Способ получения полисахаридов, обладающих слабительным действием

 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается получения биологически активных веществ из растительного сырья. Цель изобретения - повышение выхода и специфической активности целевого продукта. Способ осуществляется путем промывки естественной смеси двух видов ламинарий (Laminaria saccharina и L. digitata L) 1%-ным раствором соляной кислоты при 30°С в течение 1 ч, экстрагирования сырья 1%-ным раствором оксалата аммония при соотношении сырье - экстрагент 1:20 при 20°С в течение 5 мин при измельчении и перемешивании, мацерирования при 20°С в течение 20 ч с последующим трехкратным экстрагированием при 70°С в течение 30 мин, упаривания экстракта до удельной массы 1,06-1,09, осаждения целевого продукта из полученного экстракта 96%-ным этанолом в соотношении экстракт-этанол 1:3, фильтрации, промывки и сушки целевого продукта. Заявленный способ обеспечивает увеличение выхода целевого продукта в 9,5 раз и повышение специфической активности (по сравнению с контролем активность ламинарида выше на 66,6%, а активность алыината аммония - на 166,6%). 10 табл. Ьо С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

173б502 А1 (я)5 А 61 К 35/80

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4829315/ 4 (22) 28,05.90 (46) 30.05.92, Бюл, N 20 (71) Пятигорский фармацевтический институт (72) В.А, Компанцев, Н,LLI. Кайшева, И.И.

Самокиш, Ю,К, Василенко и T.À. Лысенко (53) 615.32(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

К 589986, кл. А 6 К 35/78, 1978, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИСАХАРИД О В, ОБЛАДАЮЩИХ СЛАБИТЕЛЬНЫМ

ДЕЙСТВИЕМ (57) Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается получения биологически активных веществ из растительного сырья. Цель изобретения— повышение выхода и специфической активности целевого продукта. Способ осуществляется путем промывки естественной смеси

Изобретение относится к фармецевтической промышленности и касается получения биологически активных веществ из растительного сырья.

Наиболее близким по технологии и биологическому — слабительному действию к альгинату аммония является способ получения суммы полисахаридов обволакивающего и мягчительного действия из морской капусты (L, saccharina L.), лежащей в основе получения препарата "Ламинарид". Данный способ заключается в экстракции Laminar!a

saccharina водой при 70 — 90 С в соотношении компонентов 1:30, далее полученный экстракт фильтруют, упаривают до 1/5 nepBoíà÷àëüHorо объема, осаждают целевой продукт равным объемом спирта и выдердвух видов ламинарий (Laminar!a saccharina и Ь. dig!tata 1,) 1%-ным раствором соляной кислоты при 30 С в течение 1 ч, экстрагирования сырья 1 -ным раствором оксалата аммония при соотношении сырье — экстрагент 1:20 при 20 С в течение 5 мин при измельчении и перемешивании, мацерирования при 20 С в течение 20 ч с последующим трехкратным экстрагированием при

70 С в течение 30 мин, упаривания экстракта до удельной массы 1,06 — 1,09, осаждения целевого продукта из полученного экстракта 96%-ным этанолом в соотношении экстракт-этанол 1:3, фильтрации, промывки и сушки целевого продукта. Заявленный способ обеспечивает увеличение выхода целевого продукта в 9,5 раз и повышение специфической активности (по сравнению с контролем активность ламинарида выше на

66,6%, а активность альгината аммония — на

166,6%), 10 табл. живают смесь 2 ч, Выпавший осадок полисахаридов отфильтровывают. Образовавшийся осадок промывают ацетоном, затем

96%-ным спиртом и высушивают. Выход полисахаридов составляет 3,3% к сырью.

Указанный способ характеризуется низким выходом целевого продукта за счет щадящего режима экстракции и недостаточного объема этанола, используемого для обработки экстракта (соотношение экстракт:этанол — 1:1), и низкой биологической активностью.

Цель изобретения — повышение выхода и специфической активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения альгината ам1736502 мония, обладающего слабительным действием, из беломорской ламинарии, представляющего собою естественную смесь двух видов ламинарий (Laminaria saccharina et

1.a min aria dig itata), осуществляют путем промывки сырья 1/-ным раствором соляной кислоты при 30 С в течение 1 ч, экстрагирования сырья 1/-ным раствором оксалата аммония при соотношении сырье;экстрагент 1:20 при 20 С в течение 5 мин, при измельчении и перемешивании, мацерируют при 20 С в течение 20 ч с последующим трехкратным экстрагированием при 70 С в течение 30 мин, упариванием экстракта до удельного веса 1,06 — 1,09, обработкой экстракта 96/-ным этанолом в соотношении экстракт:этанол 1:3, фильтрацией, промывкой и сушкой целевого продукта.

