Способ контроля чистоты проламина

 

Использование: изобретение может быть использовано в биотехнологии растений , практической биохимии для определения степени очистки белков в процессе их выделения из растительного материала. Сущность изобретения: проводят подготовку образца препарата к анализу путем пленки из раствора проламина в 70%-ном диоксане на оптическое стекло, высушивают ее под вакуумом, регистрируют инфракрасный спектр проламина в области 2800-3700 , определяют значение оптической плотности в максимумах поглощения при 2925-2930 и 3295-3310 и рассчитывают отношение оптических плотностей в максимумах полос поглощения. Сравнивают полученное значение со значением для очищенного образца 0,35-0,55. Попадание отношения оптических плотностей в указанный интервал свидетельствует о чистоте препарата. 1 ил., 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСГ1УВЛИК

s 6 01 N 21/35

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4853205/25 (22) 17.07.90 (46) 30.11.92. Бюл. N 44 (71) Днепропетровский государственный университет им. 300-летия воссоединения

Украины с Россией (72) B.Ñ.Ôåäåíêî, В.С.Стружко, Л.В.Шупранова и М.В.Сысоева (56) Mecham D.Ê., Mohammad А.— Cer.Chem, 1955, ч, 32. N 4. р. 403 — 415.

izzo M,T„Ho С. — T,-Cer.Chem, 1989, ч.

66,N 1,р.47 — 51, Harris РЛ . et al. — Cer. Chem. 1987, ч. 64, ¹ 33, р. 283 — 284. (54) СПОСОБ КОНТРОЛЯ ЧИСТОТЫ ПРОЛАМИНА (57) Использование: изобретение может быть использовано в биотехнологии растеИзобретение относится к биотехнологии растений, технической биохимии и может быть использовано в качестве способа определения степени чистоты белков в процессе их выделения из растительного материала.

Известны способы контроля чистоты препаратов проламина, которые заключаются в экстракции небелковых веществ органическим растворителем, удаления растворителя и определении веса сухого остатка примесей. При этом степень чистоты белкового препарата оценивают по содержанию экстрагируемых небелковых примесей (в % к исходнгй навеске препарата). К недостаткам указанных методов следует отнести трудоемкость и длительность проведения экстракции, большой расход органических растворителей. Применение

„„Я)„„1778639 А1 ний, практической биохимии для определения степени очистки белков в процессе их выделения из растительного материала.

Сущность изобретения: проводят подготовку образца препарата к анализу путем пленки из раствора проламина в 70%-ном диоксане на оптическое стекло, высушивают ее под вакуумом, регистрируют инфракрасный спектр проламина в области

2800-3700 см 1, определяют значение оптической плотности в максимумах поглощения при 2925 — 2930 см " и 3295-3310 см и рассчитывают отношение оптических плотностей в максимумах полос поглощения.

Сравнивают полученное значение со значением для очищенного образца 0,35 — 0,55.

Попадание отношения оптических плотностей в указанный интервал свидетельствует о чистоте препарата. 1 ил., 3 табл. органических растворителей или их смеси, как правило, не приводит к исчерпывающей экстракции примесей, прочно связанных с белковой макромолекулой, что снижает достоверность оценки степени чистоты препарата.

Наиболее близким техническим решением является способ, согласно которому очищенный препарат помещают в чашку

Петри и определяют три индекса цветности на специальном приборе, измеряющем степень отражения интегрального светового потока (индекс 1 ), а также отраженных красного и зеленого (индекс а), желтого и синего света (индекс в). Затем определяют аналогичные цветовые индексы стандартного образца (обезжиренная соевая мука). Степень чистоты определяют по величине трех цветовых индексов анализируемого препарата

1778639 в сравнении со стандартным образцом и количеству осгэточных липидоа.

Недостатками способа-прототипа являются трудоемкость, длительность анализа, необходимость использования большого количества образца (20г). Способ не позволяет контролировать процесс очистки только по оптическим параметрам образца и требует проведения дополнительной экстракции липидных примесей.

Целью изобретения является упрощение способа.

Для достижения цели проводят подготовку образца препарата к анализу путем отливки пленки из раствора на оптическое стекло. Измеряют инфракрасный спектр проламина на спектрофотометре в области

2800 — 3700 см . определяют значения опти-1 ческой плотности в максимумах поглощения при 2925-2930 и 3295 — 3310 см и рассчитывают их отношения. Белок считывается чистым, если это отношение попадает в интервал 0,35-0,55.

Интервал значений волновых чисел максимумов поглощения при 2925 — 2930 и

3295-3310 см обоснован экспериментально.

В качестве иллюстрации способа приведены спектры поглощения проламина соргодо очистки (чертеж, кривая 1) и после гельфильтрации на сефадексе LH-20 (чертеж, кривая 2).

