N-(гидроксибензил)аминокислоты или их йодпроизводные

 

(пользование: в медицине как диагностические и лекарственные вещества Сущность изобретенияпродукт гидроксибензил) аминокислоты или их йодлроизводные формулы 1 или разветвленный углеводородный радикал, R - Н. 124 125Ш 1, I. I или . I, ОН-группа находится во 2 или 4 положении ароматического ядра. Реагент 1: 2- или 4-гидроксибензальдегид Реагент 2: аминокислота формулы II: NH R СООН, где R имеет укаг занные значения Условия реакции: в протонных полярных растворителях Реакционную смесь затем восстанавливают боргидридом натрия. Йодпроизводные формулы 1 получают иодированием соединений формулы 1. где R - Н. 2 табп, 7 ид

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ н ин-я -соон т

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам

Щ 5641620/04 . (22) 26,0392

: (46) 16.1193 Бюл. Йв 41-42 (Уф Московский институт тонкой химической технологии им.М.ВЛомоносова

P2) Лурье ЕЮ.; Каеун АП; Кулаков В.Н„Матвеев

ВА; Швец 8И (УЗ) Московский институт тонкой химической тех-. нологии им.М.ВЛомоносова (54) тт- (ГИДИЖСИБЕНЗИй)АМИНОКИСЛОТЫ

ЮЗИ ИХ ИОДПРОИЗВОДИЫЕ (5У) Иатользование: s медицине как диагностические и лекарственные вещества Сущность изобретения; продукт Й-(гидроксибензил) аминокиототы или их йодпроизводные формулы

Ф (19) RU (1Ц (5Ц 5 С67С227 12 А61 К 31 195

СО7859 00 или разветвленный углеводородный радикал, R — Н, ! или . I, OH-группа находится во 2 или т23 т25 т31

4 положении ароматического ядра. Реагент 1: 2или 4-гидроксибензальдегид- Реагент 2: аминокислота формулы II: NH R СООН, где R имеет указанные значения..Условйя реакции: в протонных полярных растворителях Реащионную смесь затем восстанавливают .боргидридом натрия. Йодпроизводные формулы 1 получают иодированием соединенийформупы1,где R — Н. 2табл,7ил.

2002733

@-сон н и „ @-си= н-я,ооон) (О . (Ii) И зобретение относится к новым произ- дов щелочных металлов получают радиоакводнымаминокислот, аименнокЬЦгидрокси- тивные аналоги соответствующих иодпробензил)аминокислотам и.их иодпроизводным изводных Щгидроксибензил)аминокислот с общей формулой (N), меченные радионуклидами иода 1231

5 1251 или 131I. Электрофильное иодирование можно проводить любыми методами.

Ъ 1 1 i JЛlу ч IшIIIиtrе e рpеeзsу лarь тTаeт ы, особенно при получении

О радиоактивных иодпроизводных И-(гидроксибензил)аминокислот (Рl) (радиохимический выгде R -остатокуглеводородалинейнойили 1Î ход 97-99® получают при использовании

I разветвленной структуры; потенциалствтического электрохимического и - H или l, гидрОксильнэя группа вО 2 иодирования на платиновом аноде.

Или 4 положении ароматического. кольца, s й-(Гидроксибензил)аминокислоты (ill}— качестве субстрэтов ферментов р -окис- бесцветные кристаллические вещества, усления и Рад оактивных мэреров, облэдэк»- 15 Йчивые ПРИ хрэнен Они огРаничено õ антиокисл„тель„ой актив„»Стью . РаствоРимы в воДе, РаствоРимость солей с

ПотПатЕНтиой И НауЧНОй ЛИтЕРЭтурЕ НЕ +e"ОЧНЫМИ М таЛЛЭМИ ВЫШЕ. Я-(ГИДРОКСИ было выявлено соединений „Оторые явля„бензил)аминокислоты (Ю) лучше Раствор мы s спирте, хуже — в ацетоне, лись бы субстрэтами феРментов ф . кис-. 2{} диметилформэв иде и диметилсульфоксиде.

