Способ обнаружения вируса иммунодефицита человека
Изобретение относится к медицине, предназначено для обнаружения вируса иммунодефицита человека при использовании культур клеток нейроэктодермального происхождения, а также для поиска антивирусных препаратов. Цель изобретения - повышение чувствительности способа и его упрощение. Для выявления вируса иммунодефицита человека используют первичные монослойные культуры астроцитов человека на 14 - 16 сутки их роста in vitro. Культуры сокультивируют с вирусинфицированными клетками крови в течение 20 - 24 ч. Инфицирование проводят путем фагоцитоза астроцитами клеток-продуцентов ВИЧ при их соотношении 1:2:3. По появлению многоядерных астроцитов, содержащих вирусспецифические антигены, констатируют наличие вируса. Дополнительно об обнаружении инфекции судят по выявлению в астроцитах ДНК-провируса ВИЧ. Визуальное наблюдение специфического цитопатичесокго действия позволяет быстро и просто по сравнению с прототипом обнаружить вирус.
Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для изучения репродукции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в культурах клеток нейроэктодермального происхождения. Цель изобретения повышение чувствительности способа и его упрощение за счет визуального наблюдения специфического действия вируса. Способ осуществляют следующим образом. Источником получения культур служит нервная ткань, полушария больного мозга, мозжечка и других, подлежащая удалению при хирургических вмешательствах по поводу черепно-мозговой травмы. Первичные монослойные культуры состоят из 85-90% астроцитов. В экспериментах используют Т-лимфобласты линии Н9, продуцирующие ВИЧ-1 штамм III (линия Н9/IIIВ). В качестве контроля берут Т-лимфобласты не инфицированные ВИЧ-1 (перевиваемая линия клеток Н9). Монослойную культуру астроцитов выращивают во флаконах объемом 50 мл с четырьмя помещенными на их дно покровными стеклами на их дно покровными стеклами. Подготавливают культуру Т-лимфобластов, хронически инфицированную вирусом ВИЧ-1 штамм IIIВ, и параллельно такую же контрольную культуру без вирусов. На 14-16 сутки роста подсчитывают количество астроцитов во флаконах, удаляют из них культуральную жидкость, в одну часть флаконов (опытные) вносят в 2 мл ростовой среды Т-лимфобласты, инфицированные ВИЧ-1, а в другую неинфицированные Т-лимфобласты (из расчета на 1 астроцит 2-3 лимфобласта). Ставят флаконы в термостат при 37оС с 5%-ным содержанием СО2 на 15 мин, затем добавляют в каждый флакон по 3 мл ростовой среды и вновь помещают в термостат. Через 20-24 ч из флаконов удаляют культуральную жидкость, промывают монослой 3-4 раза ростовой средой, контролируют в фазово-контрастном микроскопе адсорбцию Т-лимфобластов и их поглощение астроцитами в опыте и контроле, после чего вносят во флаконы по 3 мл этой же ростовой среды и помещают их в термостат. На 5-6 сутки после инфицирования констатируют завершенность фагоцитоза в культурах и производят их пересев в новые культуральные флаконы (1-й пассаж). В опытных культурах на 1-м пассаже к 5-7 дню роста отмечают стимуляцию роста астроцитов, проявляющуюся в более быстром формировании монослоя. На 7-8 день инфицированные и на 14-16 сутки контрольные культуры пересевают на 2-й пассаж (критерием для пересева служит образование сплошного монослоя). О воспроизведении инфекции и обнаружении ВИЧ судят на 2-м пассаже (18-20-й день после инфицирования) по появлению многоядерных клеток (астроцитов), содержащих от 4 до 17 различного размера ядер, в которых обнаруживают вирусспецифические антигены при использовании метода непрямой иммунофлюоресценции и применении поликлональной сыворотки вирусоносителя (ВИЧ-1). Дополнительно о воспроизведении инфекции судят по обнаружению в астроцитах ДНК-провируса. Используют метод молекулярной гибридизации, который проводят с 10 мкг хромосомной ДНК астроцитов, используя ДНК-зонд плазмиды PSP, содержащий и не содержащей последовательностей ВИЧ-1. О наличии ДНК провируса в инфицированных астроцитах судят по засветке рентгеновской автографической пленки. П р и м е р 1. Обнаружение ВИЧ в монослойных культурах астроцитов, полученных из ткани затылочной области коры полушарий головного мозга 40-летнего мужчины, инфицированных путем фагоцитоза Т-лимфобластов, продуцирующих ВИЧ-1 штамм IIIВ. Источником для получения культур клеток явилась ткань мозга (0,3-0,5 см), удаленная во время хирургического вмешательства по поводу черепно-мозговой травы в 12 культуральных флаконах объемом 50 мл с помещенными на дно 4 покровными стеклами готовят монослойные культуры астроцитов. На 14 сутки подсчитывают выросшее во флаконах среднее количество клеток. Устанавливают, что их число составляет 800-50 тыс. клеток на флакон. Суспензионную культуру Т-лимфобластов, продуцирующую ВИЧ-1 и культуру, не продуцирующую вирус, в объеме 3 мл помещают в отдельные пробирки и центрифугируют при 1,5 тыс оборотах в течение 10 мин. Надосадок удаляют. Используя камеру Горячева, подсчитывают количество клеток в осадке и разводят их ростовой средой до концентрации 1 млн. 200 тыс. кл/мл. Из флаконов с