Способ определения устойчивости зерна кукурузы к фузариозу

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5ц5 А 01 Н 1/04

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ вЂ” и t, 6 (21) 4887345/13 (22) 08.08.90 (46) 30.12,92. Бюл. 1ч. 48 (71) Днепропетровский государственный университет им. 300-летия воссоединения

Украины с Россией (72) Н.И,Штеменко, А.Н.Винниченко, Л.Ф.3аморуева, В.В,Глушко, А.А.Маршацкий и И,А.Лексикова (56) Флоря М.В. Повысить невосприимчивость высоколизиновой кукурузы к фузариозу.// Защита растений, 1983, N. 10, Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к определению потенциальной устойчивости к неблагоприятным факторам растений кукурузы в селекционном процессе.

Известны способы определения устойчивости зерна к инфекционным заболеваниям, заключающиеся в заражении растений возбудителями болезней, выдерживании их в оптимальном для развития патогенов режиме и дальнейшем определении повреждаемости растений, на основании чего судят об устойчивости сорта к данному патогену.

Выполнение этих способов требует проведения полевого эксперимента или работ с культурой ткани растения.

Известны биохимические способы определения устойчивости семян к вредным организмам, основанные, например, на измерении содержан .я хлорофила "а" и суммы каротиноидов в 9-дневных проростках семян сахарной свеклы; на оценке электрофоретического спектра компонента пероксидаз в семенах вики, на исследовании аминокислотного состава семян. К недо. Ж, 1784140 А1 ь (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ЗЕРНА КУКУРУЗЫ К ФУЗАРИОЗУ (57) Использование; биотехнология, сельское хозяйство, фитопатология. Сущность изобретения: устойчивость зерна кукурузы к фузариозу определяют по величине поглощения свободных аминокислот, окрашенных нингидриновым красителем, при этом данный показатель устойчивых форм ниже такового у неустойчивых в 1,7-7,7 раза. 2 табл, статкам вышеупомянутых способов следует отнести их длительность и трудоемкость.

Наиболее близким по сущности и достигаемому эффекту является способ отбора устойчивых форм кукурузы в условиях искусственного заражения. Способ заключается в инъекции початков в период их массового цветения суспензией конидий патогенов, Через 20 дней проводится учет пораженных початков по степени развития заболевания, затем по разработанной шкале и по общепринятым в фитопатогогии формулам определяют устойчивые и неустойчивые к заболеваниям формы кукурузы.

Длительная и трудоемкая методика позволяет провести анализ в течение 20 сут, требует проведения полевого эксперимента, работы с токсичными средами, что затрудняет йс пользование способа в селекционной практике.

Целью изобретения является упрощение и ускорение способа.

Поставленная цель достигается способом, который осуществляется следующим образом:

1784140

Проводят экстракцию свободных аминокислот 70 -ным водным спиртом из неразмолотого зерна, к экстракту добавляют нингидриновый раствор, нагревают, охлаждают, измеряют поглощение раствора в областях 400, 570 нм, Расчитывают оптическую плотность на 1 мл раствора на

1 г навески зерен. Полученные величины сравнивают с таковыми для форм кукурузы, контрастных по устойчивости, обычно различающихся в 2 — 10 раз. Устойчивые формы имеют значения более низкие, чем неустойчивые.

В качестве иллюстрации способа приведены Данные по поглощению форм кукурузы устойчивых и неустойчивых к фузариозу (табл,1), 70 водный спирт используется для экстракции свободных аминокислот из растительных объектов. Нингидриновый раствор готовили по известной процедуре, при этом добавляется избыток этого реактива, Время экстракции и количество добавляемого экстрагента обосновано экспериментально (табл,2). Величина поглощения, рассчитанная для определенного образца в данных.областях уф-спектра, является маркерным признаком для определенной формы кукурузы и обратно коррелирует с устойчивостью к фузариозу.

Неустойчивые к фузариозу формы имеют измененный жирнокислотный состав оболочки, что, как показано в этом способе, обуславливает большую проницаемость свободных аминокислот из эндосперма.

Группа образцов кукурузы 1 — 6 и 15 — 20 относятся соответственно к обычным и переведенным на основу опейк-2 формам кукурузы, которые описаны как устойчивые и неустойчивые формы к фузариозу початков.

Образцы 7-14, 21 — 28 получены в процессе селекционной работы во ВНИИ Кукурузы г,Днепропетровска. 7 — 14 характеризуются повышенной устойчивостью к данному патогену (заболеваемость 0-25 ), а для образцов 21 — 28 характерна заболеваемость более 80Д, что установлено экспериментальными данными трехгодичного полевого эксперимента.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что способ позволяет выявить формы кукурузы обладающие повышенной (пониженной) устойчивостью к фузариозу початков.

Пример 1. В стеклянные пробирки помещаем по 5 зерен, предварительно взвешенных, (одновременно тестировать можно 19 образцов + контроль) заливает 2 мл 70 этанола. Контрольный опыт проводим без зерна. Помещаемпробирки в сосуд с кипящей водой на 10 мин, охлаждаем.

