Способ выявления эндоспермовых мутаций кукурузы

 

Использование: биотехнология, сельское хозяйство, селекция и семеноводство. Сущность изобретения: экстрагируют каратиноидный комплекс зерна, измеряют спектр поглощения раствора в области 350- 600 нм, находят значения оптической плотности в максимумах при 445-450 и 368-370 нм и рассчитывают их отношение. По уменьшению рассчитанного отношения у исследуемых форм по сравнению с исходной формой выявляютэндоспермовую мутацию. 1 ил., 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 А 01 Н 1/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4827882/13 (22) 22.05.90 (46) 07.05.92. Бюл. М 17 (71) Днепропетровский государственный университет им, 300-летия воссоединения

Украины с Россией (72) B.Ñ.Ôåäeíêo и В.С,Стружко (53) 631.012.34 (088.8) (56) Палий А.Ф. Генетические аспекты улучшения качества зерна кукурузы. Кишинев:

Штиинца, 1989, с, 23.

Grogan С.D., Blessln С.W., Crop Science, 1986, Vol, 8, hL 6, р. 730-732.

Изобретение относится к биотехноло гии и сельскому хозяйству, в частности к генетическим исследованиям зерновых культур, и может быть использовано в селекционной практике для отбора перспективных форм кукурузы с хозяйственно ценными признаками.

Генетические приемы, используемые в селекционной практике, позволяют улучшать качество зерна кукурузы. Одним из показателей, определяющих биологическую ценность, является содержание и качественный состав каротиноидного комплекса зерна. В связи с этим возникает необходимость разработки способов определения влияния эндоспермовых мутаций на каротиноидный комплекс как показатель качества зерна.

Известный способ выявления эндоапермовых мутаций включает выделение и количественное определение каротина в зерне. При этом степень воздействия мута„„ Ж„„1731105 А1 (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭНДОСПЕРМОВЫХ МУТАЦИЙ КУКУРУЗЫ (57) Использование: биотехнология, сельское хозяйство, селекция и семеноводство.

Сущность изобретения: экстрагируют каратиноидный комплекс зерна, измеряют спектр поглощения раствора в области 350600 нм, находят значения оптической плотности в максимумах при 445 450 и 368 — 370 нм и рассчитывают их отношение. По уменьшению рассчитанного отношения у исследуемых форм по сравнению с исходной формой выявляют эндоспермовую мутацию.

1 ил., 1 табл, ции на исходный генотип выявляют по изменению суммарного содержания каротина.

К недостатку способа следует отнести то, что сравниваемый показатель отражает только количественное накопление каротиноидов и не дает возможности оценить влияние эндоспермовой мутации на качественный состав каротиноидного комплекса.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ, включающий выделение каротиноидного комплекса зерна кукурузы, разделение на основные каротиноидные фракции и определение их относительного содержания.

Согласно способу навеску целого зерна кукурузы (50 г) дважды экстрагируют диэтиловым эфиром для удаления восковой оболочки, высушивают и размалывают. Навеску муки встряхивают со смесью абсолютного этанола, воды и 60 едкого натра в течение

1 31105

10 мин при 50 С. Воздух над образцом удаляют пропусканием газообразного азота, Образец выдерживают при комнатной температуре в темноте 16 ч с последующим встряхиванием при 50 С в течение 10 мин.

Растворитель удаляют центрифугированием. Остаток экстрагируют трижды абсолютным этанолом по Описанной процедуре.

Экстракты объединяют и упаривают до объема 100 мл на роторном испарителе. Затем к смеси добавляют 200 — 300 мл воды и проВОдят Г|олную экстракцию каротиноидов порциями диэтилового эфира по 100 мл. (статочные количества едкого натра удаляют иэ объединенных экстрактов последова,тельным промыванием водой с использованием фенолфталеина для контроля присутствия щелочи в водной фазе. После высушивания над безводным сульфатом натрия диэтиловый эфир удаляют на роторном испарителе, Остаток растворяют в гексане для проведения хроматографии, Для разделения каратиноидных фракций используетсяя хроматографическая колонка, наполненная слоем адсорбента и безводного сульфата натрия. После нанесения каротиноидной смеси на колонку под вакуумом колонка обрабатывается сухим азотом, Основные каротиноидные фракции (каротины, зеиноксантин, криптоксантин, лютеин, зеаксантин, полиоксисоединения) последовательно элюируются из колонки органическим растворителем.

Идентификацию каротиноидных фракций проводят с использованием спектров поглощения, Количественное содержание рассчитывают по величине оптической плотности при аналитических длинах волн, используя известные коэффициенты экстинкции для каждой каротиноидной фракции, Относительное содержание основных каротиноидных фракций определяют как процент от суммарного содержания каротиноидов и используют в качестве показателя для сравнения изменений состава каротиноидного комплекса селекционных образцов кукурузы.

Основными недостатками способа является его длительность и трудоемкость.

Например, исчерпывающее выделение каротиноидов проводится путем экстракции растворителем в течение 64 ч (четыре стадии по 16 ч). Способ включает в себя трудоемкие операции по хроматографическому разделению каротиноидных фракций, необходимость работы с газообразным азотом, вакуумирование образцов, предварительную подготовку образца зерна к анализу, абсолютирование этанола и т.д. Длительная и трудоемкая методика позволяет провести анализ образца за несколько суток, требует большого количество селекционного материала и расхода химических реактивоВ, дефицитных хроматографических сорбентов, 5 что существенно ограничивает практическое использование указанного способа в селекционной практике.