Облэдэ".»щими энт !Окис"ите"ь О". иодпроизводные м-(гидроксибензил)ами.активностью, и РаДиоэктивными маркера" нокислот (٠— кристаллические вещества светло-желтого цвета. Плохо растворимы в воде. лучше в спирте и хорошо в ацетоне. Мх g водорастворимого g+cqpggg. Фермен 25 солйс щелочнь|ми металлами растворимы в тов P -окисл@ниЯ жиРных, кислот, и водных растворах с РН выше 7 0

Рэдиозктиэного. Маркера. Йостэвлейиэй зэ- . П Р и м е р 1. Й-(Гидроксибензил)аминодэча Решэетая синтезом новога класса эми-. Ил„ты (Н1} нокислот и Нх иодЩюизвОДнык., . К Раствору- 4,8 ммоля гидроксибензальй-(Гидроксибензил)аминокислоты (Иф % сегида ® в 10 мл метанола добавляют 4,8

"олУчэюг "Оиденс ""ей эми".Ок"с".От®с ": ммоля аминокислоты(Щ, суспендированной

< О гиДРОкси1»внзэльДегиДом. 6) с ггосле... в 4 мл метанола. После 10 ч перемешивадующим востаиавле е 06Рзуещя мы к Реакционной массе добавляют 0,182 г снований Шиффа боРгиДРИДОм натрию.: (4 8 ммоля) тетрагидроборэта натрия рас

Иодпроизвадные Й-(гидроксибеизил)ами= 3Q творениого в 4 мл воды с несколькими капнокислот (1ч). получак»т электрофильным лями концейтрированной щелочи, После 2 ч иодиРованием Указанных аминокислот(и ). перемешивания реакционную массу титруКонденсацию аминокислот (И} с бев- ют 3Щ соляной кислотой до РН 6,5-7,0. ВызальДeгиДОМ .(l), содержащим гиДРокеиль- павший" осадок отфильтровывают, нУю гРУппУ вы и- или о-положении, 40 промывают метанолом и сушат в вакууме. осУщвствлЯют в пРОтонных положих РВС- Получают К-(гидроксибензил)аминокисло- р- - Л - р-у-- (" вы ты(Щ)в виде белого кристаллического вещеше 50 (,) получают, проводя конденсацию в с .ва Выход метаноле. й-(гидроксибензил)аминокислот (Ш) состав45 ляет 50-70 . Свойства некоторых полученных веществ приведены в табл. 1, Пример 2. И-(2-Гидрокси-3,5-дииодбензил)аминокислоты (В), А. Действие монохлористого иода.

50 К 2,5 .10 M раствору N-(гидроксибензил)аминокислоты (ill) в 0,1 мл 001 н. едкого

-- @Гс + """ соон - Я-с + -н>- гсоон, натра добавляют 4,9 мл 0,15 М фосфатного цу буферного раствора с рН 7,8 и приливают порциями по 0,015 мл раствор монохлори55 стого иода (0,1 н. по соляной кислоте и 0,03 н. по монохлористому иоду) при перемешивании на магнитной мешалке. Полученное .Данные приведены ниже, иоднопроизводное (IV) выделяют из раствоИодированием соединений (tll) в "ри ра подкислением реакционной смеси 1 н. сутстеии Райионуклийое иойа а еияе иойи- соляной кислотои, а затем лерекристалли2002733 зовывают из метанола. Получают 95-97ф, иодпроизводного (IV) в виде кристаллического вещества светло-желтого цвета. Ха- рактеристика некоторых из полученных соединений представлена в табл. 1.

При получении меченных радионуклидами иода иодпроиэаодных й-(гидр ксибенэил)аминокислот (III) к 2,5 10 M раствору аминокислоты (III) в 0,15 M фосфатном буферном растворе, рН 7,8 добавляют

0,1 мл. раствора радиоактивного иодида калия без носителя, общей радиоактивностью

0,1-0,2 мКю (37-74 МБк). после чего к полученной смеси прибавляют порциями по

0,015 мл (3 раза) раствор монохлористого иода указанной выше концентрации. Радиохимический выход — 95-06 f, концентрация иодпроиэводного (IV) — 0,05-0,1 .

