Способ визуального иммуноферментного анализа биологически активных веществ

 

Изобретение относится к иммунохимии, точнее к способам иммуноферментного определения биологически активных веществ с использованием в качестве маркера ферментных меток. Целью изобретения является количественное определение биологически активных соединений с чувствительностью, достигаемой известными методами ИФА

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s G 01 N 33/535

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1

1,лрщдф

1 1

1р ,ф

)Ю

1 °

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4713466/14 (22) 25.05.89 (46) 07.03.92. Бюл. М 9 (71) МГУ им. М. В. Ломоносова (72) А. П. Осипов, А. M. Егоров, Н. Ф. Казанская, Б. М, Горовиц и М. В. Маненкова (53) 615.373(088.8) (56) J. Immunolog: Methods, 1986, ч. 94, р.

263 — 269. (54) СПОСОБ-ВИЗУАЛЬНОГО IMMYHOФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ (57) Изобретение относится к иммунохимии, точнее к способам иммуноферментного определения биологически активных веществ с использованием в качестве маркера ферментных меток. Целью изобретения является количественное определение биологически активных соединений с чувствительностью, достигаемой известными методами ИФА (10 — 10 M). Цель достигается тем, что пористый носитель в виде полоски фотохимически активируют обработкой диэтилацеталем пазидобензальдегида с последующим облучением ее УФ-светом, интенсивность которого монотонно увеличивают по длине полоски от 0 до 6 10 Дж cM . После кислотного гидролиза на поверхности матрицы образуются альдегидные группы, Степень активации носителя, т,е. количество альдегидных групп на единицу площади, определяется освещенностью соответствующего участка поверхности, При последующей обработке активированной таким образом по„„ Ы„„1718121 А1 верхности раствором специфических антител происходит их ковалентное связывание с альдегидными группами носителя, Поверхностная плотность антител пропорциональна количеству альдегидных групп на поверхности и зависит от расстояния от данного участка до конца полосы или номера зоны. При погружении полоски в анализируемый раствор на поверхности полоски происходит образование иммунохимических комплексов

Аг — Ат, поверхностная концентрация которых различна в разных зонах и определяется концентрацией анализируемого вещества и поверхностной концентрацией иммобилизованных антител. Инкубация с меченными пероксидазой антителами позволяет количественно выявить образовавшиеся иммунокомплексы, Для их визуализации полоски обрабатывает раствором субстратов, в результате чего образуется темно-синий нерастворимый продукт, осаждающийся на носителе в местах локализации ферментной метки. Количество неокрашенных зон уменьшается с возрастанием концентрации определяемого соединения и поэтому число неокрашенных зон (или длина неокрашенного участка полоски) служит показателем концентрации определяемого соединения в растворе. Предложенный метод позволяет проводить визуальный количественный анализ биологически активных веществ с чувствительностью, не уступающей обычным инструментальным методам ИФА с фотометрической системой детекции. 7 табл, 1718121

Изобретение относится к иммунологии, точнее к способам иммуноферментного определения биологически активных веществ с использованием в качестве маркера ферментных меток.

Целью изобретения является определение количественного содержания биологически активного вещества, Указанная цель достигается тем, что в способе визуального иммуноферментного анализа биологически активных веществ, включающем активацию пористого носителя с последующей последовательной его обработкой исследуемым раствором биологически активного соединения, раствором меченных пероксидазой специфических антител и выявление окрашенного продукта ферментативной реакции, активацию проводят путем обработки бензольным раствором диэтилацеталя и-азидобензальдегида (ДАБА) с последующим градуированным монотонно увеличивающимся по длине носителя УФ-облучением до максимальной освещенности 6 10 Дж см, обработкой минеральной кислотой и раствором специфических антител, а количественное выявление биологически активного соединения проводят измерением длины неокрашенного участка носителя.

Способ состоит в том, что пористый материал, например бумагу для хроматографии, нейлон или мембраны в форме полоски, пропитывают бензольным раствором диацеталя и-азидобензальдегида. 3атем подготовленный материал облучают

УФ-светом так, чтобы освещенность полоски увеличивалась по ее длине, и обрабатывают разбавленным водным раствором минеральной кислоты, Активированную полоску погружают сначала в водный раствор специфических антител, затем в раствор анализируемого биологически активного соединения, в раствор специфических антител, меченных пероксидазой, в раствор субстратов и измеряют длину неокрашенного участка полоски, Обработку носителя ведут раствором диэтилацеталя и-азидобензальдегида с концентрацией 20-90 мг/мл. При концентрации меньшей 20 мг/мл интенсивность результирующего окрашивания недостаточна для количественной визуальной детекции, Концентрация выше 90 мг/мл нецелесообразна, так как не приводит к повышению интенсивности окраски.

