Способ выявления мутаций 8-го кодона (-аа) бета-глобинового гена

Авторы патента:

G01N33/48 - биологических материалов, например крови, мочи (G01N 33/02-G01N 33/14,G01N 33/26,G01N 33/44,G01N 33/46 имеют преимущество; определение всхожести семян A01C 1/02); приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) (подсчет клеток крови, распределенных по поверхности, путем сканирования этой поверхности G06M 11/02)

Использование: медицинская биохимия . Сущность изобретения: выделяют клеточную ДНК, проводят ее амплификацию, амплификат разделяют электрофорезом, гель окрашивают водным раствором этидия бромида, а о наличии мутантного гена судят по появлению фракции длиной 200 кбаз.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

О (21) 4936811/14 (22) 03,01,92 (46) 07,03,93, Бюл, ¹ 9 (71) Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии Министерства здравоохранения Азербайджанской Республики (72) Э,M.Ð,Ðàñóëîâ и К.Ю.Мамедов (73) Э.М.Р,Расулов, К.Ю.Мамедов (56) Blood 1988., ¹ 1, 243 вЂ” 251, Изобретение относится к молекулярной биологии, конкретно к способам выявления мутации гена бета-глобина, и может быть использовано в медицине, в частности в медико-генетическом консультировании.

Целью изобретения является быстрое и упрощенное нерадиоактивное электрофоретическое определение мутации 8-го кодона (-АА) бета-глобинового гена.

Сущность изобретения заключается в том, что из 0,5 вЂ” 1,0 мл цельной крови выделяют клеточную ДНК. Затем с помощью двух комплементарных 19-членных олигонуклеотидных праймеров (0,6 мкг/мкл), буфера, всех четырех дезоксинуклеотидов (АТФ, ТТФ, СТФ и ГТФ) и фермента термофильной ДНК-полимеразы проводят амплификацию вЂ” полимеразную цепную реакцию фрагмента бета-глобинового гена, где расположена мутация.

Амплификат у гетерозигот с мутацией

8-ro кодона состоит из двух комплементарных фрагментов ДНК, один из которых на два нуклеотида (-АА) короче другого; у гомозигот оба фрагмента короче на два нуклеотида по сравнению с нормой. Наличие

„„Ы2„„1801210 АЗ (54) СП О СО Б В Ы Я В Л Е Н И Я МУТА ЦИ Й 8-ГО

КОДОНА (-АА) БЕТА-ГЛОБИНОВОГО ГЕНА (57) Использование: медицинская биохимия. Сущность изобретения: выделяют клеточную ДНК, проводят ее амплификацию, амплификат разделяют электрофорезом, гель окрашивают водным раствором этидия бромида, а о наличии мутантного гена судят по появлению фракции длиной 200 кбаз. выпадения двух нуклеотидов (-АА) влияет на молекулярный вес, а также на заряд фрагмента гена вЂ” ДНК, что легко выявляется путем электрофореза на полиакриламидном геле. Амплификат разделяют на 8% полиакриламидном геле путем электрофореза, используя обычный режим (напряжение 150 В, сила тока 22 мА, время 1 ч). В качестве контроля используют также маркер вЂ” фаг X 174 разрезанный рестриктазой Нае ill, После электрофореза гель окрашивают 5 вЂ” 10 минут водным раствором этидиум бромида, Наличие дополнительной фракции в районе 200 кбаз свидетельствует о наличии мутантного гена с делецией двух нуклеотидов (-АА) в кодоне 8 бета-глобинового гена.

Интерпретацию результатов проводят следующим образом: у нормальных людей наблюдается наличие одной фракции с длиной 236 кбаз. свидетельствующей о нормальном состоянии обследуемого. Наличие одной фракции с длиной 200 кбаз свидетельствует о делеции двух нуклеотидов вЂ” о гомозиготности по данной мутации. У гетерозигот отмечаются две полосы с размера1801210

Формула изобретения

Способ выявления мутаций 8-го кодона (-АА) бета-глобинового гена, включающий выделение клеточной ДНК и ее амплификации, отл и ча ю щийс я тем, что,с целью ускорения способа, амплификат разделяют электрофорезом, гель окрашивают водным раствором этидий бромида и при наличии фракции с длиной пробега 200 кбаз выявляют мутацию 8-го кодона.

Составитель

Техред M.Ìîðãåíòàë

Редактор

Корректор Л.Пилипенко

Заказ 1190 Тираж Подписное

BÍÈÈÏÈ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул, Гагарина, 101 ми 236 кбаз (норма) и 200 кбаз (мутация 8-го кодона).

Упразднение процедур в прототипе: перенос амплифицированного фрагмента

ДНК на нейлоновый фильтр, предгибридизация, гибридизация с радиоактивным олигонуклеотидным зондом, приготовления этого зонда, ауторадиография значительно сокращает время определения мутации 8-ro кодона (-АА) бета-глобинового гена от 5 вЂ” 6 дней до 1 вЂ” 2 дней. При этом сокращается большое количество приборов и химреактивов с сохранением точности определения, Таким образом, предлагаемый способ с сохранением точности значительно ускорит и упростит определение мутации 8-ro кодона (-АА), что даст возможность получить достоверную информацию о молекулярном нарушении бета-глобинового гена, Пример 1, Обследуемый Адигезалов 20

Яшар (32 года) был обследован на носительство мутации 8-го кодона бета-глобинового гена. У обследуемого было взято 0,1 мл крови из пальца, выделена клеточная ДНК, амплифицирована, и проведен электрофорез 25 на полиакриламидном геле (8%) при 150 В, 22 мА, время 1 ч.