Б. Электрохимический метод, В электрохимическую ячейку, вместимостью 10 мл, снабженную платиновым ка тодом (проволока диаметром 0,5-1,1 мм) и анодом (платиновый тигель) вносят 5 мл

2,5 10 М раствора N-(гидроксибензил)аминокислоты (Ш) в 0,15 М фосфатном буферном растворе с рН 7,8, содержащем избыток иодида натрия (0.005-0,010 мл 0,01

М раствора). К электрохимической ячейке через токопроводящую трубку диаметром

1-2 мм с капилляром на конце и заполненную 0,15 M фосфатным буферным раствором с рН 7,8, подсоединяют электрод сравнения и пропускают через ячейку ток, задавая с помощью потенциостата величину анодного потенциала, равную 0,52 В, относительно хлорсеребряного электрода.

Через 50 мин раствор подкисляют 1 н. соля, ной кислотой-и выпавший осадок перекристаллизовывают из метанола. Выход иодпроизводных (! V) — 98-99 (.

Для получения радиоактивных маркеров, меченных радионуклидами иода 1231, 1251 или 131г,- в реакционную смесь перед электролизом вносяг 0,1 мл раствора иодида соответствующего радионуклида без но. сителя общей радиоактивностью 0,1-0,2 мКю(37-74 МБк), после чего электролиз ведут в течение 50 мин. Радиохимический выход—

97-99, содержание моноиодпроизводного0,5-1,5%, концентрация иодпроизводного(И) — 0,05-0,01%.

Пример 3. Антиокислительные.свойства Щгидроксибензил)аминокислот (Ш) и, их иодпроизводных (IV), Антиокислительные свойства аминокислот (!! I, IV) демонстрируют на различных дисперсиях их яичного фосфатидилхолина (липосомах и мицеллах), Параллельно для сравнения провсдят эксперименты с известными ингибиторами перекисного окисления липидов: фенаэаном (3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)про

5 пионовая кислота) и бутилоксианизолом (2,6-ди-трет-бутил-4-метоксифенол) в тех же концентрациях.

Получение фосфолипидных дисперсий, Моноламеллярные липосомы, 10 -ный

10 раствор фосфатидилхолина в метаноле быстро впрыскивают через тонкую иглу в глицил-глициновый буфер (0,1 М, рН 5,5), содержащий 0,15 М хлористого калия. Конечная концентрация фосфатидилхолина в

15 смеси — 0,25 (. После 2 ч перемешивания получают систему моноломеллярных липосом.

Малые: моноламеллярные липосомы.

Приготовленную, как описано выше, смесь

20 озвучивают на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т (44 кГц) порциями по 5 мл в течение 90 с с паузами по 15 с через каждые

30 с при охлаждении льдом, После озвучивания получают малые моноламеллярные

25 липосомы.

Мультиламеллярные липосомы. Упаренный метанольный раствор фосфатидилхолина диспергируют в глицил-глициновом буфере (0,1 М, рН 5,5) в 0,15 М растворе

30 хлористого калия и встряхивают в течение 1 ч. Конечная концентрация фосфатидилхолина в буфере — 0,25 .

Мультиламеллярные липосомы со встроенным веществом. Упаривают фосфа35 тидилхолиновый раствор в метаноле в смеси с водным раствором вещества, Остаток диспергируют в глицил-глициновом буфере (0,1 М, рН-5,5) в 0,15 M растворе хлористого калия и встряхивают смесь в течение 1 ч.

40 Концентрация фосфатидилхолина в конечном растворе-0,25.ф, вещества -0,5 10 б М.

Мицеллярные системы при различных рН. Раствор 0,37 r (0572 ммоля) Тритона

Х-100 в 90 мл 0,2 М фосфатного буферного

45 раствора добавляют к 0,290 г (0,286 ммоля) фосфатидилхолина. Смесь встряхивают до полного растворения фосфатидилхолина и оставляют на ночь а холодильнике при температуре 40С. Для приготовления мицелл

50 используют фосфэтный буферный раствор

0,2 M с рН: 5.8, 6,8, 8,0. Конечная концентрация фосфатидилхоаина в буфере — 0,25 (.

