Способ определения количества гемоглобина крови

 

Использование: ветеринарная гематология . Сущность изобретения: используют раствор соляной кислоты с концентрацией 0,02 - 0,05 н. Добавляют в него кровь в соотношении объемов 1 ; 5 - 20 Определение количества гемоглобина осуществляют кондуктометрически. 4 табл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИ4ЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 А 61 В 10/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4720851/15 (22) 18.07.89 (46) 15,08.92. Бюл. М 30 (71) Всесоюзный научно-исследовательский ветеринарный институт (72) P. Х. Тукшаитов и М. М. Латыпов (56) Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии. M.: Агропромиздат, 1985, с.

53 — 55.

Изобретение относится к ветеринарной гематологии и может .быть использовано при ускоренном определении гемоглобина крови сельскохозяйственных животных как . в условиях специализированных лабораторий, так и непосредственно в хозяйствах.

Известен гемиглобинцианидный метод определения содержания гемоглобина крови, заключающийся в трансформации гемог. лобина в гемиглобинцианид, по интенсивности окраски которого проводится его количественная оценка. В кювету вводится 5 мл трансформирующего раствора, состоящего из ацетонциангидрина, калия железосинеродистого и натрия двууглекислого, и 0,02 мл крови, с последующим 10-минутным выдерживанием этой смеси и измерением ее оптической плотности на фотоэлектроколиметре, которая затем с помощью калибровочной кривой переводится в значение содержания гемоглобина.

Основным недостатком этого метода является длительность определения уровня гемоглобина (не менее 10 мин) и необходимость применения сложного, дорогостоящего и сетевого прибора . фотоэлектроколориметра, требующего к то5U„„1754069 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ГЕМОГЛОБИНА КРОВИ (57) Использование; ветеринарная гематология, Сущность изобретения: используют раствор соляной кислоты с концентрацией

0,02 — 0,05 н. Добавляют в него кровь в соотношении обьемов 1; 5 — 20, Определение количества гемоглобина осуществляют кондуктометрически, 4 табл. му же дополнительного 10-минутного прогрева. Кроме того, необходимсравнительно дорогой набор химреактивов для приготовления трансформирующего раствора, Наиболее близким к предлагаемому является солянокислый гематиновый метод определения количества гемоглобина крови, осуществляемый введением 0,02 мл крови в сосуд с 0,1 н. раствором соляной кислоты объемом, приблизительно равным

1 мл, т. е. в соотношении 1: 50, пятиминутным выдерживанием полученной жидкости и последующим поэтапным добавлением в нее дистиллированной воды до достижения цвета раствора, равным цвету стандарта гемометра.

Недостаток способа — его длительность получения результатов анализа (не менее 7 — 8 мин), небольшая точность и большая трудоемкость.

Многие элементы субьективности обусловлены визуальным определением цвета анализируемого раствора, погрешностью передозировки дистиллята при получении требуемого раствора, нестабильностью во времени цвета стандартного раствора гемоглобина, а также влиянием исскуственно1754069

55 го освещения лабораторных помещений на результаты измерения.

Трудоемкость способа заключается в необходимости поэтапного добавления дистиллята и тщательного визуального контроля достигаемой при этом окраски раствора. В случае образования пены в раствор дополнительно предусматривается введение одной-двух капель серного эфира.

В силу старения стандарта цвета требуется также проводить трудоемкую метрологическую поверку прибора (не реже 1 раз в 6 месяцев).

Цель изобретения — обеспечить ускоренное определение содержания гемоглобина крови с одновременным повышением точности измерения и упрощения способа.

Указанная цель достигается тем, что в известном способе определения количества гемоглобина крови путем измерения концентрации солянокислого гематина, образуемого в растворе соляной кислоты при добавлении в него крови в определенном соотношении и выдерживании во времени, используют раствор соляной кислоты с концентрацией 0,02 — 0,05 н., при этом соотношение объем крови и раствора соляной кислоты выбирают соответственно равным 1: 20 — 1; 5, а определение количества гемоглобина крови осуществляют кондуктометрически.

Чем больше знацоние удельного электросопротивления раствора, тем больше содержание гемоглобина в крови животных.

