Способ выявления снlамydiа тrасноматiy

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики урогенитальных хламидиозов. Целью изобретения является упрощение способа, повышение эффективности и сокращение сроков изоляции хламидий. Поставленная цель достигается предварительным накоплением возбудителя непосредственно в эпителиальных клетках соскобного материала урогенитального тракта, использованием чувствительной клеточной культуры первично-трипсинизированных клеток фибробластов эмбриона мыши, заражением во взвесь указанной культуры без предварительной обработки. Предлагаемый способ позволяет сократить сроки исследования больных и повысить эффективность диагностики . 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st>s С 12 0 1/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4823490/13 (22) 07.05.90 (46) 30.03,92, Бюл, N 12 (71) Одесский науч но-исследо вател ьский институт вирусологии и эпидемиологии им, И, И. Мечникова (72) М.Н,Лебедюк,, 3. Н. Нехороших, M. В.

Маликова и В. П. сРедчук (53) 576,8,093(088.8) (56) Овчинников Н. M., Беднова В, Н., Делекторский В, В. Диагностика заболеваний, передающихся половым путем, М., 1987, с. 272-274. (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ CHLAMYDIA

TRACHOMATI S (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики

Изобретение от .осится к медицине и может быть использовано для диагностики урогенитальных хламидиозов.

Наиболее достоверным методом диагностического подтверждения хламидиозов у больных является выделение хламидий в культуре чувствител ьн ых клеток.

Однако, почти все возбудители вида С.

trachomatis практически не обладают способностью инфицировать клетки in vitro u размножаться в них в обычных условиях.

В связи с этим для диагностического выделения хламидий используют перевиваемые линии клеток фибробластов мыши 1—

929, Мс Соу, а также клетки человека

Heia-229, которые обрабатывают различными методическими приемами, повышающими чувствительность клеток и усиливающими процессы адсорбции, проникновения и развития хламидий в них. Ы „1723129 A1 урогенитальных хламидиозов. Целью изобретения является упрощение способа, повышение эффективности и сокращение сроков изоляции хламидий. Поставленная. цель достигается предварительным накоплением возбудителя непосредственно в эпителиальных клетках соскобного материала урогенитального тракта, использованием чувствительной клеточной культуры первично-трипсинизированных клеток фибробластов эмбриона мыши, заражением во взвесь указанной культуры без предварительной обработки. Предлагаемый способ позволяет сократить сроки исследования больных и повысить эффективность диагностики. 1 табл. нослоя клеток ДЭАЭ-декстраном, антиметаболитами (циклогексимидом, 5-йод-2 дезоксиуриди нам (ИДУ), облучение. монослоя клеток у или Х лучами, центрифугиро.вание инокулята на монослой, а также сочетание физико-химических воздействий.

Используют чувствительную культуру клеток, адаптированную к среде 199 с 10 сыворотки KPC и выращенную во флаконах или пробирках в течение 24-48 ч.

При обработке ДЭАЭ-декстраном перед заражением клеток среду роста удаляют и вносят 1 мл рабочего раствора ДЭАЭ-декстрана (90 мгк/мл) на 30 мин. Перед заражением монослоя среду, содержащую

ДЭАЭ-декстран, удаляют, Обработанную культуру клеток инфицируют исследуемым материалом по 0,2 мл. Затем пробирки с материалом центрифугируют в горизонтальном роторе (2900 g 1 ч при 30 — 34 С. После

1723129 центрифугирования инокулят удаляют, вно- занными выше методами через 24 ч после сят 1 мл среды следующего состава: среда заражения, а при отрицательных результа199с 5ф, фетальной сыворотки KPC и,0,5 мл тах — через 48 ч. Срок диагностического вы5 -ногораствора глюкозы,атакжеантиби- деления хламидий из исследуемого отики — стрептомицина 200 мкг/мл, нистати- 5 материала от больных составляет 2 — 3 дня, а на 125 мкг/мл, канамицина 100 мкгlмл и процент положительных находок — 63%. инкубируют 48 — 72 ч при 36 С. Этот показатель практически не уступает