Цель изобретения — упрощение и ускорение способа.

10 Способ осуществляют следующим образом, Проводят экстракцию каротиноидного комплекса смесью ацетон — гексан (1:1 по обьему) из размолотого зерна кукурузы па15 раллельно для исходного и исследуемого образцов, Раствор каротиноидов отделяют фильтрованием. Измеряют спектр поглощения раствора в области 350-600 нм, находят значения оптической плотности в максиму20 мах поглощения при 445-450 и 368 — 370 нм и рассчитывают соотношение оптических плотностей при указанных максимумах в качестве сравнительного показателя. Эндоспермовую мутацию вы я Вляют по

25 уменьшению Величины сраВнительногО показателя по отношению к исходной форме.

На чертеже приведены спектры поглощения каротиноидного комплекса исходной (криВВЯ 1 — +/+) и мутантных криВая 2

30 о2/О2; кривая 3 -- au2/эц2; кривая 4 — о2/о2 эо2/-.à2) форм кукурузы (линия Рl 64А).

Ин ервал значений длин волн 368-370 нм (2.. ) и 445-450; t.;iLi j обоснован эксперимента it*Ho, При этом соотношение оптиЗЬ ческих плотностей ЯвляетсЯ маркерным. признаком для максимумов поглощения при указанных длинах волн.

Отличительными особенностями способа являются анализ по спектру поглощения

40 раствора каротиноидного комплекса зерна и Выявление эндоспермовых мутаций vo соотношению оптических плотностей в максимумах поглощения.

Пример, Проводят экстракцию каро45 тинсидного комплекса из образца размолотого зерна кукурузы (1,5 г) смесью ацетон— гексан(1:1 пообьему)(5мл) втечение 1 ч при комнатной температуре с периодическим перемешиванием. Экстракцию проводят

50 параллельно для исходного и исследуемого образцов. Раствор каротиноидов отделяют фильтрованием. Измеряют спектр поглощения раствора в области 350-600 нм на спектрофотометре Спекорд Ь140 в 1 см кювете, 55 По полученному спектру находят значения оптической плотности в максимумах поглощения 368 — 370 нм (4 ) и 445-450 нм (ilz ) и рассчитывают соотношение оптической плотности при указанных максимумах для. 1731105

Генотип кукурузы З1 И2

W 64А+/+

NI 64А о2/о2

W 64 А su2/зо2

W 64Ао2/о2зи2/su2

Сг 2+/+

Сг 2 wx/wx

Сг 2 о2/о2

Сг 2 о2/о2 wxfwx

NI 155+/+

W 155 о2/о2

И 9 «/+

W 9о2/о2

А 204+/+

А 204 о2/о2

1,30

0,81

0,96

0,98

1,66

1,20

1,03

1,10

1,03

0,63

1,07

0,90

1,35

0,94

1,37

0,62

0,55

0,57

0,9. 6

0,60

0,37

0,2;Я

0,9,D

0,58

1, 1, 4

0,7h

О, 6

О,77

49

48

447

447

449

447

447

447

448

448

446

446

0,58

0,58

0,50

0,36

0,20

0,88

0,92

1,07

0,83

0,71

0,82

368

370 сравнения (02/D1). Результаты определения сравнительного показателя для каротиноидного комплекса зерна кукурузы с эндоспермовыми мутациями типа о2, su 2, wx, о2/о2 su2/su2, о2/о2 wx/лх приведены в таблице (данные статистически достоверны, ошибка измерения не более 5 4).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что предлагаемый способ позволяет выявить эндоспермовые мутации кукурузы различного типа по снижению соотношения D2/В< в с 1eêòpÂõ поглощения каротиноидного комплекса зерна в сравнении с известным, а также определить степень воздействия эндоспермо: ых мутаций на каротиноидный комплекс зерна в зависимости от исходно-о генотипа. Например, для линии W 64А мутация типа о2/о2 сказывает более заметное влияние на каротиноидный комплекс зерна в сравнении с мутациями типа ьц2/su2 или о2/о2

su2/su2.

Результаты приведены в таблице.

Использование предлагаемого способа в сравнении с известным позволит упростить и ускорить проведение отбора путем искл ючения длител ьн ых и трудоемких операций, уменьшить количество анализируемого селекционного материала. При этом исчерпывающая экстракция каротиноидов не является обязательной, так как предлагаемый маркерный признак связан с изменением качественного состава каротиноидов, проявляющимся в спектре поглощения.

5 Предлагаемый способ прост в техничеcKGM исполнении и позволяет существенно повысить интенсификацию селекционной диагностики для выявления сортообразцов кукурузы с хозяйственно ценными приэна10 ками.

Формула изобретения

Способ выявления эндоспермовых мутаций кукурузы, включающий выделение ка15 ратиноидного комплекса зерна, измерение оптических параметров и определение наличия мутаций по изменению оптических параметров исследуемых форм в сравнении с исходной, отл ич а ю,щи йся тем, что, 20 с целью упрощения и ускорения способа, в качестве измеряемого оптического параметра исследуют спектр поглощения раствора каратиноидного комплекса в области

350-600 нм, определяют значения оптиче25 ских плотностей в максимумах поглощения и о наличии мутаций судят по уменьшению отношения эна-;ения оптической плотности в максимуме при 445-450 нм к значению оптической плотноСти в максимуме при

30 368-370 нм.

1,2

4OÎ 4

Составитель В. Феденко

Редактор А. Козориз Техред М.Моргентал Корректор М. Кобылянская

Заказ 1522 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101