Освещение по длине полоски ведут градуирован н ым монотон но увеличивающимся по длине носителя количеством освещенности до величины 6 10 Дж см . Для этого может быть использована лампа ДРШ-250 с

55 расстоянием от источника света до облучаемой поверхности 50 см. Последовательно увеличивая время облучения соседних одинаковых по длине участков, получаем полоску с зонами одинаковой длины, различающимися по интенсивности облучения, Под действием света происходит фотохимическая реакция, в результате которой осуществляется ковалентное связывание молекул диэтилацеталя и-азидобензальдегида с поверхностью носителя.

Последующая кислотная обработка приводит к гидролизу ацетальных групп с образованием активных альдегидных групп, Для этой цели может быть использована любая минеральная кислота, например соляная, которая выполняет роль кислотного катализатора при снятии ацетальной защиты. Степень активации носителя, т,е. количество альдегидных групп на единицу площади, определяется освещенностью соответствующего участка поверхности, При последующей обработке активированной таким образом поверхности раствором специфических антител происходит их ковалентное связывание с альдегидными группами носителя, Поверхностная плотность антител пропорциональна количеству альдегидных групп на поверхности и зависит от расстояния от данного участка до конца полосы или номера зоны. Инкубацию ведут 1-2 ч при комнатной температуре.

При погружении полоски в анализируемый раствор на поверхности полоски происходит образование иммунохимических комплексов Аг-Ат, поверхностная концентрация которых различна в разных зонах и определяется концентрацией анализируемого вещества и поверхностной концентрацией иммобилизованных антител.

Инкубация с меченными пероксидазой антителами позволяет количественно выявить образовавшиеся иммунокомплексы, Для их визуализации полоски обрабатывают раствором, диаминобезидина (ДАБ ) и

Н202 в присутствии Со +, в результате чего образуется темно-синий нерастворимый продукт, осаждающийся на носителе в местах локализации ферментной метки.

Количество неокрашенных зон уменьшается с возрастанием концентрации определяемого соединения и поэтому число неокрашенных зон (или длина неокрашенного участка полоски) служит показателем концентрации определяемого соединения в растворе, Таким образом, основными отличительными существенными признаками изобретения является использование для активации поверхности носителя диэтила1718121

45 табл. 1 табл. 1 цеталя и-азидобензальдегида и обработка активированной поверхности специфическими антителами. Использование ДАБА позволяет легко осуществить фотохимическое зарождение на поверхности активных функциональных групп для последующей ковалентной иммобилизации специфических антител. Различная освещенность различных участков поверхности полоски легко достигается варьироварием времени облучения, расстояния до источника света, мощности лампы и изменением других параметров. Так как количество зарождающихся активных групп определяется только одним параметром — освещенностью, то его можно легко регулировать, реально создавая участки с заранее заданным распределением по концентрации альдегидных групп на поверхности матрицы. Распределение активных групп по длине полоски можно устанавливать в зависимости от природы анализируемого объекта и необходимого диапазона измеряемых концентраций, нижней границы определения содержания вещества. В частности, если необходимо получить ответ по принципу "да — нет" (например, в случае анализов на присутствие вирусов, антител, наркотиков, наличие беременности и т.д.), можно в каждом конкретном случае задать такой закон распределения освещенности, согласно которому при окрашивании полоски более некоторой критической длины ответ положительный и наоборот, Возможность легкого варьирования освещенности позволяет добиться регистрируемой визуально четкой границы между окрашенной и неокрашенной зонами.

Дополнительная стадия обработки активированного носителя специфическими антителами позволяет сконцентрировать определяемый антиген, получить более резкую границу окрашенной и неокрашенной зон, а также увеличить интенсивность окраски и значительно уменьшить фон, обусловленный неспецифическим связыванием меченных пероксидазой антител.

Совокупность перечисленных отличительных признаков ранее для решения задачи визуального ИФА не использовалась, и поэтому эти признаки отвечают критерию существенные отличия.

Пример. 1. Бумагу для хроматографии пропитывают раствором и-азидобензальдегидацеталя в бензоле (45 мг/мл). После высушивания бумагу разрезают на полоски и облучают УФ-светом интенсивности 0,5 10

Дж см с в течение 40, 60, 80, 100, 120, 200, 400, 1200 с, что соответствует освещенности каждой полоски 2.10; 3 ° 10; 4.10

5 ° 10; 6 ° 10; 10, 2 10, 6 ° 10 Дж. см

Полоски промывают спиртом, высушивают и инкубируют в 0,01 М HCI 30 мин. Затем их помещают в раствор кроличьих антител против фермента пероксидазы (ПХ) в 0,01 М фосфатном буфере, содержащем 0,14.M

NaCI рН 7,2 (ФБ1), на 1 ч при комнатной температуре или на 12 ч при 4 С. После окончания иммобилизации полоски промывают в 0,1 М Трис-HCI, содержащем 1 M NaCI, 0,5% Тритона Х-100, 0,2% дезоксихолата натрия, рН 9,2 (ТБ1) в течение 1,5 ч (все описанные далее процессы ведут при комнатной температуре) при аккуратном перемешивании. Затем полоски помещают в раствор блокирующего агента (5% БСА в

ФБ1) на 1 ч для снятия неспецифического связывания.