В случае использования антиметаболи- таковым, полученным при использовании тов циклогексимид добавляют в среду после трудоемких методов с применением дорогозаражения клеток в концентрации 1 — 2 10 стоящих дефицитных реагентов. мкгlмл, ИДУ обрабатывают суточный моно- Поставленная цель достигается тем, что слой клеток эа 3 дня до инокуляции. Оценку для накопления возбудителя в эпителиальпервичного заражения клеток проводят че- ных клетках соскобного материала больных о рез 3 сут в препаратах монослоя, окрашен- пробы инкубируют в термостате при 36 С в ного по Романовскому-Гимзе (по 15 течение 24 ч. Затем инокулят вносят непособнаружению морфологических структур редственно во взвесь чувствительной перхламидий)и иммунолюминесцентным мета- вично-трипсинизированной культуры дом(по обнаружению хламидийного антиге- клеток фибробластов эмбриона мыши без на), дополнительной обработки.

При использовании указанных методов 20 Пример 1. Исследуемый материал, процент диагностического выделения хла- взятый ложкой Фолькмана со слизистой момидий составляет от 20 до 70, а процесс чеполовык органов больного, помещают во изоляции хламидий продолжается 3 — 5дней, . флакон с 2 мл охлажденной транспортной так как для заражения используют 1-2-су- среды с антибиотиками (среда 199 с 5 сыточную культуру чувствительных клеток, 25 воротки КРС или сахарозо-фосфатный расНедостатками этого метода являются твор рН вЂ” 7,0 — 7,1 с 5 /, той же сыворотки и трудоемкость исследования; необходи- гентамицина 2 мкг/мл). После 3-часовой о мость использования дорогостоящих дефи- экспозиции в холодильнике при+4 С флако0 цитных реагентов и фетальной сыворотки ны помещают в термостат на 24 ч при 36 С, КРС; продолжительный срок исследования 30 Затем исследуемый материал центрифуги(от 3 до 5 дней). руют при 2500 g 10 мин и центрифугат исИзвестен также метод выделения С. пользуют для заражения во .взвесь

trachomatis в чувствительной перевиваемой чувствительных первично-трипсинизироклеточной культуре эпителия эмбриона мы- ванных клеток фибробластов эмбриона мыши (ММС вЂ” Е) при заражении монослоя без 35 ши с последующей инкубацией в термостате о дополнительной обработки клеток, поэво- при 36 С втечение 24 — 48 ч. ляющий сократить сроки изоляции возбуди- Получение первично-трипсинизировантеля до 1 — 2 дней. ных клеток фибробластов эмбриона мыши.

Недостатки этого метода: отсутствие Белых мышей в последние дни беременуказанной культуры клеток в СССР, необхо- 40 ности вскрывают под наркозом, извлекают димость использования дефицитной фе- эмбрионы, освобождают от внутренних ортальной сыворотки КРС, ганов, обезглавливают, отмывают 2-3 раза

Цель изобретения — упрощение спосо- раствором Хенкса с антибиотиками, измельба,. повышение эффективности и сокраще- чают ножницами и трипсинизируют, Трипние срока изоляции хламидий. 45 син удаляют и клетки вносят в среду Поставленная цель достигается за счет следующего состава (среда 199+5 десятипредварительного накопления возбудителя кратного концентрата этой же среды +10 / непосредственно в эпителиальных клетках бычьей сыворотки +гентамицин 2 мгк/мл), соскоба урогенитального тракта, по отно- Полученную взвесь клеток эмбриона мыши шению к которым С. trachomatis обладает 50 разливают в пенициллиновыефлаконы спо5 выраженным тропиэмом и в них происходит кровными стеклами по 1,5-2х10 клеток в 1 размножение возбудителя после заражения мл и сразу же во взвесь клеток вносят центчеловека;использованиячувствительной кле- рифугат соскобного материала после предточной культуры первично-трипсинизирован- варительного накопления возбудителя по ных клеток фибробластов эмбриона мыши; 55 0 1 мл в каждый из 4 флаконов, используезаражения указанной культуры клеток не на мых для исследования одного заражающего монослой, а во взвесь клеток без их предва- материала (пробы). Флаконы с инокулятом рительной обработки, без дополнительной обработки помещают в

Обнаружение морфологических струк- термостат при 36 С на 24 ч, По истечении тур хламидий и их антигена проводят ука- указанного срока покровные стекла с зара1723129 женным монослоем клеток из двух флаконов извлекают, промывают фосфатно-солевым буферным раствором, подсушивают на воздухе и фиксируют одно из них 10 мин в

96 этаноле. а другое — 15 — 20 мин в охлажденном ацетоне для окрашивания по Романовскому-Гимзе и иммунолюминесцентным методом соответственно. Оценку результатов заражения клеток проводят по выявлению морфологических структур хламидий (при окраске по Романовскому-Гимзе) и их антигена (в реакции иммунолюминесценции).

