÑTÀÒÒG ÑTÀÀÑG (- () ()

I lI Ill

Vl Vll VI I I (-) () () GATACAAGGGTCGATACAGAGATAGACCAGATAAGCGATTGCGACAAG статтсттсоооссАОСАТСТТСАтсАабты

-) Hind III

IX Х (-) (- )

ААосссооатсгтАсААотАотсысттсы трисНС!, рН 7,5, 5 MM MgCI 5 мМ дитиотейтола (ДТТ), 5 mKCI Y — P-АТР (800

Cl/rnM), 4 ед. полинуклеотидкиназы фага Т4.

Затем добавляют 2 мкл 10 mM раствора не30 меченного ATP и инкубируют еще 30 мин пр» 37 С, Инкубационные смеси объединяют, добавляют 50 ед. ДНК лигазы фага Т4 и инкубируют в течение 12 ч при 4 С. Смесь прогревают 10 мин при 70 С, добавляют

35 5 М раствор NaCI до концентрации 0,1 mM, 50 ед. рестриктазы EcoRI, 50 ед., рестриктазы Hind III и инкубируют при 37ОС 5 ч.

Инкубационную смесь пропускают через колонку с Сефадексом G-50, фракционирую;.

40 злектрофорезом в 8%-ном полиакриаламидном геле, вырезают иэ геля полосу, соответствующую фрагменту размером около

Структура олигонуклеотидов выбрана с таким расчетом, чтобы синтетический фрагмент ДНК имел липкие концы для рестриктаэ EcoRI u Hind lli. Инициирующий

АТС-кодон расположен перед кодоном 1-й аминокислоты зрелого ГР КРС-фенилаланина. В участке, соответствующем кодонам

Glu22-Leu23, предусмотрен сайт рестриктаэы Pvu II, позволяющий сшить синтетический фрагмент ДНК с фрагментом, кодирующим остальную часть молекулы ГР (остатки 24 — 190).

Фосфорилирование и сшивку олигонуклеотидов проводят следующим образом.

5 мкг каждого из 10 олигонуклеотидов инкубируют при 37 С 15 мин в 20 мкл инкубационной смеси, содержащей 50 мМ источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной или нитратной форме, так и органические соединения — пептон, триптон, аминокислоты.

Устойчивость к антибиотикам: проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием плазмиды. Проявляют устойчивость к тетрациклину при концентрации последнего не более 5-7 мг/л.

Продуктивность, Уровень синтеза ГР по данным иммуноферментного анализа составляет 50 — бО мкг на мл ночной культуры.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН

СССР под номером BKMCP-325Д.

ll p и м е р 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рВСН гр3.

А). Конструирование плазмиды

syn/pBR327.

Для получения фрагмента ДНК, кодирующего N-концевую часть ГР КРС (аминокислоты 1-23), используют синтетические олигонуклеотиды, 1708847

75 п.о„и элюируют ДНК из геля, ДНК после переосаждения спиртом растворяют в 120 мкл воды.

5 мкг плазмиды pBR327 гидролизуют рестриктазами EcoRI u Hind !И в инкубационной смеси следующего состава: 50 М трис

HCI, рН 7,5, 10 mM NaCI, 10 гпМ Mg Ciz, 1 яМ

ДДТ, 10 ед. EcoRI и 10 ед. Hind И a течение

2 ч при 37 С. Смесь фракционирую- в 1 jном агарном геле и элюируют линейную форму плазмиды, используя легкоп,:авкую агарозу фирмы BRI. ДНК переосаждают спиртом и растворяют в 50 мкл воды.

Лигирование фрагмента ДНК и плазмиды проводят в смеси объемом 20 мкл, содержащей 1 мкл раствора фрагмента, 1 мкл раствора плазмиды, 20 mM трисНС!, рН 7,5, 10 mM ДТТ;10 mM MgCIz, 1 mM АТР, 5 ед, ДНК лигазы фаза Т4, при 4 С в течение !2 ч. К 12 мкл инкубационной смеси добавляют

48 мкл TE-буфера (50 M трисНС!, рН 8,0, 1

mM ЭДТА). Раствором ДНК трансформи уют клетки штамма Е.col! НВ101. Отбирают клоны по устойчивости к антибиотикам, Вставку с нужной ориентацией определяют секвенированием, В результате отбирают плазмиду, обозначенную зуп/;. BR327.

Б. Конструирование плазмиды pBGHI190.

l0 мкг ДНК плазмиды pb GH16 гидролизуют в инкубационной смеси объемом 50 мкл 30 ед, рестиктазы EcoRI в течение 1,5 ч при 37 С, как описано ранее, ДНК из смеси осаждают спиртом, высушивают и растворяют в воде. Гидролиз линеаризованной плазмиды pBGH18 рестриктазой Pvu II проводят в 100 мкл инкубационной смеси в среднесолевом буфере в течение 10 мин при

37 С. На 10 мкг ДНК берут 30 ед, фермента.

