Способ получения простатической кислой фосфатазы

 

Использование: диагностика рака простаты , ранняя дифференциальная диагностика с использованием иммуноферментного анализа . Сущность изобретения: фракционирование спермоплазмы на фенилсефарозе и хроматографическая очистка фракций. Фракцию с кислой фосфатазой очищают методами аффинной хроматографии и гельпроникающей хроматографией (ГПХ). Фракцию с простатическим специфическим антигеном очищают методом ГПХ. Из 20 мл спермоплазмы получают 2 мг кислой фосфатазы с удельной активностью 800 ед/мг и 1,45 мг простатического специфического антигена . 2 табл.

союз сОВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

С 12 N 9/16

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

« Г "» ь. . 4 : ) o «A,,l

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ д..хйчБОВЬу

I,, %Б ЩОТЕК(К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4777246/13 (22) 05.01.90 (46) 15.07.92. Бюл. N 26 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72) А,В.Соколов, К,М;Ледян, Л.П,Пашинцева, В.В.Светличкин и Л.П.Евсеев (53) 577.15.07 (088.8) (56) Vinko P., Kennuri М., Kerhonen 1,K. Isolation

and oharacterisation of acid phosphatase fron

prostate. — Clinical Chemistry, 1978, М 3, р.

466.-470.

Авторское свидетельство СССР

N. 1576564; кл, С 12 N 9/16, 1988. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ APOCTATN×EСКОЙ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ

Изобретение относится к биологии и медицине и мажет быть использовано преимущественно для диагностики рака простаты, а также для дифференциальной диагностики других заболеваний с использованием иммуноферментного анализа на ранних стадиях заболевания.

Известно получение простатической кислой фосфатазы из ткани простаты, включающее гомогенизированйе ткани с твином . 80; центрифугирование; осаждение сульфатом аммония 30% насыщения, затем по. вторное осаждение центрифугированием; растворение осадка дистиллированной водой, длительный диализ (16 ч) и последующую очистку хроматографией и изоэлектрофокусирование.

Однако конечный продукт получается с низкой удельной: активностью. Процесс получения препарата длителен из-зэ много„„ Ц„„1747488 А1

2 (57) Использование: диагностика рака проста ты, ранняя дифференциальная диагностика с использованием иммуноферментного анализа. Сущность изобретения: фракционирование спермоплазмы на фенилсефарозе и хроматографическая очистка фракций.

Фракцию с кислой фосфатазой очищают методами аффинной хроматографии .и гельпроникающей хроматографией (ГПХ).

Фракцию с простатическим специфическим энтигеном очищают методом ГПХ. Из 20 мл

«! спермоплазмы получатот 2 мг кислой фосфатазы с удельной активностью 800 ед/мг и

1,45 мг простатического спецйфического антигена. 2 табл. кратного переосаждения, центрифугирования и длительного диализа.

Известен также способ получения простатической кислой фосфатазы (далее по тексту ПКФ) из зякулята человека.

Наиболее близким к предлагаемому яв- @ ляется способ получения простатической 4 кислой фосфатазы, включающий выделение Ф из эякулята спермоплазмы центрифугиро- ОО ванием, экстракцию суммарной белковой QQ фракции и ее хронатсграатфическую очистку на фенилсефароае GL-4B с алктциеи снижающимся градиентом сульфата аммония от 1 до 0,1 М, на сефадексе G-200 и на целлюлозе

ДЕ-52 с элюцией возрастающим градиентом хлористого натрия от 0,05 до 1 M.

Недостатками этого способа являются недостаточная экспрессность получения препарата из-за многостадийиой хроматографической очистки, большой расход сырья и реагентов. Кроме того, из одной пробы

1747488 гель-фильтрации на колонке с сефадексом

6-100.

