Способ определения гонадотропной активности химических соединений

 

Применение: определение гонадотропной активности химических соединений, Сущностьосуществляют отбор моллюсков приморского гребешка в каждый период сперматогенеза, внутримышечно вводят им исследуемое химическое соединение, готовят гистологические препараты из семенников , подсчитывают плотность клеток сперматогенного ряда в ацинусах, по которой судят об активности соединения

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 А 01 К 61/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTKPblTMRM

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4703976/13 (22) 01,06.89 (46) 23.06,92. Бюл. N 23 (71) Институт биологии моря Дальневосточного отделения АН СССР (72) А.А.Вараксин,. Л.А,Масленникова и

Г.С:Вараксина (53) 586(088.8) (56).СэаЬа G. et al. Effect of oestrogenic, . audrogenlc and gestagenlc hormones on the

gawetogenesis. Acta biol. et med. germ,.1979, v,38, ¹ 8, р.1145 — 1148.

Изобретение относится к искусственному разведению и воспроизводству морских организмов — марикультуре, а именно к способам определения гонадотропного влияния химических соединений на морских беспозвоночных, Известно применение половых клеток, зародышей и личинок морских ежей в качестве тест-объекта для оценки влияния фармакологических препаратов, токсичности растворимых фракций нефтепродуктов, солей тяжелых металлов и др, Тестируемый препарат вводят в сосуды с водой, где проводят оплодотворение яйцеклеток морских ежей и где протекает их эмбриональное развитие, Оценка тестируемого препарата ведется на протяжении 2 — 3 сут. (от момента оплодотворения до развития плавающей личинки — плутеуса) путем оплодотворения доли оплодотворенных яйцеклеток, скорости развития эмбрионов и личинок, наличия у них отклонений от нормального развития.

Способ широко используется как у нас. в стране, так и за рубежом, Однако он дает возможность определять действие тестируемого химического соединения на оплодот. Ж 1741687 А1 (54)СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОНАДОТ

РОПНОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ (57) Применение; определение гонадотропной активности химических соединений, Сущность: осуществляют отбор моллюсков приморского гребешка в каждый период сперматогенеза, внутримышечно вводят им исследуемое химическое соединение, готовят гистологические. препараты из семенников, подсчитывают плотность клеток сперматогенного ряда в ацинусах, по которой судят о6 активности соединения. ворение и развитие соматических элементов, но не клеток сперматогенного ряда, Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является морфометрический способ определения действия химических соединений на сперматогенез брюхоногих моллюсков.

Через неделю после инъекции на гистологических препаратах половых желез ь оллюсков определяют изменение доли сперматогенных клеток: сперматоцитов l порядка, сперматоцитов И порядка, сперматид и сперматозоидов по сравнению с контролем. Основным недостатком этого метода является использование в качестве тест-обьекта животных, у которых трудно. а чаще невсзможно выделить-s половом цикле.отдельные периоды сперматогенеза и оценить влияние химических соединений на каждый период развития половых клеток, поскольку процессы пролиферации гониев, созревание сперматоцитов l порядка и сперматоцитов И порядка. формирование сперматид и сперматозоидов протекает одновременно.

1741687

20

30

50

Целью изобретения является .повышение точности оценки избирательного влияния химических соединений на сперматогенез, Для достижения цели в качестве тест- 5 объекта используют половые железы самцов приморского гребешка.

В основе способа лежит явление годовой цикличности сперматогенеза у приморского гребешка.

Для осуществления способа отбор половозрелых приморских гребешков проводят в определенные стадии их полового цикла, Самцов приморского гребешка в период пролиферации сперматогониев (вторая половина сентября — первая половина декабря), созревания сперматоцитов 1 и II порядков (вторая половина декабря — первая половина апреля) или созревания сперматид и сперматозоидов (вторая половина апреля — первая половина мая) берут из природных мест обитания или марикультурных хозяйств и помещают в проточные аэрируемые аквариумы с температурой воды, равной природной, или садки в море. После

2 сут, акклимации животным из опытной группы (10 экземпляров) вводят в аддукторную мышцу 0,1 — 0,5 мл раствора тестируемого химического соединения, а животным контрольной группы (10 экземпляров) такой же объем растворителя. Планирование эксперимента и расчет концентраций тестируемых химических соединений подробно описаны в ряде руководств по фармакологии.

