"способ получения основы микробиологических сред и питательная среда "автофизат" для культивирования микроорганизмов"
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
- - -lЩ„ д "1 Rteej-; ЧО
Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5031795/13 (22) 11.03.92 (46) 15.10.93 Бюл Ns 37-38 (76) Ермишина Инна Георгиевна; Власова Татьяна
Федоровна; Савин Владимир Николаевич (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕД И ПИТАТЕЛЬНАЯ
СРЕДА "АВТОФИЗАТ" ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Использование: микробиология, касается способа получения основы микробиологических сред. создания новой питательной среды "Автофизат" для культивирования микроорганизмов и может быть использовано в медицинской и технической микробиологии, молочной промышленности и ветерина— рии. Сущность изобретения: измельченные внутренние органы промысловых рыб смешивают с водой в массовом соотношении 1: 1,5, выдерживают при 40 — 42 С в щелочной зон рН 7,6 — 8,0 в присутствии хлороформа при перемешивании в течение 2 — 2,5 сут с последующим прогреванием при
90 С в течение 5 — 10 мин, осаждением высокомолекулярных соединений в изоэлектрической точке белка, отделением нераэгидролизованных белков и высушиванием конечного продукта. Сущность (19) RU (11) 2001101 С1 (51) 5 C12N1 20 изобретения: питательная среда "Автофизат" содержит гидролиэат внутренних органов промысловых рыб, лактозу, натрий хлористый, агар и дистил— лированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л: гидролизат внутренних органов промысловых рыб с содержанием аминного азота
100 — 140 мг% 20,0 — 25,0; лактоза 95 — 10,0, натрий хлористый 4,5 — 5,0; агар 0,65 — 0,70; вода дистиллированная остальное. Для увеличения размеров колоний используют модифицированную питательную среду "Автофизат", которая дополнительно содержит пелтон в количестве 14,5 — 15,0 г/и Описанный способ получения основы микробиологических сред позволяет упростить процесс за счет исключения использования дорогостоящих ферментов, а также снизить себестоимость конечного продукта за счет использования дешевого отечественного сырья — белоксодержащих неутилизируемых непищевых отходов рыболовных промыслов. Предлагаемая питательная среда "Автофизат" проста в изготовлении, содержит доступные отечественные компоненты, обладает свойствами эталонных сред для выращивания бифидобактерий и лактобацилл 2 с и1 злф-лы3 табл.
2001101
11,8 -0,10
43,4 + 0,05
12,2 0,10
21,7 - 0,15
28,8 0,10
136 020
19,5 + 0,05
21,1 + 0,10
16,2 «0,05
32,5 «+0,10
17,0 «- 0,10
23,0 + 0,15
23,5 «0,10
9 2 +0,15
14,1:" 0,10
0,033
2,0
2,0
Изобретение относится к микробиологии, касается усовершенствованного способа получения основы микробиологических сред и создания новой питательной среды
"Автофизат" для культивирования микроорганизмов и может быть использовано в медицинской и технической микробиологии, молочной промышленности и ветеринарии.
Известен способ получения основы питательных сред для культивирования микроорганизмов путем гидролиза кильки панкреэтическими ферментами в щелочной среде в присутствии хлороформа при 50ОС в течение суток, остановкой гидролиза прогреванием, осаждением нераэгидролизованных белков и высушиванием конечного продукта. Ферментативный гидролиэат содержит не менее 18 аминокислот, Однако указанный процесс получения основы микробиологических сред включает использование пищевого продукта — кильки и дефицитных панкреатических ферментов — источников получения медицинских препаратов.
Целью изобретения является упрощение технологии процесса получения основы микробиологических сред и снижение себестоимости конечного продукта за счет использования непищевого отечественного сырья и проведения процесса без внесения протеолитических ферментов, а также создания новой простой в приготовлении питательной среды "Автофизат" для культивирования микроорганизмов.