Определвние накопления малонового

55 альдегида.

Полученные фосфолипидные дисперсии разливают в термостатированные ячейки, расположенные на магнитной мешал ке, .по

2 мл и инкубируют 3 мин при температуре

45 $. Затем в ячейки добавляют по 100 мкл

2002733 левой пробы в каждую ячейку приливают по 10 ляют 1,5 мл 0,5 $ раствора тиобарбитуровой 20

30 виях проявляет способность ингибировать 40 лей — гексан:эфир:уксусная кислота (90;10:2) 50

10 М раствора исследуемого соединения, растворенного в 5$-ном растворе соляной кислоты (за исключением случая мультиламеллярных липосом со встроенным веществом, куда добавляют 100 мкл 5$-ной соляной .кислоты); а в контрольные ячейки добавляют по 100 мкл 5 -ной соляной кислоты, а в ячейки с мицеллами — 100 мкл соответствующего буфера. После отбора ну 50 мкл индуктора окисления — аскорбата железа (Н), содержащего 10 M FeSO4 7НгО и 2. 10 M аскорбиновой кислоты. Пробы, объемом 200,мкл отбирают через каждые 30 мин.

Пробу вносят в пробирку с 1,5. мл 30 ного раствора трихлоруксусной кислоты и

30 мкл 0,1 M раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты, затем в пробирку добавкислоты, образующей окрашенный комплекс с малоновым альдегидом — продуктом перекисного окисления липидов. Пробы инкубируют ЗО мин при 80 С, охлаждают до

20 С и измеряют разницу поглошения растворов при длинах волн 535 нм и 567 нм на спектрофотометре..Эксперименты проводят в трех дублях, Результаты предс- валены в табл, 2.

Результаты исследования пок..-:зывают, что наибольшей антиокислитель; ой активностью обладают длинноцепочные производные Щгидроксибензил)аминокислот (5, 6) и.иодпроизводные (9). Характерным является также зависимость антиокислительных свойств синтезированных соединений оТ рН. Наибольшую активность соединения проявляют в среде с рН, равной изоэлектрической точке. Однопроизводные в этих услоперекисное окисление близкую к феназану.

Пример 4. Пятидесяти крысам внутривенно вводят 0,2 мл 0,1 -ного раствора аминокислоты (10), меченной 1251. Через 1, 5 и 15 мин после инъекции животных забивают и выделяют органы и ткани. Из биопроб липиды экстрагируют по методу Фолча и хроматографируют на пластинах "Силуфол" (Чехословакия) в системах растворитеи хлороформ:метанол .вода (65 .25:4). Радиоактивные вещества на хроматаграмме вилаляют методом авторадиографии c: помощью рентгеновских пленок, Затем каждую фракцию подвергают прямой радиометрии и рассчиты вают процентное содержание радиоактивного вещества в каждой фракции по отношению к общей радиоактивности всех выявленных веществ нв хроматограмме.

На фиг. 1 приведено распределение (125) аминокислоты (10) по еркулянтам липидов в печени крыс; на фиг. 2 — то же в плазме крови крыс; на фиг. 3 — та же, в

5 сердечной мышце крыс: на фиг, 6 — изменения характера выведения 1-гидроксибензиламинокислот в зависимости от длины цепи (количество вещества в неизменном виде в процентах к введенному через 5 ч); на фиг.

7- влияние N-(гидроксибенэил)аминокислоты (10) на интенсивность окисления (С)олеиновой и (4С)-стеариновой кислот в организме крыс. Изменение концентрации

- во времени (C)C0g в выдыхаемом воздухе, 4

5 в опасной группе животных, приведенное в . концентрации (C)COz в контрольной груп14 пе (опытная rpynrie — животные, которым внутрибрюаинно введены кислоты и Щгидроксибензил)аминокислоты (10), контрольные — только меченые кислоты). (фигЛ-5).