Продолжительность опыта 14 сут. Затем кусочки семенников опытных и контрольных животных фиксируют в жидкости Буэна и готовят из них гистологические препараты по общепринятой методике. Количество и состав сперматогенных клеток в ацинусах просчитывают под микроскопом при увеличении 1000" с помощью окулярной сетки на

500 клеток. Плотность клеток сперматогенного ряда определяют делением суммы просчитанных клеток на число просчетов.

Достоверность различий результатов, полученных в опыте и контроле, определяют с помощью стандартных статических методов.

Способ осуществляют следующим образом.

I. Определение гонадотропного действия химических соединений на пролиферацию сперматогониев (вторая половина сентября — первая половина декабря), П р и и е р 1. Моллюсков отбирают в ноябре в период пролиферации сперматогониев, Животным опытных групп однократно вводят в аддукторную мышцу по 0,1 мл масляного раствора, содержащего или 0;1 мг. эстрадиола дипропионата, или 5 мг тестостерона пропионата, или 2,5 мг прогестерона, а животным контрольных групп — равное количество растворителя и выдерживают в проточных аэрируемых аквариумах две недели. Плотность сперматогониев в ацинусах семенников животных опытных групп, по сравнению с контрольными; достоверно возрастает (в 2,8, 1,9 и 2,6 раз соответственно).

Таким образом, эстрогенные, андрогенные и гестагенные половые стероидные гормоны эстрадиол дипропионат, тестостерон.пропионат и прогестерон обладают гонадотропной активностью. Способ позволяет уточнить, по сравнению с прототипом, характер их гонадотропного действия, а именно выявить их положительную гонадотропную активность по отношению к пролиферации сперматогониев. Одновременное протекание в половой железе других моллюсков (способ-прототип) пролиферации, созревания и формирования сперматогенных клеток приводит к наличию в семеннике этих животных всех типов клеток, что не дает возможности сделать заключение о действии эстрогенных, андрогенных и гес-. тагенных гормонов именно на пролифера-. цию, а не на сперматогенез в целом.

Пример 2. Моллюсков отбирают в октябре в период пролиферации сперматогониев. Животным опытной группы ежедневно на протяжении двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0,2 мл физиологического раствора, содержащего 5 мкг пептидного морфогена гидры пироГлу-ПроПро-Гли-Гли-Сер-Лиз-Вал-Иле-Лей-Фен (ПМГ), а животным контрольной группы — по

0,2 мл физиологического раствора и содержат в проточных аэрируемых аквариумах. В ацинусах животных опытной группы, по сравнению с контрольной. плотность сперматогониев возрастает достоверно (почти в два раза). Таким образом, ПМГ обладает положительной пролиферативной гонадотропной активностью, Пример 3, Моллюсков отбирают в ноябре в период пролиферации сперматогониев. Животным опытной группы ежедневно в течение двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0,2 мл физиологического раствора, содержащего 5 мкг даларгина Тир-Д-Ала-Гли-Фен-fleA-Арг, а животным контрольной группы — по 0,2 мл физиологического раствора. Изменений плотности сперматогониев в ацинусах семенников опытных животных, по сравнению с контрольными, не выявлено. Таким образом, да1741687 ларгин не обладает пролиферативной гонадотропной активностью, Пример 4. Моллюсков отбирают в ноябре в период пролиферации сперматогониев. Животным опытной группы на протяжении двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0,2 мл физиологического раствора, содержащего 10 мкг налоксона — блокатора опиатных рецепторов мю- и дельта-типов, а животным контрольной группы — по 0,2 мл физиологического раствора, Изменений плотности сперматогониев в ацинусах семенников опытных животных, по отношению к контрольным, не

° выявлено, Таким образом, налоксон не обладает пролиферативной гонадотропной активностью.

Пример 5. Моллюсков отбирают во второй половине октября в период пролиферации сперматогониев. Животным опытной группы ежедневно в течение двух недель вводят в аддукторную мышцу по

0,2 мл спиртового раствора, содержащего

50 .мкг индометацина, а животным контральной группы — равное количество растворителя. В ацинусах семенников опытной группы, по сравнению с контрольной, плотность сперматогониев достоверно возрастает (почти s три раза). Таким образом, индометацин обладает пролиферативной гонадотропной активностью.

