Устройство для изоэлектрофокусирования и препаративного электрофореза

 

Использование: изобретение относится к области биохимии и биотехнологии в частности к устройствам для препаративного разделения макромолекул способами изоэлектрофокусирования м электрофореза Сущность изобретения: в устройстве, состоящем из колонки с рубашкой охлаждения, электродов, сосуда для электродной жидкости , применяют гелевый элемент, обеспечивающий герметизацию рабочего обьема колонки и тем самым уравновешивание гидростатического давления жидкости электропроводность и предотвращение прохождения пузырьков газа через рабочий объем колонки, 3 ил

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ Е С К ИХ

РЕСПУБЛИК ся>з G 01 N 27/453

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ. СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4636998/25 (22) 29.11,88 (46) 30.10.92, Бюл. M 40 (71) Институт молекулярной биологии и биохимии АН КазССР (72) О.В,Фурсов, И.Б.Беклемишев, B.À.Кузовлев и А,П.Францев (56) Остерман Л. Колонки для микроаналитического изоэлектрофокусирования. Научное обозрение, ЛКБ, т.17, N2,,1970.

Авторское свидетельство СССР

N 881600, кл. G 01 N 27/26, 1982. (54) УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНNß И ПРЕПАРATИВ НОГО

ЭЛ Е КТРОФО РЕЗА

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, в частности к устройствам для препаративного разделения макромолекул способами изоэлектрофокусирования и электрофореза.

Известно устройство для изоэлектрофокусирования, содержашее колонку, помещенную в охлаждающую рубашку, электроды верхнюю пробку с отверстиями, одно из которых служит для отвода газов от колонки, другое — для отвода газов от платинового анода, нижнюю пробку со штуцером для слива рабочей жидкости. Однако устройство сложно в изготовлении, исключена возможность вариации объема пробы, необходимо строгое соответствие уровней катодного и анодного буфера и их плотностей.

Известно устройство для изоэлектрофокусирования. содержащее колонку, размещенную в рубашке охлаждения, электроды, причем нижний представляет собой пробку, выполненную из графита и имеющую осевое Ы, 1772712 А1 (57) Использование: изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. в частности к устройствам для препаративного разделения макромолекул способами изозлектрофокусирования и электрофореза, Сущность изобретения: в устройстве, состоящем из колонки с рубашкой охлаждения, электродов, сосуда для электродной жидкости, применяют гелевый элемент, обеспечивающий герметизацию рабочего обьема колонки и тем самым уравновешивание гидростатического давления жидкости, электропроводность и предотвращение прохождения пузырьков газа через рабочий объем колонки, 3 ил. отверстие для содержимого колонки. а также целлофановую мембрану, отделяющую содержимое колонки от графитового электрода, Недостатком устройства является необходимость изготовления специального графитового электрода, диаметр которого токарной обработкой доводится до соответствия с внутренним диаметром используемой колонки, Кроме того, конструкция требует использования специальных видов диализных мембран.

Целью изобретения является упрощение устройства и повышение качества разделения. Поставленная цель досгигается тем, что в устройстве для изоэлектрофокусирования, состоящем из разделительной колонки с рубашкой охлаждения, капилляра для выведения фракций из колонки, расположенной в нижней части колонки и электрода, выполнено отверстие, расположенное соосно капилляру для выведения фракций в

1772? 12 дне нижнего электродного сосуда размещен гелевый герметизирующий элемент, верхний край которого расположен на одном уровне с верхним концом капилляра, и выше нижнего торца разделительной колонки, электрод погружен в буферный раствор, размещенный поверх гелевого элемента, а нижний торец капилляра размещен ниже дна нижнего электродного сосуда.

На фиг. 1 показана конструкция предлагаемого устройства, Устройство работает следующим образом.

В цилиндрический сосуд 2 опускается стеклянная колонка с охлаждающей рубашкой 1 таким образом, чтобы капилляр 3 располагался по центру колонки, Между нижним торцом колонки и дном цилиндрического сосуда оставляется зазор 2 — 3 мм. В цилиндрический сосуд заливается токопроводящий гель 4 (например, агароза или полиакриламидный гель), приготовленный на нижнем электродном буфере, в таком количестве, чтобы высота геля внутри колонки 1 находилась на одном уровне с верхним срезом капилляра 3. После полимеризации или застывания геля, внутренний объем колонки заполняется рабочим раствором, Истечение рабочего раствора из колонки через

- капилляр 3 предотвращается за>кимом 8, расположенном на эластичном шланге 7, применяемом при фракционировании содержимого колонки 1, Ввиду того, что устройство может быть использовано как для электрофореза в жидкой фазе, так и изоэлектрофокусирования, рабочие и буферные растворы могут быть различного состава, В нижний цилиндрический сосуд заливается буферный раствор 5 и опускается электрод б, выполненный из любого инертного электропроводящего материала (например платина, графит), На рабочий раствор колонки, высота которого не доходит до ее верхнего торца, наслаивается верхний электродный раствор 9, в который опущен электрод 10, Г1ри подаче постоянного напряжения на электроды колонки через рабочий и буферные растворы и гель, течет электрический ток, величина которого зависит от электропроводности растворов и геометрических размеров колонки, что позволяет использовать устройство как в аналитических. так и в препаративных целях;