Выявлена мутация 8-го кодона (-АА) бета-глобинового гена, Пример 2. Адигезалова Парвана (30 лет) была обследована на носительство мутации 8-го кодона бета-глобинового гена. У обследуемой было взято 0,1 мл крови из пальца, выделена клеточная ДНК, амплифицирована и проведен электрофорез на 8% полиакриламидном геле, при 150 В, 22 мА, время 1 ч. Гель окрашен 5 вЂ” 10 мин водным раствором этидиум бромида, Выявлена мутация 8-го кодона (-АА) бета-глобинового гена, 40

Пример 3. Адигезалов Малик (8 лет) был обследован на гомозиготное носительство мутации 8-го кодона бета-глобинового гена, У обследуемого был взят 0,1 мл крови из пальца, выделена клеточная ДНК, ампли- 45 фицирована и проведен электрофорез. В отличие от родителей Адигезалов Малик имел гомозиготное носительство мутации 8-го кодона бета-глобинового гена. На электрофо-. реграмме после окрашивания этидиум 50 бромидом выявлена одна полоса ДНК с длиной 200 кбаз, соответствующая гомозиготности мутации

Пример 4, У Адигезаловой Парваны при сроке беременности 10 недель были взяты ворсинки хориона (клетки плаценты) с целью пренатальной диагностики плода.

Из ворсин хориона была выделена клеточная ДНК, амплифицирована и проведен электрофорез. После электрофореза полиакриламидный гель был окрашен водным раствором этидиум бромида, На электрофореграмме были выявлены две полосы амплификата длиной 200 и 236 кбаз соответствующий гетерозиготному носительству мутации 8-ro кодона. Данная беременность была сохранена, После рождения у новорожденного была взята пуповинная кровь в количестве 0,1 мл. Выделена клеточная ДНК, амплифицирована и проведен электрофорез на 8% полиакриламидном геле, при напряжении 150

В, силе тока 22 мА, времени 1 ч, Окрашивали водным раствором этидиум бромида, На электрофореграмме выявлены две полосы с длиной 200 и 236 кбаз, что свидетельствует о гетерозиготном носительстве мутации 8-го кодона у новорожденного.

Этот анализ полностью подтвердил результат, полученный при пренатальной диагностике, Таким образом, предлагаемый способ с сохранением точности значительно ускоряет и упрощает выявление мутации 8-го кодона (-АА), что дает пренатально (внутриутробно) и постнатально (после рождения) возможность получить достоверную информацию о молекулярном нарушении бета-глобинового гена,

Способ выявления мутаций 8-го кодона (-аа) бета-глобинового гена

Способ измерения фотолюминесценции биологических тканей // 1800897

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при флюоресцентной диагностике

Способ оценки регенерации костной ткани при удлинении костей // 1800364

Способ определения иммунодепрессивного состояния у лиц, подвергающихся действию малых доз ионизирующей радиации // 1800363

Способ измерения секреторной способности слизистой оболочки желудка и устройство для его осуществления // 1799470

Способ выбора химиотерапии при опухолях вульвы // 1798692

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для выбора химиотерапии при опухолях вульвы

Способ выбора химиотерапии при опухолях легких // 1798691

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при биохимическом определении чувствительности злокачественных опухолей к комбинациям химикопрепаратов

Способ определения индивидуальной чувствительности к бета- адреноблокаторам больных гипертонией // 1798690

Способ диагностики патологии красных клеток крови // 1798659

Изобретение относится к лазерной медицинской технике, а точнее к оптическим and ИИ меким способам определения размеров и состояния клеток в цитологии, преимущественно клеток крови

Способ диагностики системных заболеваний соединительной ткани // 1797062

Способ контроля состояния сельскохозяйственных и пищевых веществ или лекарственного препарата и устройство для его осуществления // 2100805

Способ определения в пробе цельной крови распределения вероятностей в популяции эритроцитов их подмножеств и устройство для его осуществления // 2100807

Способ определения гетероциклических нитросоединений в биологическом материале // 2100808

Способ выявления лимфоидных узелков в тотальных анатомических препаратах // 2101699

Изобретение относится к медицине, а именно к анатомии, топографической анатомии, патологической анатомии и может быть использовано для изучения лимфоидных узелков в тотальных анатомических препаратах макромикроскопическом поле видения в норме, в возрастном аспекте, в эксперименте и патологии

Способ ионного парамагнитного резонанса на нервном волокне // 2101700

Изобретение относится к медицине, в частности к способам неинвазивной диагностики функционирования биологических мембран и соответствующей оценке метаболических процессов в организме на клеточном уровне

Способ прогноза хронического рецидивирующего течения заболевания у лиц, перенесших первичную рожу // 2101701

Изобретение относится к медицине, а именно инфекционным болезням и дерматологии, и может найти применение как в стационарных, так и поликлинических условиях

Способ определения реактивного лизиса клеток // 2101702

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии, и может быть использовано для определения реактивного лизиса клеток в содержащей комплемент биологической жидкости в клинической практике и в научных исследованиях

Способ определения наличия активности воспалительного процесса при ревматоидном артрите // 2101703

Изобретение относится к медицине и предназначено для оценки активности воспалительного процесса при ревматоидном артрите путем биохимического исследования сыворотки крови

Способ дифференциальной диагностики миокардита и миокардитического кардиосклероза // 2102749

Устройство для локального подведения биологически активных веществ // 2102750