Каждую полоску носителя обрабатывают отдельно растворами, содержащими ПХ в количестве 160, 32, 16, 3,2, 1,6 нг/мл, контроль в ФБ2 (ФБ1, содержащий 0,05% Твина-20) в течение 45 мин.

После отмывания несвязавшегося фермента матрицы помещают в раствор субстратов (0,5 мг/мл ДАБ, 0,02% СО, 0,004%

Н202 в БФ1). Реакцию останавливают промыванием холодной водой через 5 мин, Измеряют. длину HBcKpBLLIBHHol o участка полоски.

В табл. 1 приведена градуировочная зависимость длины неокрашенного участка полоски от концентрации антигена (ПХ) в растворе.

Пример 2. Полоску носителя с иммобилизированными, как в примере 1, антителами к ПХ, помещают в раствор, содержащий неизвестное количество ПХ на 45 мин при комнатной температуре. После отмывания несвязавшегося фермента матрицу обрабатывают раствором субстратов. Реакцию останавливают промыванием холодной водой через 5 мин, Концентрацию ПХ в анализируемом образце определяют после измерения неокрашенного участка полоски и по градуировочной зависимости, приведенной в

Пример 2. Полоску носителя с иммобилизованными, как в примере 1, антителами к ПХ помещают в раствор, содержащий

20 нг/мл, 2 нгlмл ПХ в ФБ2, на 45 мин при комнатной температуре, После отмывания несвязавшегося фермента матрицу обрабатывают раствором субстратов. Реакцию останавливают промыванием холодной водой через 5 мин. Концентрацию ПХ в анализируемом образце определяют после измерения неокрашенного участка полоски и по градуировочной зависимости, приведенной в

1718121

В табл. 2 приведены данные статистической обработки полученных результатов анализа.

Пример 3. Бумагу для хроматографии пропитывают раствором и-азидобензальде- 5 гидацеталя в бензоле (45 мг/мл). После высушивания бумагу разрезают на полоски и

-6 облучают УФ-светом интенсивности 0,5 10

Дж-см с в течение (для разных полосок):

140, 60, 80, 100, 120, 200, 400, 1200,1600, 10

2000, 2400 с, что соответству5ет освещенности каждой зоны 2.10; 3 10 ; 5-10

10 ; 10, 2-10 ; 6 10 ; 8-10, 10, 1,2 ° 10

Дж.см; 2) 40, 60, 80, 100, 120, 200, 400, 12000, 1600, 2000 с; 3) 40, 60, 80, 100, 120, 15

200, 400, 1200, 1600 с; 4) 40, 60, 80, 100, 120, 200, 400, 1200 с; 5) 40, 60, 80, 100, 120, 200, 400 с; 6) 40, 60, 100, 120, 200 с. Полоски промывают спиртом, высушивают и инкубируют в 0,1 М HCI 30 мин. Далее по примеру 20

1, используя пероксидазу в концентрации

1,6 и 32 нг/мл, В табл. 3 приведена зависимость длины неокрашенного участка полоски от концентраций ПХ для разных полосок. Из табл. 3 25 следует, что увеличение освещенности выше 6 10 Дж-см нецелесообразно.

Пример 4. Полоски капроновой мембраны производства экспериментальной лаборатории р/к "Хийу калур" пропитывают 30 растворами и-азидобензальдегидацеталя в бензоле с содержанием реагента 90, 45, 22, 11,5 мг/мл. Облучение матриц, иммобилизацию кроличьих антител против фермента пероксидазы ведут, как в примере 1. Поло- 35 ски помещают в раствор, содержащий ПХ в концентрации 3 2 нг/мл в ФБ2, на 45 мин при комнатной температуре. Далее обработку ведут, как в примере 1, В табл, 4 приведена зависимость длины 40 неокрашенной зоны полосок от концентрации и-азидобензальдегидацеталя. Из данных табл. 4 следует, что увеличение концентрации выше 90 мг/мл и уменьшение ниже 22 мг/мл нецелесообразно. 45

Пример 5, Полоски бумаги для хроматографии, активированной, как в примере 1, помещают в раствор, содержащий

10 М тиреоглобулина(ТГ) в ФБ1, на 1 ч при комнатной температуре или на 12 ч при 4 С. 50

По окончании иммобилизации полоски промывают в ТБ1 в течение 1,5 ч (все описанные далее процессы ведут при комнатной температуре) при аккуратном перемешивании, Затем полоски помещают в раствор блоки- 55 рующего агента (0,50/ желатины в ФБ1) на

1 ч для снятия неспецифического связывания.