Предлагаемое устройство отличается простотой изготовления, исключающей токарные работы. Конструкция его может быть изготовлена из доступных материалов, устройство присуще высокая эффектив10

35 заполнения внутреннего объема колонки рабочим раствором с разделяемой смесью

55 представлен на фиг. 2, б) Препаративный электрофорез в жидкой фазе, Рабочий раствор колонки, электродные растворы и герметизирующий гель готови лись на трис-глици новом буфере р Н 8,3. Для

20 ность разделения, обусловленная отсутствием перемешивания рабочего раствора газами, образующимися на электродах, низкие экономические. затраты на изготовление и большой диапазон варьирования рабочих объемов колонки, снижения перемешивания фракций при раскапывании содержимого колонки. обусловленное наличием капилляра.

Пример 1. а) Изоэлектрофокусирование белков в жидкой фазе. В качестве модельной смеси использовали очищенный препарат а-амилазы зерна пшеницы содержащий ряд изоформ, в смеси с очищенным препаратом глутаматдегидрогеназы. Сбор-, ка устройства и его подготовка к работе проводилась как описано в описании, В качестве рабочего раствора использовали

2, -ный раствор амфолинов производства фирмы LKB,Pharmacia (Швеция), или Алмалит (Алма-Ата, КазГУ). Диапазон,рН от 4 до

9. Рабочая среда стабилизировалась линейным градиентом сахарозы или глицерина s диапазоне концентраций от 15 до 5%

Смесь белков вносили в объем рабочего раствора при заполнении колонки. В качестве герметизирующего слоя использовался 5; ный полиакриламидный гель, который готовился на 0,05 М уксусной кислоте, После полимеризации геля на него наслаивали

0,05 M раствор уксусной кислоты, в которой опускался платиновый электрод, соединенный с положительным полюсом высоковольтного источника напряжения. После белков на столб рабочего раствора наслаивали 0,05 М раствор NaoH, в который опускался платиновый электрод, соединенный. с отрицательным полюсом высоковольтного источника питания. Через водяную рубашку колонки пропускался ток охлаждающей жидкости с температурой 2 — 4 С, При, подаче электрического тока через колонку регистрировэли следующие параметры: напряжение 600 В, ток 30 мА, По окончании фокусирования, что регистрировалось по дости>кению постоянной величины тока, равной 2-5 мА (конечное напряжение 1000

В), источник питания отключался и содержимое колонки раскапывалось по фракциям

2-3 мл, в которых анализировалась активность разделяемых ферментов. График распределения активности по фракциям

1772712 предотвращения конвекции использовали линейный градиент глицерина или сахарозы в диапазоне от 25 до 5%. Разделяемые белки, смесь а-амилаэы и ГДГ растворялись в 3 -ной сахарозе содержащего следы бромфенолового синего на буфере того же состава. Эта смесь наслаивалась на столб рабочего раствора, а по sepx нее наносили электродный буфер. Нижним электродом являлся анод, На электроды подавалось напряжение 150-200 В, а ток составлял 30 мА, Об окончании процесса разделения судили по выходу красителя — бромфенолового синего.

Содержимое колонки фракционировали через капилляр по 2-3 мл. Распределение активности разделяемых ферментов по фракциям приведено на фиг. 3.

Формула изобретения

Устройство для изоэлектрофокусирования и препаративного электрофореза. включающее разделительную колонку с рубашкой охлаждения, капилляр для выведения фракций из колонки, расположенный в нижней части колонки. и электроды, о т л и ч а ю5 щ е е с я тем, что, с целью упрощения устройства и повышения качества разделения путем устранения попадания пузырьков газа в разделительную колонку. в дне нижнего электродного сосуда выполнено отверстие, 10 расположенное соосно с капиллярами для выведения фракций, а на дне нижнего электродного сосуда размещен гелевый герметизирующий элемент, верхний край которого расположен на одном уровне с верхним кон15 цом капилляра и выше нижнего торца разделительной колонки, электрод погружен в буферный раствор, размещенный поверх гелевого элемента, а нижний торец капилляра размещен ниже дна нижнего электродного

20 сосуда, 1772712

0,8 рН, 0,6

0,2

80.

Ф фрзмцин

0Е

0,5

0,4

0,3 о,г

8 Хб ° 24

32 40 48

У фражкй

Составитель С,Фурсов

Техред М,Моргентал

Корректор M.Màêñèìèøèíå÷

Редактор

Заказ 3842 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открьпиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, М(-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 1()1