При использовании способа вихревой экстракции в мельэкстракторе одновременно осуществляются два процесса; измельчение и экстракция, причем благодаря наличию двух пар ножей, расположенных горизонтально и под углом 45 к рабочей оси прибора, измельчение сырья осуществляется в двух плоскостях — горизонтальной и под углом 45, в результате чего происходит тонкое измельчение сырья до 5 мм с разрывом клеточных стенок, что способствует дополнительно извлечению целевого продукта из клеточного сока, а следовательно, увеличению выхода продукта (табл. 1), Крометого, предварительная промывка сырья 1 -ным раствором соляной кислоты и использование в качестве экстрагента оксалата аммония способствуют получению чистого альгината аммония, практически беззольного, Наиболее важные свойства альгинатов, которые используются во многих отраслях. следующие; загуститель, стабилизатор. образователь геля и пленки.

Предлагаемый способ увеличивает выход целевого продукта в 9,5 раз для беломорской ламинарии и в 9,4 раза для дальневосточной ламинарии, Анализ полученного альгината аммония проводили качественно с помощью цветных реакций, по величине рН раствора альгината аммония, методом тонкослойной хроматографии (TCX), по реакции выделения аммиака, содержанию общей золы и количественно — методом обратного кислотно-основного титрования, Результаты идентификации альгината аммония, 1. С помощью цветных реакций.

1,1 Реакция Молиша. К 1 мл 0,5/ водного раствора альгината аммония добавляли 2 капли спиртового раствора а-нафтола, затем по стенке пробирки и смеси осторожно приливали 1 мл концентрированной серной кислоты так, чтобы кислота не

5 смешивалась с водным слоем. Появление красно-фиолетового кольца на границе двух слоев указывало на присутствие углеводной группы.

1.2, Нафторезорционовая проба Тол10 ленса.

К 1 мл 0,5 водного раствора альгината аммония добавляли 1 мл 1 /-ного спиртового раствора нефторезорцина и такой же объем концентрированной соляной кислоты, 15 Смесь осторожно нагревали до кипения и кипятили 1 мин, затем охлаждали и взбалтывали с эфиром. Эфирный слой окрашивался в фиолетовый цвет, что свидетельствовало о наличии уроновых кислот.

20 II. По величине рН 0,5/, водного раствора альгината аммония. Определяли потенциометрически: рН раствора составил 7,1.

III. Методы ТСХ.

После кислотного гидролиза альгината

25 аммония (100 С, 8 ч) урановые кислоты разделяли при двукратном хроматографировании на слое, приготовленном из порошка целлюлозы марки MN 300. Система растворителей: изопропанол — пиридин — ледяная

30 уксусная кислота — вода (8;8:1;4). Проявитель — нафторезорцин, Обнаружены 2 пятна с R< = 0,25 и Rg = 0,18, которые в сравнении со "свидетелями" идентифицированы как маннуроновая и гулуроновая кислоты, со35 держащиеся в молекуле альгината аммония.

И, По выделению аммиака.

К 0,2 г альгината аммония добавляют 10 капель 20/,-ного раствора едкого натра, при этом выделяется газообразный аммиак, 40 окрашивающий синюю лакмусовую бумагу в красный цвет.

V. По содержанию общей золы, /,.

Исследуемый альгинат аммония содер45 жит всего 0,04 золы, что свидетельствует о высокой чистоте целевого продукта.

И. Количественное определение альгината аммония проводили методом обратного титрования раствором гидроксида

50 натрия избытка серной кислоты, оставшейся после взаимодействия ее с альгинатом аммония. Содержание альгината аммония составило 87,12 / .

55 Изучена зависимость выхода альгината аммония от ряда технологических параметров (табл. 2 — 7), Зависимость температуры экстракции и выхода альгината аммония представлена в табл. 2.

1736502

20

55

Из табл. 2 видно, что при 20 С обеспечивается наибольший выход альгината аммония, Зависимость частоты перемешивания сырья и выхода альгината аммония представлена в табл, 3.

Из табл, 3 видно, что оптимальной частотой перемешивания сырья является 8000 об/мин, так как при этом обеспечивается максимальный выход альгината аммония.

Зависимость времени перемешивания сырья и выхода альгината аммония представлена в табл. 4, Из табл. 4 следует, что наиболее оптимальной продолжительностью перемешивания сырья является 5 мин, при этом обеспечивается максимальный выход альгината аммония.