Пример 1. В качестве чистых стандартных препаратов для установления диапазона значений показателя 01/02 использовались проламины, очищенные методом гель-фильтрации на сефадексе LH20, что является общепринятой процедурой для очистки проламиновых белков, Например, для очищенного указанным методом препарата зеина содержание основного компонента (белка), найденного известным методом. составляет 99.1 .

Исследовали ИК-спектры этих препаратов проламина пшеницы (глиадин) и кукурузы (эеин), предварительно очищенных методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом Н вЂ” 20 в 70%-ном этаноле. Для подготовки тонкой пленки образца к анализу раствор 3 мг препарата в 0,5 мл 70 -ного диоксана наносили на оптическое стекло из флюорита и высушивали под вакуумом. ИКспектры проламинов получали на приборе

Спекорд M-80 в области 2800-3700 см

Оптические плотности D>/Dz в максимумах поглощения при v 1 и Р 2 рассчитывали по методу базисной линии. Значения сравнительного показателя О>/Dz приведены в табл.3 (ошибка измерения не более 57ь).

25 (D>/Dz = 9.25). трации дает возможность сделать вывод о

45 том. что I хроматографическая фракция яв50

5

Пример 2. Исследовали ИК-спектры проламинов, выделенных из зерна злэковых культур путем экстракции 70 -ным эталоном после отделения альбуминов и глобулинов, Очистку проламинов и получение

ИК-спектров проводили аналогично примеру 1. Результаты определения сравнительного показателя проламинов до и после гель-фильтрации приведены в табл,2 (ошибка измерения не более 5%).

Пример 3. Зеины выделяли иэ размолотого зерна кукурузы (линия А 204 о2/о2) после трехкратного обезжиривания муки петролейным эфиром путем зкстракции пятикратным объемом 70;(,-ного этанола. Лиофилизированный белковый препарат очищали путем переосаждения. Для проведения очистки белок растворяли в минимальном объеме 70 этанолэ и прибавляли охлажденный до минус 20" С ацетон (соотношение раствора белка и ацетона 1:9 по объ ему), Осадок, отделенный центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин, представляет собой зеин после обработки ацетоном, а надосадочная жидкость — ацетоновый экстракт, Затем проводили гель-фильтрацию препарата зеина на колонке с сефадексом LH-20 в растворе 70 -ного этанола и получали I и II хроматографические фракции, ИК-спектры зеинов на различных стадиях очистки получали аналогично примеру 1, результаты определения приведены в табл,3 (ошибка измерения не более 5%).

Величина критерия Di/Dz позволяет контролировать эффективность очистки препарата зеина на различных стадиях. Так, после обработки ацетоном показатель для зеина уменьшается более, чем в 2 раза, напротив, ацетоновый экстракт представлен, в основном, небелковыми веществами

Значение показателя после гель-фильляется чистым белковым препаратом (01/02 = 0,41), тогда как II фракция представлена небелковыми веществами (О>/Dz

= 2,67).

Пример 4. Исследовали аналогично примеру 1 ИК-спектр зеина, полученного экстракцией 86%-ним изопропэнолом из глютена (сопутствующий продукт кукуруза-крахмального производства) по известной методике, Максимумы поглощения в

ИК-спектре препарата составили 2930 и

3300 см соответственно. Значение показателя 0>/02 находится в интервале, установленном для очищенных проламинов, и составляет 0,43.

1! 8639

Формула изобретения

Способ контроля чистоты проламина, заключающийся в определении оптического параметра для образца и в сравнении его величины со значением для очищенного образца. о тл ич а ю шийся тем. что, с целью упрощения способа, отливают на оптическом стекле пленку проламина из раствора

Таблица 1

Таблица 2

01 /0

Р, см т 2, см

Стадия очистки

Характеристика и оламинов

До гельфильтрации

После гельфильтрации

Кафирин

3296

2925

2,17 (Сорго "Судзерн

62") 3300

2930

0,51

2928

3296

1,04

2930

3296

0,55

2925

3295

0,77 (Пшеница "Днепровская 846) 2928

3295

0,43

До гельфильтрации

После гельфильтрации

Глиадин

2925

3295

0,58 (Пшеница "Коралл Одесский" ) 2928

3296

0,42

Авенин (Овес " Скакун" ) Глиадин

До гельфильтрации

После гельфильтрации

До гел ьфильтрации

После гельфильтрации в 70 -ном диоксане, высушивают ее пол вакуумом, регистрируют ИК-спектр в области 2800-3700 см, в качестве оптического

-1 параметра определяют отношение оптиче5 ских плотностей в максим мах полос flocRQщения при 2925 — 2930 см и 3295-3310 см и сравнивают полученное значение со значением для очищенного образца 0.35-0,55.

1778639

Таблица 3

Составитель В,Феденко

Техред M.Moðãåíòàë Корректор M.Êåðåöìàí

Редактор Н.Коляда

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 4188 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5