Сущность изобретения заключается в том, что измельченную белоксодер>кащую массу (гомогенат), состоящую из внутренних органов промысловых рыб, смешивают с водой в массовом соотношении 1;1,5, выдерживают при 40-42 С в щелочной зоне рН 7,6 — 80 в присутствии хлороформа при перемешивании в течение 2 — 2,5 сут с последующим прогреванием биомассы при 90 С в течение 5 — 10 мин, осаждением высокомолекулярных соединений в иэоэлектрической точке белка и высушиванием конечного продукта. Полученный гидролиэат имеет следующие физико-химические характеристики: — тонкодисперсный порошок, гидроскопичный, светло-желтого цвета с характерным запахом без гнилостного; — рН 1 -ного раствора 5.5-6,5; — растворимость не менее 57;; — массовая доля влаги не более 5 ; массовая доля общего азота 10,0 — 11,0 ; — массовая доля аминного азота 5,5-6,57; — аминокислотный состав 1 -ного раствора (мг ):
55 изолейцин лейцин валин треонин серин метионин тирозин фенилаланин аспарагиновая кислота глутаминовая кислота пролин глицин аланин лизин
Гистидин аргинин
0,05 триптофан 0,19 +0,05.
В качестве сырья для получения основы микробиологических сред используют белоксодержащий непищевой неутилизируемый отход рыболовного промысла — внутренние органы промысловых рыб.
Объектом изобретения является также питательная среда для культивирования микроорганизмов.
Известна питательная среда для выращивания микроорганизмов, например бифидобактерий, содержащая в г/л; пептон 8,0-9,0 лактазу 9,0-10,0
L-цистин солянокислый 0,1 — 02 питательный бульон сухой 12.0 — 13,0 экстракт кормовых дрожжей 7,0-8,0 аминокровин 150- t80 вода дистиллированная до 1 л.
Однако данная питательная среда (ПС) многокомпонентна, содержит трудноподдающиеся стандартизации ингредиенты (экстракт KOpMOBbIX a>K>Ke, BMMHOKpOBMH), что существенно снижает воспроиэводимость результатов. Недостатком этой ПС является также сложная технология приготовления, дорогостоящие ингредиенты, дефицитные пищевые продукты. Б условиях биотехнологического производства при использовании больших количеств микробной биомассы использование данной
ПС нерентабельно.
Для выращивания лактобацилл известна питательная среда Рогозы, содержащих в г/л: пептон 10,0 мясной экстракт 10,0 дрожжевой экстракт 5,0 глюкозу 20,0 калий фосфорнокислый двуэамещенный натрий ацетат U0110 I
10 аммоний цитрат 2,0 магний сернокислый 0,2 марганец сернокислый 0,05 твин-80 1 мл воду дистиллированную до 1 л.
Питательная среда Рогоэы многокомпонентна, включает нестандартизованное сырье (мясной экстракт, дрожжевой экстракт) и в условиях биотехнологического производства нерентабельна.
Для выращивания лактобацилл известно также использование питательной среды
МРС-1, содержащей те же компоненты, что и предыдущая ПС, но вместо мясного экстракта в ней использован гидролизат молока.
Однако данная ПС также многокомпонентна, содержит трудноподдающиеся стандартизации пищевые ингредиенты (дрожжевой экстракт, гидролизат молока), что существенно снижает воспроизводимость результатов.
Недостатком ПС является сложная технология приготовления, использование дорогостоящих компонентов, дефицитных пищевых продуктов. В условиях биотехнологического производства, где требуется большое количество ПС для получения микробной биомассы, нерентабельна.
Наиболее близкой к предложенной среде является ПС Блаурокка для выращивания бифидобактерий. содержащая в г/л: натрий хлористый 5,0 пептон 10,0 лактозу 10,0
1 -цистин 0,1 агар 0,75 печеночный отвар до 1 л.