Зависимость продолжительности мацерации и выхода альгината аммония представлены в табл. 5, Из табл. 5 следует, что оптимальная продолжительность мацерации составляет

20 ч, так как при этом обеспечивается максимальный выход альгината аммония.

Результаты влияния соотношения сырье:оксалат аммония на выход альгината аммония представлены в табл, 6.

Из табл, 6 следует, что оптимальным соотношением сырье: 1%-ный раствор оксалата аммония является 1;20, так как при этом обеспечивается максимальный выход альгината аммония.

Результаты влияния соотношения экстракт: 96%-ный этанол при осаждении целевого продукта на выход альгината аммония предлагаемым способом представлены в табл. 7.

Из табл, 7 видно, что наиболее полное осаждение целевого продукта (34,15%) происходит при использовании соотношения экстракт: 96%-ный этанол 1;3, Для сравнения изучено влияние различн ых соотношений экстракт: 96%-н ый эта нол на выход ламинарида в способе, принятом за прототип.

Результаты влияния соотношения экстракт: 96%-ный этанол при осаждении целевого продукта на выход ламинарида по способу-прототипу представлены в табл. 8.

Из табл. 8 следует, что в способе-прототипе наиболее оптимальное соотношение экстракт: 96%-ный этанол при осаждении ламинарида 1:3, а при соотношении 1;1 выход ламинарида является низким, Пример 1. К 100 г беломорской водоросли (Laminaria saccharina u L.

digitata) приливают 400 мл 1%-ного раствора соляной кислоты и выдерживают 1 ч при

30 С для освобождения водорослей от растворимых минеральных и органических веществ. Кислый экстракт сливают, Остаток водорослей промывают от следов хлоридионов (до отрицательной качественной реакции с нитратом серебра на хлорид-ион в промывных водах), Далее водоросли помещают в "Мельэкстрактор", приливают 2 л

1%-ного раствора оксалата аммония и перемешивают в приборе при частоте перемешивания 8000 об/мин в течение 5 мин (при этом одновременно с измельчением сырья происходит экстракция оксалатом аммония). Затем продолжают экстрагирование без перемешивания в течение 20 ч при 20 С, после чего смесь нагревают до 70 С и выдерживают при этой температуре 30 мин.

Экстракт (i) фильтруют сначала через марлю, затем — фильтровальную бумагу. И снова к оставшимся водорослям приливают

1%-ный раствор оксалата аммония в объеме

0,5 л, экстрагируют при 70 С в течение 30 мин, экстракт фильтруют через марлю, затем — фильтровальную бумагу, экстракт (ii) соединяют с экстрактом (!), Затем третий раз проводят экстракцию при 70 С в течение 30 мин. Полученный третий экстракт соединяют с первым и вторым. Объединенный экстракт упаривают под вакуумом при

50 С до сиропообразного состояния (удельный вес 1,06 — 1,09). Из экстракта альгинат аммония осаждают 96%-ным этанолом в соотношении экстракт;этанол 1;3, Осадок отделяют фильтрованием через бумажный фильтр ("красная лента"), промывают спиртом, затем эфиром(до получения бесцветного промывного спирта и эфира), сушат на воздухе, Выход альгината аммония составил

34,15%, т.е. 34,15 г из 100 г.сырья.

Целевой продукт — альгинат аммония— из беломорской ламинарии представляет собой порошок бледно-желтого цвета, без запаха, слизистого вкуса. Медленно растворим в воде. Нерастворим в органических растворителях: этанол, бензол, ацетон и др.

Полученный альгинат аммония практически не имеет зольности (0,04%). Продолжительность способа 1 сут.

Пример 2, К 100 г беломорской ламинарии (L. saccharina et L. digitata) приливают 400 мл 1%-ного раствора соляной кислоты и выдерживают 1 ч при 30ОС. Кислый экстракт сливают. Остаток водорослей промывают от следов хлорид-ионов, Далее водоросли помещают в "Мельэкстрактор приливают 1 л 1%-ного раствора оксалата аммония и перемешивают при частоте перемешивания 6000 об/мин в течение 3 мин

Затем продолжают экстрагирование без перемешивания втечение 15ч при 10 С, после

1736502 чего смесь нагревают до 70 С и выдерживают при этой температуре 30 мин. Экстракт (!) фильтруют через марлю, затем через фильтровальную бумагу, К оставшимся водорослям снова приливают 0,5 л 1 -ного 5 раствора оксалата аммония, экстрагируют при 70 С в течение 30 мин, Второй экстракт фильтруют и аналогично проводят третью экстракцию (при 70 С в течение 30 мин), Объединенные экстракты упаривают под 10 вакуумом при 50 С (до удельного веса экстракта 1,06 — 1,09), Из экстракта альгинат аммония осаждают 96 -ным этанолом в соотношении экстракт:этанол 1:3. Осадок фильтруют через бумажный фильтр, промы- 15 вают спиртом, эфиром, сушат на воздухе.