Сливаем экстракт в заранее приготовленные пробирки, смывает небольшим количеством 70 этанола зерна еще раз и доводим: объем экстракта до 1 мл. Добавляем по 1 мл

5 нингидринового раствора и нагреваем на кипящей водяной бане в течение 6 мин (время проведения полной реакции нингидрина с аминокислотами в капиллярном реакторе аминокислотного анализатора. Измеряют

10 поглощение окрашенного раствора в 0,1 см кювете при 400 и 570 нм на спектрофотометре Спекорд М-40(возможно применение фотометров). Рассчитывают величину оптической плотности на 1 r навески зерна, 15 1 см кюветы, 1 мл экстракта. Результаты представлены в табл.1. Данные статистически достоверны. Ошибка измерения не более 5 .

Данные, приведенные в табл.2, свиде20 тельствуют о том, что уменьшение времени экстракции приводит к слабой различаемости данных по устойчивой и неустойчивой форме;вследствие недостаточной Экстракции свободных аминокислот опыт 1), Уве25 личение времени нецелесообразно, т.к, соотношение величин сохраняется (опыты 2 и 3) по сравниваемым формам. Уменьшение количества растворителя (опыт 4) приводит к тому, что часть семян оказывается непок30 рытыми растворителем и не обеспечивает полной экстракции. Увеличение количества растворителя не приводит к значительным изменениям, поэтому не является целесообразным. Таким образом, время экстракции

35 10 мин, и количество растворителя — 2 мл являются оптимальными для достижения ожидаемого эффекта, Отличительными особенностями способа являются анализ величин оптических

40 плотностей экстракта свободных аминокислот из целого зерна кукурузы и выявление устойчивых и неустойчивых форм кукурузы по этим величинам в областях поглощения окрашенных производных аминокислот.

45 По указанным отличительным признакам был проведен патентный поиск. Аналогичных решений не обнаружено, поэтому указанные признаки являются существенными.

50 Использование предлагаемого способа в сравнении с прототипом позволит упростить и ускорить проведение отбора путем исключвния длительных и трудоемких операций, уменьшить количество анализируе55 мого селекционного материала.

Способ прост в техническом исполнении и позволит существенно повысить интенсивность селекционной диагностики для выявления устойчивых и неустойчивых образцов кукурузы к фузариозу початков.

1784140 исследуемого показателя измеряют величину поглощения окрашенных нингидриновых растворов свободных аминокислот, извлеченных из целого зерна, и к устойчивым относят формы, величина поглощения кото5 рых в 1,7 — 7,7 раз ниже, чем значение данного показателя у контрольных неустойчивых форм.

Формула изобретения

Способ определения устойчивости зерна кукурузы к фузариозу, включающий исследование показателя влияния патогена на оцениваемые растения и сравнение его с показателем контрольных растений, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения и ускорения определения, в качестве

Таблица 1

Величины оптических плотностей экстрактов иэ зерна различных форм кукурузы

Образец

Неустойчивые формы

Отношение неуст. о ма

Образец

Устойчивые формы устойч. форма

0400 НМ

D570 нм

О400 нм

О570 нм

0400 нм

D570 нм

Таблица 2 б

Величины оптических плотностей водно — спиртовых экстрактов из 5 зерен устойчивой и неустойчивой формы кукурузы при различных условиях экстракции

3

5

7

9

11

12

13

7 21«0 56

3,69 +.0,06

6,24 «0,43

7,61":0,53

4,15 -0,10

2,80+0,01

4,41+0,02

5,08:"0,06

4,99 0,05

2,08+0,01

7,69+056

5.54+ 0,07

8,79 +0,53

7,99 "-0,50

5,20:"0,06

2,75 0,09

5,02 «0,07

5,43"-0,06

3,49+0,05

2,37+0,01

3,52 +0,01

4, 1 8 «-0,06

3,32 +.0,08

1,47 «0,01

4,16 «0,01

2,52 «0,01

4,69 0.03

4,79 0.03

16

17

18

19

21

22

23

24

26

27

14,98":1,23

18 73й1 51

22,36+2,18

31,07 3,19

13,49 «1,09

10,03++0,98

33,97«3,15

30,55«2,96

11,81 «0,73

11,35 «0,72

14 96+1 15

13,99+U,02

15,36 «1,03

29,94:"3,02

10,40М,93

15,33 «1,23

18,98 1,63

24,75 «2,23

9,31 0,96

7,92 1,12

23 95«2 50

15 45«1 42

8,59 «0,44

7 26 «О 57

9,63 0,83

9,31 0,92

8,96 0,59

23,04 «2,32

2,05

5,07

3,58

4,06

3,25

3,57

7,70

6,01

2,36

5,47

1,94

2,52

1,74

3,74

2,07

5,57

3,78

4,55

2,66

3,35

6,80

3,69

2,58

4,98

2,31

3,72

1,91

4,80