Вышеприведенная ПС также является многокомпонентной, содержит печеночный отвар, исто сник сырья которого нестандартизован и является дефицитньил пищевым продук1ом. Технология приготовления ПС сложна, о условиях биотехнологического производства такая среда нерентабельна, Сущность объекта изобретения заключается также в том, что питательная среда
"Автофизат" в качестве питательной основы содержи гидролизат внутренних органов промысловых рыб, а также лактозу, натрий хлористый и агар при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды: гилролизат внутренний органов промысловых рыб с конечной концентрацией аминового азота 100-140 мг 20,0-25,0 лактоза 9,5-10,0 нлтг ий хлористый 4,5-5,0 агар 0,65-0,70
Для увеличения размеров колоний предпочтительно испольэовать модифицированную питательную среду "Автофиэат", которая дополнительно содержит пептон в количестве 14,5 — 15,0 r/ë дистиллированной воды. Питательная среда "Автофизат" имеет следующие физико-химические характеристики: — концентрация водородных ионов (рН) 6,8-7,0 — аминный азот 100 — 140 мг7, — влажность (сухой формы) не более 7
Пример 1. Внутренние органы промысловых рыб (карпа, сома, осетровых и др.) промывают проточной водой, измельчают, разводят дистиллированной водой в массовом соотношении 1;1,5 и проводят гидролиз при 40 С в щелочной зоне рН 7,8 в присутствии хлороформа (1,5 об, ) при перемешивании в течение 2 сут, В первые сутки гидролиза строго поддерживают рН реакционной смеси, Гидролиз прекращают прогреванием при 90 С в течение 8 мин, при этом коагулируют и выпадают в осадок неразгидролизованные белки, Оставшиеся в надосадочной жидкости высокомолекулярные соединения осаждают в иэоэлектрической точке белка, надосадочную жидкость фильтру от, затем подвергают высушиванию в потоке горячего воздуха в аппаратах, используемых для получения сухого молока.
Режим высушивания (на входе 150 — 160 С и на выходе 90 — 95 С) обеспечивает получение сухого препарата с остат-..;;ой влажностью не более 5,0 .
Повышение темпера уры процесса гидролиза до 42 С, увеличе,.;,; зоны рН до 8,0 и времени процесса до 2,5 сут на влияют на конечные физико-химические характеристики целевого продукта.
Пример 2. Подобрана концентрация полученного по примеру l гидролизата внутренних органов промысловых рыб, 1спользуемого в качестве основы питательной среды, и компонентов среды — лактозы, натрия хлористого и агара, обеспечивающие оптимальные условия роста бифидобактерий и лактобацилл, Использованы следующие штаммы: В,bifldum-производственный
Мт 1, 791, Л ВА-3; L-plantarum 8-РА-З, L.plantarum 8 — РА — 3, 1 .plantarum-38
L.permentum-39. Результаты исследования представлены в табл. 1.
Как видно из табл, 1, питательная среда на основе гидролизата внутречних органов промысловых рыб при его концентрации в среде от 20 до 30 г/л и концентрациях лактазы — 9,75 г/л, натрия хлористого — 4,75 r/л, агара — 0,68 г/л обеспечивают оптимальные
2001101
20 ус овия для культивирования бифидобактерий и лактобацилл, Ростстимулирующие свойства этой среды находятся на уровне ростстимулирующих свойств известных питательных сред.
Причем при концентрации гидролизата 30 г/л рост бифидобактерий и лактобацилл аналогичен росту бифидобактерий и лактобацилл при добавлении в ПС гидролизата в концентрации 25 г/л, При концентрации гидролизата 15 г/л количество биомассы не уменьшается, однако размер колоний мельче, следовательно оптимальная концентрация гидролиэата внутренних органов промысловых рыб в составе ПС 20-25 г/л.
Пример 3, Подобраны концентрации лактоэы, натрия хлористого, агара и пептона в составе ПС для культивирования бифидобактерий и лактобацилл.