Результаты исследования показывают, что в печени, скелетных. и сердечной мышцах аминокислота (10} обнаруживается преимущественно в фосфолипидной фракции, в то

5 время как в плазме крови и легких распределение значительно более равномерное и имеет выраженную тенденцию к быстрому изменению, т.е. метаболически активны.

Пример 5. Беспородным крысам (по

5 животных в группе) вводят внутривенно по

0,2 ммл 0,17-ного раствора аминокислот (814). Собирают мочу животных в течение 6 ч после инъекции через каждый час. Мочу анализируют методом электрофореза на аце5 татцеллюлозной пленке (боратный буфер, рН 8,2, 350 В; 25 мин). В качестве свидетеля используются исходные кислоты, меченные

125>. Результаты анализа показывают, что кислота (9) выводится из организма в неизменном виде; Кислоты с более длинной цепью с четным числом атомов углерода (10, 13) превращаются в кислоты с меньшим числом атомов углерода, преимущественно в кислоту(9). Кислоты с нечетным числом ато5 мов углерода в цепи (11, 12) выводятся в виде кислоты (8). Таким образом, длинные кислоты (10-13) подвергаются в организме окислительному декарбоксилированию путем Р-окисления. Через 5 ч после введения кислот степень деструкции составляет 6080 (фиг:.6).

Пример 6. Десяти белым крысам . вводят внутрибрюшинно 20 мг N-(гидроксибензил)аминокислоты (3-5) в 0,2 мл физиоло5 гического раствора. Контрольным животным вводят физиологический раствор. Всех животных перед экспериментом не кормят в течение суток. Через 4 ч 5 животным вводят внутрибрюшинно 0,1 мл (1 Cjолеиновой кислоты в диметилсульфоксиде, 10

2002733 (56) Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты. Реакционная способность и эффективность. М.: Наука, 1988, с. 247.

Таблица 1

Свойства некоторых й-(гидроксибензил) аминокислот(1-7) и их иодпризводных (8- 14).

УФ, А

ПМР, м.д, м льтиплетность

Тпл.

Соединения

1.90 (3). 2,37 (3). 3.25 (1 ), 605(M); 640(M) 1.56 (М ); 2.15 (3 ), 2.66 (3 ), 3.80(1), 6.54(М), 6.92.(М) 0.86 (M),,1.05 (М ), 2.00 (3 ), 2.67 (3), 3.3.92 (1), 6.80 (M),, 7.00 (М ) 0.87 (Ы ), 1.19 (3 ), 2;00 { 3 ), 2.70 (3). 3.92 (1), 6.55 (М ), 6.94.(М ) 0.86 (М), 1.20 (М ), 1.20) M}, 1.92 (3 ), 2.60 (3 ), 3.80 { 1), 6.54 (М j, 6.90(М).

0.88(M),,1.22 (M), 1.96(3), 2;60(3).3.78(1), 6.56(М), 6.94(M) 0.61 { 3 ), 1.52 (М ), 353 (3 ), 3.85 1, 6.55 M 6,95 М

274 {2040)

214 (3740)

274 (2100)

214 (5700)

274 (2060)

214 (5750) 173174

187189

177178

274 (2000)

214 (5160) l65167

274 (2300)

214 (6000) 164274 (2200)

214 (6100) 150—

152

275 (2100 )

214 5600

> 230

Пяти другим животным вводят внутрибрюшинно (С)-стеариновую кислоту в таком

14 же объеме. Животных помещают в специальный прибор для измерения радиоактивности выдыхаемого воздуха. Измерения ридиоактивности проводили в течение 90110 мин для каждый опытной (5 крыс) и контрольной групп. Число зарегистрированных импульсов у животных опытных групп относят к такой же величине контрольной группы. Полученные результаты представлены на фиг. 7.

Окисление жирных кислот при введении длиноцепочечных аминокислот(5,6) замедляется; причем для ненасыщенных кислот(олеиновой) этот эффект более выражен. Т.о. показано, что как й-(гидроксибензил)аминокислоты ()И) (пример 7), так и их иодпроиэводные (IV) (пример б) с длиной цепи более 6 являются субстратами ферментов -окисления и т.о. ингибируют окисление природных жирных кислот 1и vivo, т.е. могут

5 служить маркерными соединениями для иэученияР-окисления в норме и патологии.