Выход альгината аммония составил

32,74, т.е, 32,74 r из 100 r сырья.

Пример 3. К 100 г беломорской водоросли (L. saccharina et L. digitata) при- 20 ливают 400 мл 1 / -ного раствора кислоты и выдерживают 1 ч при 30 С, Кислый экстракт сливают. Остаток водорослей промывают от следов хлорид-ионов. Далее водоросли помещают в "Мельэкстрактор", приливают 3 л 25

1 -ного раствора оксалата аммония и перемешивают при частоте перемешивания

10000 об/мин в течение 7 мин, затем продолжают экстрагирование без перемешивания в течение 25 ч при 30 С, после чего 30 смесь нагревают до 70 С и выдерживают при этой температуре 30 мин, Экстракт (I) фильтруютчерез марлю, затем — через фильтровальную бумагу, К оставшимся водорослям снова приливают 0,5 л 1%-ного 35 раствора оксалата аммония, экстрагируют при 70 С в течение 30 мин, Второй экстракт фильтруют и аналогично проводят третью экстракцию (при 70 С в течение 30 мин).

Объединенные экстракты упаривают под 40 ва куумом при 50 С (до удел ь ного веса экстракта 1,06 — 1,09). Из экстракта альгинат аммония осаждают 96%-ным этанолом в соотношении экстракт:этанол 1:3. Осадок фильтруют через бумажный фильтр, промы- 45 вают спиртом, эфиром, сушат на воздухе.

Выход альгината аммония составил

34,14, т.е. 34,14 г на 100 г сырья.

Пример 4 (с использованием сырья, использующегося в способе-прототипе). К 50

100 r Laminaria saccharina приливают 400 мл

1/-ного раствора соляной кислоты и далее поступают аналогично примеру 1.

Выход целевого продукта — альгината аммония 31,06, т.е. 31,06 r из 100 г сырья, 55

Пример 5 (способ-прототип). 50 г слоевищ Laminaria saccharina измельчают на частицы размером примерно 0,5 см, помещают в коническую колбу вместимостью

2 л, заливают 1,5 л дистиллированной воды.

Колбу с содержимым нагревают на кипящей водяной бане, при этом температура смеси в колбе составляет 85 С. Далее экстракт фильтруют через бумажный. фильтр, упаривают до 1/5 первоначального объема (примерно 200 мл), осаждают целевой продукт

96%-ным этанолом в соотношении экстракт:этанол 1:1, выдерживают смесь 2 ч.

Осадок фильтруют через бумажный фильтр, затем промывают последовательно ацетоном, 96 -ным этанолом и сушат, Выход полисахаридов составляет 3,3, т.е. 1,65 r из 50 г сырья, Пример 6 (с использованием сырья, использующегося в предлагаемом способе), 50 г слоевищ смеси ламина рий L. saccharina и L. digitata измельчают на частицы размером примерно 0,5 см, далее поступают аналогично примеру 5.

Выход полисахаридов составляет 3,6, т.е, 1,8 г из 50 г сырья.

Изучение острой токсичности anьгината аммония, полученного из водорослей, проведено по методу Кербера на 36 белых мышах массой 30 — 40 г при внутрибрюшинном введении вещества. Согласно методическим рекомендациям Фармакологического комитета МЗ СССР (М., 1985) максимально допустимым количеством жидкости для внутрибрюшинного введения мышам массой 20 — 40 r является 1,0 мл. В этой связи исследуемое вещество вводилось мышам из расчета 1000 мг/кг в объеме 1,0 мл. После одноразового введения за состоянием животных наблюдали14дней. За время наблюдений гибели животных не отмечалось, что позволяет определить для альгината аммония ЯОьо > -1000 мг/кг.