Пример. Берут 20 мл эякулята, Этот объем центрифугируют 15 мин при 1000 g для отделения спермоплазмы от клеточных элементов эякулята. Затем к полученной спермоплазме добавляют сульфат аммония до концентрации 1 M (2,7 г) и проводят гидрофобную хроматографию на колонке с фенилсефарозой GL-4B (pa3Mep колонки 30

100 мм), уравновешенную 1 M (NH4)2SO4 в

0,01 M трис-HCI буфере (рН 7,4). Элюцию белков проводят" ступенчатым градиентом снижающйхся концентраций сульфата аммония в следующем порядке: 1 M — 150 мл;

0,8 M — 100 мл; 0,5 M — 100 мл; 0,4 М вЂ” 300 мл, далее 0 .01 M трис-HCI буфером (рН 7,4).

Скорость элюции — 100 мл/ч, фракции по 15 мл. В этой и последующих хроматографических процедурах полученные фракции анализируют в иммунопреципитационном анализе со специфическим тест-системами для ПКФ и ПСА. Фракции, элюированные

0,4 М (КН } 304, содержащие ПКФ-активностьбыли слиты вместе и сконцентрированы ультрафильтрацией на фильтре УМ-10 (Amicon) до объема 12 мл, Фракции, элюированные 0,01 М трис-H Ci буфером и содержащие ПСА -активность, объединяют и концентрируют, как указано выше, до объема l2 мл, Сконцентрированные материалы подвергают анализу на содержание белка по методу Лоури и полуколичественной оценке на содержание инградиентов (ПКФ и ПСА) в преципитацйонных тест-системах с чувствительностью 3 мкг/мл. Кроме того, на конечном этапе была определена ферментативная активность препарата

ПКФ (данные приведены в таблице), Таким образом, получают две фракции, одна из которых содержит ПКФ-активность, а другая - ПСА-активность. Далее берут одну из фракций, например содер>кащую

ПКФ-активность, диализуютв течение ночи против 0,01 M трис-буфера (рН 7,4). Отдиализованный материал вносят в колонку с голубой сефарозой (размеры колонки 20160 мм), уравновешенную тем.же буфером. Эл юцию проводят 0,01 М трис-HCI буфером (рН

7,4). В этих условиях ПКФ не сорбировали на колонке, Скорость колонки 20 мл/ч, фракции по 15 мл.

ПКФ-активность обнаруживалась во

5 фракциях, не сорбировавшихся на обменнике, Эти фракции объединяют и концентрируют до объема 12 мл, как описано выше, Сконцентрированный материал подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексом 6-150, уравновешенной 0,15 M такого дефицитного сырья получают только один инградиент — ПКФ

Целью изобретения является расширение технических возможностей способа путем одновременного выделения 5 специфического простатического антитела.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу, включающему получение эякулята, выделение из него спермоплазмы, фракционирование на фенилсефарозе GL- 10

4В и пбследующую хроматографическую очистку полученных фракций, после фракциснирования на фенилсефарозе выделяют две фракции, содержащие простатическую кислую фосфатазу и простатический анти- 15 ген, соответственно, и подвергают фракцию, содержащую простатическую кислую фосфатазу хроматографической очистке на голубой сефарозе в 0,01 M трис-HCI буфере, рН 7,4 и на сефадексе G-150, а фракцию, 20 содержащую простатический специфический антиген, подвергают хроматографической очистке последовательно на сефадексах G-150 и G-100.

Способ выполняют следующим обра- 25 зом.

Получают эякулят человека, из которого затем получают спермоплазму путем центрифугирования эякулята. Затем к спермоплазме добавляют сульфат аммония 30 (NH4)2S04) до концентрации 1 М (2,7 г) и проводят гидрофобную хроматографию на колонке с фенилсефарозой GL-4B, Элюцию белков проводят ступенчатым градиентом снижающихся концентраций сульфата ам- 35 мония. Затем фракции, элюированные 0,4 М (МН4)2804 и содержащие ПКФ-активность, -слйвают вместе и концентрируют ультрафильтрацией. Фракции, элюированные 0,01

М трис-HCI буфером и содержащие ПСА-ак- 40 тивность, объединяют и концентрируют ультрафильтрацией. Затем фракцию, содержащую ПКФ-активность, диализуют против 0,01 M трис-буфера и вносят в колонку с голубой сефарозхой, уравновешенную 45 тем же буфером. ПКФ-активность обнаруживалась во фракциях, не сорбировавшихся на обменнике. Эти фракции объединяют и концентрируют. Сконцентрированный материал подвергают гель-фильтрации на ко- 50 ланке с сефадексом 6-150, уравновешенной

0,15 м раствором NaCI в 0,01 M трис-НС1 буфере.