Некоторые представители этого ряда (5, 6, 7, 9) также являются водорастворимыми антиоксидантами(пример 3), т.е. могут быть

10 потенциальными лекарственными средствами при патологиях, связанных с высоким уровнем радикального окисления (лучевая болезнь, некоторые виды интоксикациКи т.п.).

2002733

ПМР, м.д. льтиплетность

Соединения

1ПЛ. 294 (2500)

225 (4220 )

294 (1700)

230 (10000)

295 (2000)

225 (5350 ) 173 (разл. ) 188189

172173

10.

308 (2900 )

229 (8400 ) 165167 (разл. ) 145 (разл. ) 314 (1500)

228(9200) 130 (разл. ) 294 (2000 )

228{6000)

147149

300 (1700)

224 5500

1.88(3), 2.35(3-), 317(1), 6.74{2), 6.95(2) 1,66(М), 2,18(3), 2.79(3), 3.71(1), 7.37(2), 7.89(2) 0.85(М), 1.24(М), 1..87(3), 2.64(3), 3.85(1), 7.18{2), 7.68 (2) 0,85(М), 1.24(М), 185(3), 2.57(3), 3.83(1), 7,20(2), 7,73 (2) О;85{M). 1.25(M), 1..80(З), 2.56(3), 3,73(1), 7.20(2) 7,62 (2) 086() 118(). 1.88(3), 255(3). 371(1). 721(2).

7.71(2) . 0.85(3), 1.75(<) 3.82(3), 4,10 1 7.31 2. 7.86 2

ПродоЛжение табл. 1

Продолжение табл, 1

13

2002733

Продолжение табл, 1

Таблица 2

Антиокислительная активность М гидроксибензиламинокислот, бутилоксианиэола (БОА ) и феноэана (водорастворимых антиоксидантов, контроль). Уменьшение количества маломанового эльдегида в фосфоливидных дисперсиях в присутствии N - гидроксибензиламинокислот, БОА. феноэана по отношению к фосфатидилхулину, в, Соединения(1-7) растворены s 5 DO в ОрО,(8-1)4-в СОзОО.

Соединения растворены в 5$ HCI.

Системы: А - нВпОН; СНЗСООН: Н О (4: 1: 1); В - СНС!з: MeOH: 20$NH40H (4: 2:0.5). С-СНС1з: MeOH: НгО {65:25:4 ) .

2002733

Продолжение табл, 2

Продолжение табл. 2

Продолжение табл, 2

2002733

Продолжение табл. 2

Продолжение табл. 2

Продолжение табл. 2

2002733

Ф о р и у л а и э о б р е т е н и я где В1 - остаток углеводорода линейной

И-(ГИД ОКСИБЕНЭИЛ)АМИНОКИСЛ """ Р"ветвленн, и стР " УРы:

ОТЫ ИЛИ ИХ ЙОДПРОИЗВОДНЫЕ общей формулы гидрокеильная группа находится во 2-и или 4-и положении ароматического кольца.

Н ИН-R -CGOH

2 f

Q33 )ЩАМ к-Фд(EH пттр

533 щфУЮЩ

ЮЗрарй Хатаер.

СЛ lgedaawnud

2002733

EZB xkecmep

ИЕИ тФигмц

ПЗ м ЦФУФР Я-Фм s4upa хоьесаир.

С3 фьсибмэУд.

2002733

И22х ольмер.

ИЗ афелгд.

СЖжирюг л-юг ии1 зфцж жи6Ржр.

С:3 Мсюалим

2002Т33

ЗРЮ, реА

Аи7

Составитель НХолубева

Редактор H.Ñèëüíÿ÷èíà Техред М,Моргепал Корректор МХерецман

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-ЭВ, Раушская иаб., 4/Ь

Заказ 3213

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. УжгОрод, уя. Гагарина, 101.