II. Определение гонадотропного действия химических соединений на созревание сперматогенных клеток (вторая половина декабря — первая половина апреля) Пример 6. Моллюсков отбирают в первой половине апреля в период созревания сперматоцитов II порядка. Животным опытных групп однократно вводят в аддук торную мышцу по 0,2 мл масляного раствора, содержащего или 0,1 мг зстрадиола дипропионата, или 5 мг тестостерона пропионата, или 2,5 мг прогестерона, а животным контрольных групп — равное количество растворителя и выдерживают в проточных азрируемых аквариумах в течение двух недель. Плотность сперматоцитов

I I порядка в ацинусах семенников животных

: опытных групп, по сравнению с контрольн ыми, достоверно увеличивается (во всех случаях почти в два раза). Таким образом, указанные зкстрогенные, андрогенные и гестагенные половые стероидные тормоны обладают сперматоцитогенной гонадотропной активностью. Способ дает возможность определить их влияние не в целом на сперматогенез, а выявить их положительное гонадотропное действие непосредственно на созревание сперматоцитов II

15

25

55 порядка, чего нельзя достигнуть при использовании способа-прототипа.

Пример 7. Моллюсков отбирают во второй половине декабря в период соэрева5 ния спеоматоцитов I порядка, Животным опытной группы ежедневно на протяжении двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0,2 мл физиологического раствора, содержащего 5 мкг ПМГ, а животным контрольной группы — no 0,2 мл фиэлологического раствора, В ацинусах семенников животных опытной группы, по сравнению с контрольной, достоверно возрастает плотность сперматоцитов I порядка начала профазы мейоза. Плотность сперматоцитов конца профазы мейоза не меняется. Таким образом, ПМГ обладает сперматоцитогенной гонадотропной активностью, а именно ускоряет созревание сперматоцитов порядка начала профазы мейоза, Пример 8, Моллюсков отбирают во второй половине января в период созревания сперматоцитов II порядка. Животным опытной группы ежедневно на протяжении двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0;2 мл физиологического раствора, содер>кащего 5 мкг ПМГ, а животным контрольной группы — по 0,2 мл физиологического раствора. В ацинусах семенников животных опытной группы, по сравнению с контрольной, AfloTHocTb сперматоцитов II порядка не меняется. Таким образом, ПМГ не обладает сперматоцитогенной гонадотропной активностью.

Пример 9, Моллюсков отбирают во второй половине января в период созревания сперматоцитов !! порядка. Животным опытной группы ежедневно на протяжении двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0,2 мл физиологического раствора, со- держащего 5 мкг даларгина, а животным контрольной группы — по 0,2 мл физиологического раствора и выдерживают в проточных аэрируемых аквариумах. В ацинусах семенников животных опытной группы, по сравнению с контрольной, плотность сперматоцитов !! порядка йе меняется. Таким образом, даларгин не обладает сперматоцитогенной ганадотропной активностью.

ill, Определение гонадотропного действия химических соединений на формирование сперматид и сперматозоидов (вторая половина апреля — первая половина мая).

Пример 10. Моллюсков отбирают во второй половине апреля в период формирования сперматид. Животным опытных групп однократно вводят по 0,1 мл масляного раствора, содержащего или 0,1 мг эстрадиола дипропионата, или 5 мг тестостерона про1741687 пионата, или 2,5 мг прогестерона, а животным контрольной группы — равное количество растворителя и выдерживают в проточных аэрируемых аквариумах в течение двух недель. Плотность спермэтид в ацинусах семенников животных групп, по сравнению с контрольными, возрастает достоверно во всех случаях. Таким образом, указанные эстрогенные, андрогенные и гестагенные половые стероидные гормоны обладают сперматидоген ной гонадотропной активностью. Способ дает возможность, по сравнению со способом-прототипом, уточнить направленность гонадотропного действия гормонов, а именно выявить их.влияние на формирование сперматид, Пример 11. Моллюсков отбирают во второй половине апреля в период формирования сперматид, Животным опытной группы ежедневно на протяжении двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0,2 мл физиологического раствора, содержащего 25 мкг ПМГ, а животным. контрольной группы— по 0;2 мл физиологического раствора, Изменений плотности сперматид в ацинусах семенников животных опытной группы, по сравнению с контрольной, не обнаружено.