Концентрации компонентог отрабатывали на шести вариантах ПС, Использованы штаммы B,bifidum 791 и L plan>arum 8-РА—
Из полученных результатов, представленных в табл. 3, видно, что питательная среда на основе гидролиэата внутренних органов промысловых рыб по вариантам ПС с 1 по И! обеспечивает оптимальные условия культивирования для бифидобактерий и лактобацилл, не отличающихся от контроля, добавление в зту ПС пептона в количествах, указанных в табл. 2 (ПС по вариантам с IV по Vl), увеличивает размеры колоний микроорганизмов при том же количестве биомассы. Таким образом, оптимальные соотнош.ния компонентов в описываемой
ПС "Автофизат" для культивирования бифидобактерий и лактобацилл следующее, г/л дистиллированной воды: лактоза 9,5 — 10,0 лактоза 9,5 — 10,0 натрий хлористый 4,5-5,0 натрий хлористый 4,5-5,0 гидролизат внутренних органов промысловых рыб 20,0 — 25,0 гидролизат внутренних органов промысловых рыб 20,0-25,0 агар 0,65 — 0,70 агар 0,65 — 0,70 пептон 14,5-15,0
Пример 4, Питательную среду "Автофизат" приготавливают следующим образом; к 22,5 г гидролиэата внутренних органов промыслов рыб добавляют 9,75 г лактозы, 4,75 г натрия хлористого, смесь растворяют в 700 мл дистиллированной воды, затем к ней добавляют 0,68 r агара, растворенного в 200 мл воды, общий объм доводят дистиллированной водой до 1 л, 25
Тщательно перемешивают, устанавливают рН раствора 7,0-7,2 и подвергают стерилизации при 110 С в течение 20 мин (автоклавирование). После стерилизации рН питательной среды снижается и становится равным 6,8-7,0.
Пример 5. Модифицированную среду
"Автофизат" готовят следующим образом: к
22,5 г гидролизата внутренних органов промысловых рыб добавляют 9,75 г лактазы, 4,75 г натрия хлористого, 14,5 г пептона, смесь растворяют в 700 мл дистиллированной воды, затем к ней добавляют 0,68 г агара, растворенного в 200 мл воды, общий объем доводят дистиллированной водой до
1 л. Тщательно перемешивают, устанавливают рН раствора, равное 7,0-7,2, и подвергают стерилизации при 110 С в течение 20 мин (автоклавирование), После стерилизации рН питательной среды 6,8 — 7,0.
Пример 6. Проведено изучение влияния ПС "Автофизат", состав которой представлен в примере 4, на культурально-морфологические признаки производчтеенных штаммов В.bifidum М 1, 791, ЛВА-3, В мазках культур, выросших в высоком столбике ПС "Автофиэат", микробы представляют собой грамположительные палочки, характерным признакам которых является раздвоение концов, Часто палочки образуют скопления, напоминающие китайские иероглифы или оленьи рога. При выращивании на ПС "Автофиэат" при температуре 37,5-38,0 С в первые сутки не обнаруживается роста, через 2 — 3 сут формируются колонии бифидобактерий в виде гвоздиков или комет, находящихся во взвешенном состоянии. При испытании модифицированной ПС "Автофизат" (добавление пептона) обнаружено, что размер регистрируемых колоний бифидобактерий более крупный (пример 5).