Каждую полоску носителя обрабатывают отдельно в течение 1 ч растворами, содержащими антисыворотку к ТГ в разведениях 1:20000; 1:40000; 1:80000; 1;160000;

1:320000 в ФБ2. В контроле содержится неиммунная сыворотка кролика в разведении

1:10000. После промывания полоски помещают в раствор белка А, конъюгированного с ПХ, в концентрации 10 M в ФБ2 на 1 ч.

После промывания полоски помещают в раствор субстратов (0,5 мг/мл ДАБ, 0,02/

Со, 0,004 Н202 в ФБ1), Реакцию останавливают через 5 мин промыванием холодной водой. Измеряют длину неокрашен ного участка полоски.

В табл. 5 приведена зависимость длины неокрашенной зоны полоски от концентрации антител к TI (величины разведения антисыворотки), Пример 6. Полоски мембраны МФЦ(1-4) "Владипор", активированной, как в примере 1, помещают в раствор; содержащий белок А из S. aureus штамм Cowan 1 в

ФБ1 в концентрации 0,5 мг/мл, на 12 ч при

4 С. По окончании иммобилизации полоски промывают 3 раза по 5 мин при периодическом перемешивании в ФБ2. Здесь и далее все обработки проводятся при комнатной температуре, Каждую полоску носителя обрабатывают отдельно в течение 1 ч растворами, содержащими антисыворотку морской свинки к свиному инсулину в разведениях 1:1000, 1, 5000, 1:20000, 1;100000 и 1:500000. B контроле содержится неиммунная сыворотка морской свинки в разведении 1;10.

После промывания полоски помещают в раствор инсулина, конъюгированного с пероксидазой, в концентрации 200 нг/мл в

ФБ2 на 1 ч, После промывания полоски помещают в раствор субстратов, как в примере 5, Реакцию останавливают через 10 мин промыванием водой. Измеряют длину неокрашенного участка полоски.

В табл; 6 дана зависимость длины неокрашенного участка полоски от разведения антисыворотки морской свинки.

Пример 7, Полоски мембраны МФЦ(1-4) "Владипор", активированной, как в примере 1, помещают в раствор, содержащий моноклональные антитела к субъединице хорионического гонадотропина человека в ФБ1 в концентрации 10 М, на 12 ч при

4 С. После окончания иммобилизации полоски промывают 3 раза по 5 мин при периодическом перемешивании в ФБ2. Здесь и далее все обработки проводятся при комнатной температуре, Каждую полоску носителя обрабатывают отдельно в течение 1 ч растворами, содержащими хорионический гонадотропин

1718121

Таблица 1

Таблица 2 человека в концентрациях 4800, 1200, 480, 40,0 ед./л в ФБ2.

После промывания полоски помещают в раствор антител к субъединице хорионического гонадотропина человека, конъюгированного с пероксидазой, в концентрации

10 М в ФБ2 на 1 ч. После промывания полоски помещают в раствор субстратов, как в примере 5. Реакцию останавливают через 10 мин промыванием водой. Измеряют длину неокрашенного участка полоски, В табл. 7 дана зависимость длины неокрашенного участка полоски от концентрации гормона.

Предложенный метод позволяет проводить визуальный количественный анализ биологически активных веществ с чувствительностью, не уступающей обычным инструментальным методам ИФА с фотометрической системой детекции.

В клиниках СССР для цели высокочувствительного ИФА используют инструментальные фотометрические методы, поэтому в качестве базового объекта принят прототип, в отличие от которого обеспечивается визуальное количественное определение.

Метод может найти применение в клинической диагностике, сельском хозяйстве, ветеринарии, охране окружающей среды, биотехнологии и т.д.

5 Формула изобретения

Способ визуального иммуноферметного анализа биологически активных веществ, включающий активацию пористого носителя, его последовательную обработку раство.10 ром биологически активного соединения, раствором меченных пероксидазой специфических антител и выявление окрашенного продукта ферментативной реакции, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью определения

15 количественного содержания биологически активного вещества,. активацию носителя проводят путем его обработки бензольным раствором диэтилацеталя и-азидобензальдегида с последующим облучением градуи20 рованным монотонно увеличивающимся по длине ультрафиолетовым светом до максимальной освещенности 6 10 Дж см и обработкой минеральной кислотой, а количественное определение биологически

25 активного соединения проводят измерением длины неокрашенного участка носителя, 1718121

12

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6

1718121

13

Таблица 7

15

25

35

Составитель П, Бонарцев

ТехРед М.МоРгентал Корректор Н.Ревская

Редактор Л.Волкова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 877 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5