культурами астроцитов удаляют ростовую среду и в каждый из первых 6 флаконов вносят по 2 мл приготовленной суспензии Т-лимфобластов, продуцирующих ВИЧ (по 2 млн. 400 тыс. клеток на флакон). Помещают флаконы на 15 мин в термостат при 37оС с 5% СО2, затем добавляют в каждый флаконы по 3 мл ростовой среды и вновь помещают в термостат. Через 24 ч из флаконов удаляют культуральную жидкость, осторожно промывают монослой 3 раза ростовой средой, устанавливают в фазовоконтрастном микроскопе факт адсорбции и фагоцитирования астроцитами в опыте Т-лимфобластов, продуцирующих ВИЧ-1, в контроле Т-лимфобластов, не инфицированных вирусом, после чего вносят во все флаконы по 5 мл ростовой среды и помещают их в термостат. На 6 сутки после инфицирования определяют завершенность фагоцитоза, исследуя в фазово-контрастном микроскопе как монослой астроцитов во флаконах, так и на покровных стеклах. Последние помещают в фиксатор Дюбокс-Бразиль-Буэна и окрашивают гематоксилином и зозином. После исчезновения крупных внутрицитоплазматических включений и вакуолей констатируют выход астроцитов из фазы завершения фагоцитоза и производят пересев (посевная доза 70 тыс. кл/мл) на 1-й пассаж. На 1-м пассаже в опытных культурах отмечают стимуляцию роста клеток, в результате чего сплошной монослой формировался уже к 7 дню, в то время как в контрольных культурах его образования завершилось только к 16 дню. После образования сплошного монослоя клеток (в опытных и контрольных культурах) осуществляют пересев культуры на 2-й пассаж. На 2-м пассаже в опытных культурах (18-й день после инфицирования) рисунок монослоя изменяется, клетки располагаются более плотно, появляется 14 
2% многоядерных астроцитов, содержащих от 5 до 17 различного размера и формы ядер. Непрямым методом флуоресцирующих антител с использованием поликлональной сыворотки в цитоплазме многоядерных астроцитов выявлены антигены ВИЧ-1. Методом молекулярной гибридизации, в варианте Дот-анализа с ДНК плазмидой рВН 10, меченной рЛТТФ, в хромосомной ДНК клеток выявлен ДНК-провирус. Многоядерные астроциты с обнаруженным ВИЧ-1 выявились до 7-8 их пассажа в 100% случаев (в 12 из 12 флаконов с инфицированной культурой астроцитов). Таким образом, при инфицировании астроцитов взрослого человека путем фазоцитоза ими Т-лимфобластов перевиваемой клеточной линии, продуцирующей ВИЧ-1 штамм IIIВ, возбудитель обнаруживается по цитопатическому эффекту, проявляющемуся через 18 дней после инфицирования и заключающемуся в формировании многоядерных астроцитов, содержащих в цитоплазме вирусспецифические антигены. П р и м е р 2. Обнаружение ВИЧ в монослойных культурах астроцитов, полученных из коры мозжечка 45-летнего мужчины, инфицированных путем фагоцитоза Т-лимфобластов, продуцирующих ВИЧ-1 штамм IIIВ. Источником для получения культур клеток явилась ткань мозга (0,3-0,5 см), удаленная во время хирургического вмешательства по поводу черепно-мозговой травмы. Монослойные культуры астроцитов приготавливают в 12 культуральных флаконах с помещенными туда 4 покровными стеклами. На 16 сутки роста подсчитывают клетки и устанавливают, что их число на флакон колеблется в пределах 650 72 тыс. Затем готовят культуры Т-лимфобластов (2 млн./мл). Культивируют и пересеивают клетки, как в примере 1. На 2-м пассажном уровне в опытных культурах (20-й день после инфицирования) рисунок монослоя астроцитов изменился, клетки стали располагаться более плотно, появилось до 18 2% многоядерных клеток, содержащих от 4 до 16 различного размера и формы ядер. С использованием метода флуоресцирующих антител в цитоплазме многоядерных астроцитов выявлены вирусспецифические антигены. Методом молекулярной гибридизации в хромосомной ДНК астроцитов выявлены интегративные формы ДНК-провируса ВИЧ-1. Многоядерные астроциты с обнаруженным в них ВИЧ-1 выявились в 100% случаев (в 12 из 12 культуральных флаконов с инфицированной культурой астроцитов) до 7-го пассажа. Таким образом, по визуальному наблюдению специфического цитопатического действия ВИЧ его легко и просто обнаружить в первичных монослойных культурах астроцитов человека. Появление многоядерных астроцитов однозначно свидетельствует о наличии ВИЧ в культивируемых клетках. Простота предлагаемого способа облегчает обнаружение ВИЧ и делает возможным его выполнение и использование в любой диагностической лаборатории.
Формула изобретения
СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА in vitro, включающий заражение клеток нервной системы вирусом, пассирование их и регистрацию инфицирования, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и его упрощения в качестве клеток нервной системы используют первичные монослойные клеточные культуры астроцитов человека на 14 - 16 сутки роста, заражение их осуществляют инкубированием с клетками-продуцентами вируса в соотношении 1 : 2 - 3 в течение 20 - 24 ч, а инфицирование вирусом обнаруживают по появлению многоядерных астроцитов или по выявлению в астроцитах ДНК-провируса ВИЧ.MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Номер и год публикации бюллетеня: 23-2001
Извещение опубликовано: 20.08.2001