Пример 2. Больной К., 43 лет, история болезни N. 146. Диагноз: хронический уретропростатит хламидийной этиологии.

Для исследования забирают соскобный материал-эпителий слизистой уретры, помещают во флакон с 2 мл транспортной среды и оставляют при +4 С на 3 ч. Затем исследуемый материал делят на 2 части. Одну часть в объеме 1 мл вносят во флакон с ростовой средой и помещают в термостат на 24 ч при .36 С для предварительного накопления возбудителя в эпителиальных клетках взятого соскоба (исследуемого материала), По истечении указанного срока исследуемый материал центрифугируют при

2500g 10 мин и центрифугат по 0,1 мл вносят в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами, содержащие взвесь первичнотрипсинизированных клеток фибробластов эмбриона мыши, приготовленную ех

tempore.

Флаконы с инокулятом инкубируют в термостате при 36 С в течение 24-48 ч, после чего покровные стекла с инфицированным монослоем клеток извлекают. промывают фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБР), подсушивают на воздухе, фиксируют 10 мин в 96 спирте для окраски по Романовскому- Гимзе и 15 мин в холодном ацетоне для окраски люминесцирующими антителами. Другую часть исследуемого материала (без предварительного накопления возбудителя) в объеме 1 мл вносят по 0,2 мл во флаконы с выращенным на покровных стеклах монослоем двухсуточной культуры перевиваемых клеток 1-929, Флаконы с материалом центрифугируют на горизонтальном роторе в течение 1 ч при

5 2400 g для принудительной адсорбции возбудителя на клетках. После этого во флаконы вносят поддерживающую среду и инкубируют в течение 24 — 48 ч. Через 24-48 ч после заражения покровные стекла извле10 кают, фиксируют и окрашивают аналогичным споаобом.

В таблице приведены сравнительные показатели выделения С..trachomatis npu заражении на монослой перевиваемой куль15. туры клеток 1 — 929 и во взвесь первичнотрипсинизированных клеток фибробластов эмбриона мыши.

Как видно из данных таблицы, процент выделения С trachomatis при заражении во

20 взвесь первично-трипсинизированных клеток фибробластов эмбриона мыши после предварительного накопления возбудителя в исследуемом материале был достоверно (Р<0,05) выше по сравнению с методом зара25 жения на монослой перевиваемых клеток

1 — 929 с применением дополнительного центрифугирования, Таким образом, использование исследуемого материала от больных после пред30 варительного накопления для заражения во взвесь первично-трипсиниэированных клеток эмбриона мыши позволяет упростить метод выделения хламидий, повысить эффективность выделения возбудителя и со35 кратить срок исследования.

Формула изобретения

Способ выявления Chlamydia

trachomatis путем соскоба эпителия урогениталий с последующим заражением пол40 ученным материалом клеточной культуры, инкубированием, приготовлением препаратов и их исследованием. о т л и ч.а ю шийся тем, что, с целью повышения эффективности и ускорения способа, полученный материал

45 предварительно выдерживают при 36 С в течение 24 ч, а для заражения используют первично трипсинизированные клетки фибробластов эмбриона мыши, 1723129

Методы выделения возбудителя

Количество наблюдений

Количество наблюдений с полоаительным результатом абс. ь

l9 . 39,5

3-5

35 63,0

2-3

P (0,05

Составитель И.Лебедюк

Техред М.Моргентал Корректор С.Черни

Редактор А.Долинич

Заказ 1043 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Зарашение на монослой перевиваемой культуры клеток 1-929 исследуемым материалом от больных с применением дополнительного центрифугирования.Зарашение во взвесь первично-трипсинизированной культуры клеток фибробластов эмбриона мыши исследуемым материалом после предварительного накопления возбудителя

P/ïî критерию ,Х 2 критерии

Фишера родолжитель» ность исследования, сут