Реакцию останавливают добавлением раствора ЭДТА до концентрации 20 mM. Реакционную смесь экстрагируют равным объемом смеси фенол:хлороформ. ДНК из водной фазы осаждают спиртом, высушивают, растворяют в воде * фракционируют в

1 Д агарозном геле, Нужный фрагмент ДНК (Pvu II — EcoRI — фрагмент размером 680 п,о.) элюируют из легкоплавкой агарозы с помощью стандартной процедуры осаждают спиртом, высушивают и растворяют в воде, 0,5 мкг Pvu II — EcoRI — фрагмента инкубируют в 10 мкл ср днесолевого буфера с

5 ед. рестриктазы Hind III в течение 1 ч при

37 С, ДНК из реакционной смеси осаждают спиртом, высушивают и растворяют в воде.

Для получения вектора из плазмиды

syn/pBR327 4 мкг ДНК гидролизуют в

20 мкл инкубационной смеси на основе среднесолевого буфера, содержащей 15 ед.

Pvu И и 20 ед, Hind !!!, в течение 1,5 ч при

5Г

37 С. Реакционную смесь фракционируют в

17,-ном агарозном геле и вектор элюируют, используя легкоплавкую агарозу. ДН К осаждают спиртом, высушивают и растворяют в воде.

Лигирование Pvu И вЂ” Hind И! — фрагмента к ДНК ГР КРС с Pvu II — Н!пд И!-вектором (syn/pBR327) осуществляют в 20 мкл инкубационной смеси следующего состава:

50 mM трисНС!, рН 7,6, 10 mM MgClz, 5 mM

ДДТ, 0,1 M спермидина, 0,05 mM ЭДТА, 1

mM АТР. Соотношение вектор:вставка (моль) составляло 1:2. Реационную смесь инкубируют с 10 ед. ДН К лигазы фага Т4 в течение ночи при 8 С. Лигаэной смесью трансформируют клетки штамма E.coll

НВ101. Плазмиды иэ полученных клонов анализируют с помощью гидролиза рестриктазами, Правильность структуры подтверждают секвенированием методом

Максима-Гилберта. В результате отбирают плазмиду нужной структуры, обозначенной рВ Н!-190.

B. Конструирование плаэмиды р ВОН Ва 112.

Для удаления 3 -нетранслируемого участка кДНК ГР КРС 10 мкг плазмиды pBGHI190 гидролизуют рестриктазой Bam Н I в

20 мкл инкубационной смеси на основе среднесолевого буфера в течение t ч при

37 С. Линейную форму плазмиды обрабатывают нуклеазой Ва131. Далее проводят обработку полученных ДНК фрагментом

Кленова ДНК полимеразы 1 в присутствии

dNTP и прошивку синтетического Hind IIIлинкера 5 -CCAAGCTTGG-3 . Смесь прогревают 5 мин при 70 С, добавляют 10 ед. рестриктазы EcoRI и 30 ед. рестриктазы

Hind !!! и инкубируют в течение 3 ч при 37 С.

Смесь полученных фрагментов фракционируют в 1 4-ном агарозном геле и выделяют фрагменты длиной 580 — 650 п.о. После переосаждения этанолом ДНК растворяют в 20 мкл воды, 5 мкг плазмиды pV С18 гидролируют рестриктазами EcoBI u Hind И!. К

100 нг pV С18, расщепленной EcoRI u tind !!l, добавляют 5 мкл раствора фрагментов

ДНК, выделенных из агарозы, и проводят инкубацию с ДНК лигазой фага Т4. Лигазной смесью трансформируют штамм ТС1.

Клетки высевают на индикаторные чашки с, Х-gal и ИПТГ, содержащие ампициллин.

Проводят отбор белых колоний. Из пол- . ученных клонов выделяют плазмиды, определяют нуклеотидную последовательность

3 -концевой части кДНК ГР КРС методом

Сэнгера, отбирают плазмиду, содержащую

EcoRI-Hind И! — фрагмент с геном ГР КРС размером 601 п.о.. обозначенную р ВО Н В а112.

1708847

Составитель Т.Забойкина

Редактор А.Долинич Техред М.Моргентал Корректор M.Øàðoøè

Заказ 403 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент"„г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 перед последовательностью, кодирующей гормон роста крупного рогатого скота, раеположена промоторная область триптофанового оперона.

2. Штамм бактерий Escherlchla goal ВКМ

СВ325Д вЂ” продуцент гормона роста крупного рогатого скота.