Описание предлагаемого способа определения количества гемоглобина дается для режима, обеспечивающего наилучшие условия его проведения. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Пипеточным доэатором иа пробирки взяли 0,02 мл свиной крови и поместили в 1 мл пробирку с 0,03 н раствором соляной кислоты, объем которого выбран в 10 раз больше (0,2 мл). Пипетку, не вынимая из раствора кислоты, помыли путем 3-кратного всасывания раствора. По истечении 5 c осуществили забор раствора в микроячейку портативного кондуктомера объемом 50 мкл. Далее выполнили измерение величины удельного.электросапротивления раствора, которое оказалось равным 189 Ом см. По калибровочной кривой находим, что данному значению удельного электросопротивления рас вора соответствует содержание гемоглобина в анализируемой крови в количестве 12,4 7;, На перемешивание пробы крови и 3кратную промывку пипеточного дозатора затрачено 8 с. Время выдержки раствора было 5 с, а на забор раствора в ячейку(объ5

"- 4 емом 50 мкл), измерение его удельного со; противления и определение гемоглобина по".» калибровочной кривой затрачено 5 с. Таким образом, суммарное время анализа 1 пробы крови составило 8 с, Представленные режимы реализации способа определения количества гемоглобина обусловлены необходимостью одновременного обеспечения целого ряда требований, перечень которых приводится ниже в порядке снижения их значимости.

Максимальная чувствительность способа, т. е. на один и тот же прирост показания содержания гемоглобина в крови должен быть получен максимальный прирост изменения удельного электросопротивления раствора солянокислого гематина, минимальное время полного гемолиза эритроцитов; минимальное время полного взаимодействия гемоглобина с раствором соляной кислоты; обеспечение большого соотношения между обьемами крови и раствора соляной кислоты для получения объема анализируемого раствора, достаточного для заполнения измерительной электрической ячейки кондуктомерэ; выбираемое соотношение объемов крови и раствора соляной кислоты одновременно должно быть таким, чтобы можно было использовать промышленные пийеточные дозаторы с заведомо известными фиксированными обьемами; значения удельного электросопротивления раствора солянокислого гематина желательно иметь приближенно в тех же пределах, в которых имеет место значение удельного электросопротивления крови (110 — 280 OM см) с той же целью, чтобы можно было использовать одну и ту же шкалу кондуктометра как для определения количества эритроцитов, так и количества гемоглобина.

Согласно изложенным требованиям для кондуктометрического определения содержания гемоглобина прежде всего необходи-.. мо обеспечение в растворе та кой концентрации солянокислого гематина, чтобы при изменении содержания гемоглобина крови происходило наибольшее изменение удельного сопротивления исследуемого раствора.

Получено, что чувствительность способа определяется не только концентрацией раствора кислоты, но и соотношением объемов крови и раствора соляной кислоты. Согласно данным, представленным в табл. 1, при использовании 0,1, 0,05, 0,03 и 0,02 н растворов соляной кислоты максимальная чувствительность способа, т. е. максимальный прирост электросопротивления достигается при соотношениях смешиваемых

1754069

20

30

40

55 объемов жидкостей, равных соответственно

1:25,1:5,1:10и1:20, При этих оптимальных соотношениях объемов крови и раствора соляной кислоты определено значение оптимальной концентрации соляной кислоты npvi попарном сопоставлении разных ее концентраций (табл.

2). В опытных приняли, что допустимое снижение значения чувствительности способа не должно быть более чем в 1,5 — 1,7 раза.

Исходя из этого условия приемлемое значение концентрации соляной кислоты находится в пределах 0,1 — 0,02 н.

Пригодность этих значений концентрации соляной кислоты подтверждена и с позиции обеспечения высокой скорости гемолиза эритроцитов, полного и быстрого взаимодействия гемоглобина с раствором соляной кислоты (табл. 3) с целью осуществления экспресс-анализа проб крови. Согласно полученным результатам процесс гемолиза эритроцитов и взаимодействия гемоглобина с соляной кислотой при всех используемых ее концентрациях происходит достаточно быстро. Уже по истечении 5 — 6 с изменения электросопротивления раствора не выявляются. Это указывает на то, что реакция взаимодействия крови с раствором соляной кислоты в действительности завершается значительно раньше. При всех концентрациях раствора соляной кислоты, за исключением 0,01 н., цвет раствора при добавлении крови становится сразу бурым.

При концентрации соляной кислоты 0,01 н. и менее, хотя раствор и сохраняет красный цвет, изменения электросопротивления раствора происходит на протяжении первых 60 с, что указывает на более длительный период гемолиза и одновременно на неполное связывание гемоглобина.

Согласно следующему критерию оптимальности, соотношение объемов кровй и

-раствора соляной кислоты должно быть таким, чтобы можно было осуществить полное заполнение кондуктометрической ячейки без внесения воздушных пузырьков. Последнее практически осуществимо при объеме -жидкости в пробирке в 2 — 3 раза больше объема ячейки. При исходном объеме ячейки 50 мкл необходим объем раствора солянокислого гематина не менее 100 мкл.