Изучено также влияние ПС "Автофизат" (состав указан в примере 4) на культурально-морфологические особенности лактобацилл (L.plan 37,5 — 38,0 С в первые сутки наблюдается появление точечных колоний, через 2-3 сут организмы образуют кометообразные колонии. Таким образом, описываемый способ получения основы микробиологических сред (на основе гидролиэата внутренних ор2001101 Таблица 1 Количество биомассы бифидобактерий и лактобацилл в ПС на основе гидролизата внутренних органов промысловых рыб в сравнении с контрольной ПС 8.0 10 5,0 10 5Я 109 3,0 10 L. plantarum 38 L. fermentum 39 В. blfidum произв.¹1 В. bifidum 791 Р а в 3! ы (1 v о1 I ò р Г i ë," ?0.0 В. blfidu г,гное промысловых рыб) предусматривает испольэо ание дешевого отечественного сырья — белоксодержащих неутилиэируемых непищевых отходов рыболовных промыслов, имеющихся в стране в больших количествах (тысячи тонн), процесс технологически прост, так как исключает использование дорогостоящих ферментов, предусмотренных способом-прототипом, Описываемая питательная среда "Автофиэат" проста в изготовлении, содержитдоступные отечественные компоненты, не требует дорогостоящего оборудования для своего изготовления, обладает свойствами эталонных питательных среддля выращивания бифидобактерий и лак го(,ац п .л. (56) Справочник по микробио 10ги4еским питательным средам, Под редакциеи 5 M.M.Ìåäæèäîâà, Махачкала, 1989, с. 104. Авторское свидетельство № 1513029, кл. С 12 11 1/20, 1988, De Мап Р,S.Rogosa, M.Sharpe М.Е.. J.AppL Bacterlol, 1960, № 23, р. 130-135. 10 ЛенцнерА.А., Лабораторноедело, 1967, ¹ 5, с. 301 — 302. Лизько Н,Н., Шилов B.Ì„Ëàáîðàòîðное дело, 1979, № 7. с. 430-433. 2001101 Продолжение табл. 1 Таблица 2 Составы ПС, использованные для выбора оптимальных концентраций при выращивании бифидобактерий и лактобацилл ставлена в средних значениях, полученных на основании данных примера 2. 2001101 Таблица 3 Количество биомассы бифидобактерий и лактобацилл в ПС "Автофизат" в сравнении с эталонными ПС Варианты ПС Би и обакте ии Лактоба иллы Содержание КОЕ/мл/абс.числах/-сред из т ех опытов Размер колоний Содержание КОЕ/мл/абс.чисРазмер колонийй лах/-сред из т ех опытов 5,0 10 3,0 10 6,0 10 2,0 10 Равен контролю 5,0 10 9,0 10 7,0 10 8,0 10 Равен контролю > ° ° > Несколько крупНесколько крупнее нее 7,0 10 3,0 10 4,0 10 6,0 10 Контроли: П С.Блаурокка ПС МРС-1 4,0 10 8.0 10 1-2мм 1-2мм Формула изобретения CI IOCOI ПОЛУЧЕПИЯ ОСI!ОВЬ1 МИКРОБИОЛОГИЧГСКИХ СГЕД И ПИТЛТГЛ!>ИЛЯ СРЕДЛ "ЛВТОФИзлг для КУЛ!>ТИВИРОВЛ!!ИЯ МИКРООРГЛ! !ИЗМОВ 1. Способ получения основы микробиологических сред, предусматривающий измельчение белоксодержащего сырья промысловых рыб, гидролиз полученного гомогената в щелочной зоне в присутствии хлороформа при нагревании, последующее прогревание биомассы, осаждение неразгидролизованных белков и высушивание, отличающийся тем, что в качестве белоксодержащего сырья используют внутренние органы промысловых рыб, гомогенат которых смешивают с водой в массовом соотношении 1: 1,5, и гидролиз ведут при 4042 С в течение 2 — 2,5 сут. а прогреваниепри 90 С в течение 5 - 10 мин. 2. Питательная среда для культивирогания микроорганизмов, содержащая питательную основу, лактозу, натрий хлористый, агар и водную основу, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит гидролизат внутренних органов промысловых рыб с содержанием аминного азота 100- 140 мг,, а в качестве водной основы - воду дистиллированную при следующем соотношении компонен5 тов, г/л: Гидролизат внутренних органов промысловых рыб с содержанием аминного азота 100-140 мг,ь 20,0 - 25,0 R3KTQ33 9,5 — 10,0 Натрий хлористый 4,5-5,0 Агар 0,65 — 0.70 Вода дистиллированная Остальное 3, Питательная среда Го п,2, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит пептон в количестве 14,5- 15,0 г/л, 