Таким образом, ПМГ не обладает сперматидогенной гонадотропной активностью.

Пример 12. Моллюсков отбирают по второй половине апреля в период созревания спермэтид, Животным опытных групп ежедневно на протяжении двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0,2 мл физиологического раствора, содержащего 5 или

25. мкг даларгина, а животным контрольной группы — по 0,2 мл физиологического раствора и выдерживают их в проточных аэрируемых аквариумах. Плотность сперматид в ацинусах животных опытных групп, flo сравнению с контрольными, не меняется, Таким образом, даларгин не обладает сперматидогенной гонадотропной активностью.

l1 р и м е р 13. Моллюсков отбирают в первой половине мая в период формирования сперматозоидов, Животным опытных групп однократно вводят в аддукторную .мышцу по 0,1 мл масляного раствора, содержащего или 0,1 мг эстрадиола дипропионата, или 5 мг тестостерона пропионата, или

2,5 мг прогестерона, а.животным контрольных групп — равное количество растворителя и выдерживают в проточных аэрируемых аквариумах в течение двух недель. Плотность сперматозоидов в ацинусах семенников животных опытных групп, по сравнению с контрольными, достоверно

- возрастает. Таким образом, эстрадиол дипропионат, тестостерон пропионат и прогестерон обладают сперматозоидогенной

10

15 аквариумах Изменений плотности сперма35

30 гонадотропной активностью, Способ дает возможность, в отличие от способа-прототипа, выявить их положительное гонадотропное действие на формирование сперматозоидов.

Пример 14. Моллюсков отбирают в первой половине мая в период формирования сперматозоидов, Животным опытной группы ежедневно на протяжении двух недель вводят в аддукторную мышцу по 0,2 мл физиологического раствора, содержащего

25 мкг ПМГ, а животным контрольной группы — равное количество растворителя и содер.кат в проточных аэрируем-ых тоэоидов в эцинусах семенников животных опытных групп, по сравнению с контрольными, не обнаружено, Таким образом, ПМГ не обладает сперматозоидогенной гонадотропной активностью, Предлагаемый способ относится к области разработок морфологических методов определения гонэдотропной активности химических соединений. Особенности способа, т.е. возможность дифференцированной оценки изменений пролиферативной активности сперматогониев, генеза сперматоцитов порядка, сперматоцитов ll порядка, сперматид или сперматозоидов после воздействия химических соединений дают возможность проводить проверку химических соединений на наличие у них способности отказывать положительное или отрицательное влияние на развитие различных типов сперматогенных клеток (сперматогониев, или сперматоцитов l порядка, или сперматоцитов ll порядка, или сперматид, или сперматозоидов) и поиски новых химических соединений с такими свойствами.

Способ предлагается использовать .в марикультуре при разработке технологий выращивания двустворчатых моллюсков и других беспозвоночных для обеспечения поиска веществ, избирательно влияющих на развитие половых клеток, Способ может быть использован при оценке избирательного действия загрязнений на развитие половых клеток морских беспозвоночных, поиска и оценки состояния акваторий, используемых для выращивания морских беспозвоночных, Способ может быть использован в медицине для предварительной оценки характера гонэдотропного действия используемых и новых фармакологических препаратов и других химических соединений, Формула изобретения

Способ определения гонадотропной активности химических соединений, предусматривающий отбор моллюсков, 1741687

Составитель А, Вараксин

Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор И. Муска

Редактор T. Иванова

Заказ 2230 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101 внутримышечное введение им исследуемого химического соединения, приготовление гистологических препаратов из семенников моллюсков, подсчет плотности клеток сперматогенного ряда в ацинусах и суждение о гон адат ро и ной а ктив ности исследуемого соединения по плотности клеток, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения точности определения. в качестве моллюсков используют самцов. приморского гре5 бешкэ, а отбор моллюсков проводят в каждый период сперматогенеза,