Исходя иэ этого условия при фиксированном исходном объеме крови в 20 кмл соотношение объемов крови и раствора соляной кислоты должно быть не менее 1: 5.

Следовательно, с учетом требуемого минимального анализируемого объема жидкости оптимальная концентрация соляной кислоты находится в пределах 0,05 — 0,02 н.

Использование 0,05 — 0,02 и, растворов кислоты при соотношении объемов крови и раствора кислоты 1: 5 — 1: 20 позволяет, как следует из табл. 4, получать значения удельного электросопротивления на уровне 195310 Ом см, т. е, в тех же пределах, что и колебание удельного электросопротивления самой крови. Следовательно, эти предлагаемые значения концентрации кислоты при соответствующем соотношении с объемом крови позволяют использовать единую шкалу кондуктомера (100 — 500 Ом.см) для определения двух гематологических* показателей:темоглобина по предлагаемому способу и эритроцитов по известному

При выборе исходной пробы крови объеме 20 мкл и соотношении объемов крови и раствора соляной кислоты 1: 5 — 1: 20 могут быть использованы стандартные пипеточные дозаторы с объемом 100 — 200 мкл.

Поэтому при выбранных соотношениях смешиваемых объемов жидкостей удовлетворяется и условие 4 требований.

В наибольшей степени необходимым требованием отвечает способ определения гемоглобина с использованием 0,03 н раствора соляной кислоты при соотношении объемов крови и раствора кислоты, равном

1: 10. Удовлетворительные условия обеспечиваются при проведении анализа с использованием 0,05 и 0,02 н растворов соляной кислоты, поскольку при 0,05 н растворе кислоты уменьшается объем раствора, а при концентрации ее менее 0,02 н заметно снижается чувствительность способа.

Технико-экономическая эффективность предлагаемого способа заключается в том, что он позволяет определить содержание гемоглобина крови животных за 30 с, т. е. в

14 — 16 раз быстрее, чем на гемоглобинометре и в 20 раз быстрее, чем на фотоэлектроколориметре, При использовании солянокислого гематинного метода источниками дополнительной погрешности являются достигаемая точность установления требуемого цвета при добавлении в раствор дистиллята и субъективность сравнительной виЗуальной оценки

50 цветов раствора и стандарта

При использовании предлагаемого способа среднеарифметическое отклонение от показателей гемоглобина крови, полученных гемиглобинцианидным способом, не превышало 5, в то время как по Сали в силу субъективности процесса сравнения цветов раствора и стандарта, неточности установления цвета раствора и старения стандарта цвета, оно достигало 10- 35

1754069

Таблица 1

Относительные величины прироста удельного электросопротивления раствора солянокислого гематита () при изменении содержайия гемоглобина в крови в зависимости от соотношения объемов крови и раствора соляной кислоты для разных значений концентрации раствора соляной кислоты

Таблица 2

Относительные величины прироста удельного электросопротивления растворов солянокислого гематина (%) при изменейии уровня гемоглобина в крови при разных сочетаниях концентрации раствора соляной кислоты

Предлагаемый способ требует меньше процедур, изменение осуществляется на простейшем электронном кондуктомере и без применения сравнительно дорогих химреактивов (ацетонциангидрин, калий железосинеродистый„натрий двууглекислый и раствор гемоглобинцианида). Портативность используемого типа прибора и автономность его питания позволяет по сравнению с фотозлектроколориметром применять способ не только в ветеринарных лабораториях, но и непосредственно в хозяйствах.

Ф ор мул а и з обре те н и я

Способ определения количества гемоглобина крови, включающий добавление крови в раствор соляной кислоты, выдержи5 вание во времени и измерение концентрации солянокислого гематина, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью ускорения анализа, повышения точности и упрощения способа используют раствор соляной кисло10 ты с концентрацией 0,02 — 0,05 н, при этом соотношение объемов крови и раствора соляной кислоты равном 1: 5 — 20, а опреде- . ление количества гембглобина крови осуществляют кондуктометрически.

1754069

Таблица 3

Характер изменения удельного электросонротивления раствора соляной кислоты при добавлении крови в зависимости от времени

Таблица 4

Значения удельного злектросопротивления раствора солянокислого гематина при разных концентрациях соляной кислоты и соотношения объемов крови и раствора соляной кислоты

Составитель P.ÒóêøàèòoB

Техред М.Моргентал Корректор Н.Бучок

Редактор С.Лисина

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2835i Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5