Согласно классификации токсических веществ исследуемое вещество следует отнести к группе малотоксичных веществ, Слабительное действие альгината аммония, полученного из беломорских водорослей, проводилось в сопоставлении с действием официального слабительного препарата ламинарида на белых мышах известными методами, В одном случае о слабительной активности веществ судили по величине пассажа (мм) по кишечнику с использованием метки, Метка осуществлялась путем введения зондом в желудок животного 57, взвеси активированого угля за 20 мин до перорального введения исследуемых веществ в дозе 200 мг/кг в обьеме

0,4 мл физиологического раствора, Животных забивали через 2 ч декапитированием и замеряли степень продвижения метки (активированного угля) вдоль кишечника. В других опытах о слабительном действии исследуемых веществ судили по величине де10

1736502

Таблица 1 фекации животных (массе и консистенции фекалий), помещенных в специально для этих целей клетки, В этом случае ждивотным перорально вводились исследуемые вещества в дозе 200 мг/кг в объеме 0,4 мл физиологического раствора с последующим через 24 ч взвешиванием фекалий (г) и описанием их консистенции. В выборе дозы исследуемых веществ исходили из рекомендаций по применению официального слабильного препарата ламинарида, В контрольных опытах в соответствующем количестве вводился животным физиологический раствор. Результаты опытов обрабатывались методом вариационной статистики.

Как следует из табл. 8, величина пассажа по кишечнику при введении всех исследуемых веществ была выше, чем в контрольн ых опытах (на 44,8 — 50,4%, р < 0,01).

Причем наиболее выраженное увеличение пассажа наблюдалось в случае введения альгината аммония (на 50,4%, р < 0,001), однако достоверного различия по сравнению с эталоном сравнения (ламинаридом) не отмечалось.

Слабительный эффект альгината аммония получил подтверждение в опытах с определением величины дефекации(табл, 9). В этих опытах увеличение массы фекалий под влиянием приема альгинaTG аммония по сравнению с контролем достигало 166,6% (р < 0,001) и статистически достоверно превосходило массу фекалий у животных, получавших ламинарид на 66,6%, Однако у животных, получавших альгинат аммония, фекалии становились кашицеобразными и даже жидкими.

Величина пассажа по кишечнику при введении альгината аммония представлена в табл. 9.

Величина дефекации при введении альгината аммония представлена в табл. 10, Таким образом, полученные результаты экспериментов подтверждают. что исследованный альгинат аммония обладает значительным слабительным действием, превосходящим аналогичный эффект официального слабительного препарата лами5 нарида. По типу своего действия альгинат аммония следует отнести к средствам, вызывающим увеличение объема и разжижение кишечного содержимого, хотя ему свойственно в определенной мере также

10 вызывать усиление перистальтики с увеличением пассажа содержимого по кишечнику, Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение целевого продукта, 15 обладающего выраженным слабильным действием, с высоким выходом, чистотой, с использованием в качестве сырья помимо

Laminaria saccharina u L. digitata.

20 Формула изобретения

Способ получения полисахаридов, обладающих слабительным действием, путем промывки слоевища морской капусты, его

25 экстракции, фильтрации экстракта, осаждения из фильтрата целевого продукта 96%ным этанолом, фильтрации, промывки осадка и его сушки, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и спе30 цифической активности, в качестве сырья используют смесь слоевища Laminaria

saccharina L u L. digitata, промывку сырья осуществляют 1%-ным раствором соляной кислоты, а экстрагируют 1%-ным раствором

35 оксалата аммония при соотношении сырье— экстрагент 1:20 в течение 5 мин, при одновременном измельчении и перемешивании сырья, далее сырье мацерируют в течение

20 ч с последующим двукратным экстраги40 рованием 1%,-ным раствором оксалата аммония при 70 С в течение 30 мин, объединенные экстракты упаривают до удельного веса 1,06 — 1,09. а осаждение этанолом проводят при соотношении сырье—

45 этанол 1:3.

1736502

Таблица 2

20

40

25,21

34,15

33,98

33,91

6000

8000

10000

33,18

34,15

34,14

34,14

Таблица 5

Таблица 6

1:10

1:20

30,75

34,15

34,05

Таблица 7

1:2

1:3

15,61

27,34

34,15

34,11

Таблица 8

Температура экстракции, С

Выход . альгината аммония, Частота перемешивания, об/мин

Выход альгината амMOHAN

Время перемешивания, мин

Выход альгината аммония,, Соотношение сырье:

:1 %-ный раствор

Выход альгината аммония, Соотношение экстракт:96

%-ный этанол .Выход альгината аммония,.

34,03 34,15

Таблица 3

Таблица 4

1736502

Таблица 9

Таблица 10

15

Составитель Н,Кайшева

Редактор M.Áàíäóðà Техред М.Моргентал Корректор Т.Палий

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 1845 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5