Для дальнейшей очистки ПСА сконцен- . . трированный материал наносят на колонку 5 с сефадексом G-150, подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексом, уравновешенной 0,01 M трис-HCI буфером. Фракции, содержащие ПСА-активность объединяют, концентрируют и повторно подвергают

1747488

Таблица 1 раствором NaCI в 0,01 M трис-HCI буфере (рН 7,4)(размер колонки 25 1100 мм). Скорость элюции составляла 15 мл/ч, фракции по

15 мл. Фракции, содержащие ПКФ, объединяют и концентрируют вышеописанным ме-. 5 тодом, При электрофорезе (ЭФ) в полиакриламидном геле (ППАГ) в присутствии додецилсульфата натрия выявлялась одна белковая полоса, соответствующая по молекулярной 10 массе субъединице ПКФ, что свидетельствует о чистке полученного препарата.

Для дальнейшей очистки фракции, содержащей ПСА-активность, сконцентрированной после гидрофобной хроматографии, 15 материал наносят на колонку с сефадексом

G-150 (размер колонки 20х1100 мм), уравновешенную 0,01 M трис-HCI буфером (рН 7,4), содержащим 0,15 M NaCI и подвергают гель-фильтрации. Элюцию проводят со ско- 20 ростью 15 мл/ч, собирают фракции по 15 мл, Фракции, содержащие ПСА, объединяют, концентрируют до объема 12 мл и повторно подвергают гель-фильтрации на колонке сефадекса G-100. При электрофорезе этого 25 материала в полиакриламидном геле в присутствии S0S выявлялась одна белковая полоса, соответствующая молекулярной массе

-33000 дильтон, что свидетельствует о чистоте полученного препарата ПСА. Аналогич- 30 ным образом фракции с ПСА-активностью объединяют и концентрируют как обычнодо объема 10 мл.

Результаты очистки ПКФ и ПСА приведены в табл.1. 35

Активность кислой фосфатазы на каждой стадии и удельная активность кислой фосфатазы в исходном сырье и после каждой стадии очистки приведены в табл.2, Таким образом, в результате очистки 40 удельная активность ПКФ увеличивается до 800 Е/мг.

Способ определения содержания специфического антигена является полуколичественным с чувствительностью 10 мкг/мл и определение проводится по преципитации с соответствующей антисывороткой (по сравнению с контрольной тест-системой антиген-антитело различных разведений).

Использование изобретения позволяет из одной пробы сырья получить сразу два инградиента ПКФ и ПСА, что значительно сокращает расход сырья, реактивов, а это делает способ очень экономичным, При этом сокращается время на получение инградиентов, Сначала идет очистка всей пробы, а после разделения на две фракции, их очистку можно вести параллельно, кроме того, стадии очистки другие и количество их сокращено. Способ проще по сравнению с известными и эффективнее.

Формула изобретения

Способ получения простатической кислой фосфатазы, включающий получение эякулята, выделение из него спермоплазмы, фракционирование на фенилсефарозе и последующую хроматографическую очистку полученных фракций, отличающийся тем, что, с целью расширения технологиче- ских возможностей способа путем одновременного выделения специфического простатического антигена, после фракционирования на фенилсефарозе выделяют две фракции, содержащие простатическую кислую фосфатазу и простатический специфический антиген Соответственно, и подвергают фракцию, содержащую фосфатазу, хроматографической очистке на голубой сефарозе в 0,01 M трйс-НСГбуфере, рН

7,4, и на сефадексе G-150, а фракцию, содержащую антиген, подвергают хроматографической очистке последовательно на сефадексах G-150 и G-100.

1747488

Продолжение табл. 1

Таблица 2

Составитель .

Редактор T.Ëàçoðåíêo Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор M.Äeì÷èê

Заказ 2473 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101