Фрагмент рнк x-вируса картофеля, предназначенный для усиления трансляции чужеродного гена

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии растений и животных. Сущность изобретения заключается в получении фрагмента РНК Х-вируса картофеля, обладающего широким спектром действия в отношении активации трансляции генов для повышения эффективности синтеза чужеродных белков в трансгенных растениях и животных. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии растений, и представляет собой фрагмент РНК Х-вируса картофеля, содержащий 5^l -нетранслируемую область генома и обладающий способностью усиливать трансляцию чужеродных генов в эукариотических системах.

Известен фрагмент геномной РНК вируса табачной мозаики (ВТМ) длиной 70 нуклеотидов (5^l-нетранслируемая последовательность, или ω -последовательность), являющийся одним из наиболее эффективных усилителей трансляции генов.

К недостаткам прототипа можно отнести следующее: описанный фрагмент РНК ВТМ эффективно усиливает трансляцию чужеродных генов не только в растительных, но и в бактериальных клетках, что может иметь нежелательные последствия в ходе генно-инженерных работ по трансформации растений, в частности это может вызывать преждевременный лизис бактериальных клеток из-за отравления их токсичными чужеродными белками.

Целью изобретения является получение фрагмента РНК Х-вируса картофеля, обладающего широким спектром действия в отношении активации трансляции генов для повышения эффективности синтеза чужеродных белков в трансгенных растениях и животных.

Для достижения поставленной цели сконструирован транскрипционный вектор на основе плазмиды pTZ19, в котором гены неомицин фосфотрансферазы 1 (НФТ 1) из транспозона Tn903 находился под контролем химически синтезированного фрагмента, несущего αβ -лидер и инициаторный кодон 5^l-проксимального гена РНК ХВК ( αβ-НФТ 1 конструкция). В контрольной конструкции КМ) гену НФТ 1 предшествовала нетранслируемая последовательность, представляющая собой модифицированный полилинкер плазмиды pTZ19. После линеаризации плазмид с помощью РНК-полимеразы бактериофага Т7 были получены соответствующие транскрипты. Их лидерные последовательности представлены на чертеже.

Для доказательства действия полученного фрагмента РНК некэпированные транскрипты обеих плазмид транслировали в бесклеточных белоксинтезирующих системах из ретикулоцитов кролика, клеток асцитной карциномы Кребс-2 согласно и зародышей пшеницы. [³⁵S] -меченные продукты трансляции анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Гель высушивали, экспонировали и оценивали количественно продукты трансляции сканированием автографов с помощью лазерного денситометра 2202 фирмы LKB. Наличие αβ -последовательности усиливало трансляцию гена НФТ1 в 30-40 раз в лизате ретикулоцитов кролика, в 10-14 раз в системе из клеток Кребс-2 и в 6-8 раз в экстрактах из зародышей пшеницы (таблица). Плазмиды, содержащие αβ -лидер и маркерный ген, получают следующим образом: по 5 нг олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих целевую последовательность и комплементарную ей последовательность, отжигают в 10 мкл буфера, который содержит 40 мМ Трис-НС1, рН 7,5; 6 мМ MgCl₂ и 1 мМ АТР при 56^оС в течение 2 ч. Олигодезоксирибонуклеотиды синтезируют на автоматическом синтезаторе фирмы Applied Biosystems (США). После отжига к смеси олигодезоксирибонуклеотидов добавляют 200 нг плазмиды pTZ19, содержащей ген НФТ 1 (препарат фирмы Pharmacia, Швеция). В реакционную смесь добавляют 1 ед. ДНК-лигазы фага Т4. Лигирование проводят при 10^оС в течение 12 ч. После лигирования полученным препаратом трансформируют клетки E. coli и выделяют из трансформантов рекомбинантные плазмиды. Ниже приведена первичная структура лидерных районов транскриптов αβ -НФТ1 и КМ.

5^l GAAAACUAAACCAUACACCAC- CAACACAACCAAACCCACCAC α -последовательность GCCCAAUUGUUACACACCCGCUUGA- GAAAGCAAGUCUAACAA AUG-НФТ 1 β - последовательность 5 l GGGAAAGCUUGGAUGCCUGC- CUGCAGGUGGACUCUAGAGGA- UCCCCC AUG-НФТ1 Указанные выше плазмиды, содержащие αβ -лидер и маркерный ген транскрибируют следующим образом: транскрипционная смесь объемом 20 мкл содержит 40 мМ Трис-НCl, рН 7,5; 6 мМ MgCl₂; 2 мМ спермидин; 10 мМ NaCl; 10 мМ дитиотреитол; по 1 мМ АТР, СТР, UTP и GTP; 20 ед. плацентарного ингибитора РНКаз и 1 мкг плазмидной ДНК. После добавления 10 ед. PНК-полимеразы бактериофага Т7 проводят инкубацию смеси при 37^оС в течение 60 мин. После реакции транскрипты осаждают ночь при 4^оС в присутствии 2 M LiCl. После центрифугирования осадок промывают 70% этанолом, высушивают и растворяют в стерильной воде. Трансляцию осуществляют в лизате ретикулоцитов кролика. Трансляционная смесь объемом 25 мкл содержит 10 мкл лизата: 20 мМ Нерев, рН 7,6; 1 мМ АТР; 200 мкМ GTP; 2,5 мМ ацетата магния; 100 мМ ацетат калия; 2 мМ дитиотрейтол; 15 мМ креатинфосфат; 1 мкг креатинфосфокиназа; 5 мМ сАМР; 2 мМ EGCTA; 3 мкг дрожжевой тРНК; по 125 мкМ аминокислот, исключая метионин; 800 мкCi/мл [³⁵S] -метионин и 40 мкг/мл РНК-транскрипта. Реакционную смесь инкубируют 60 мин при 30^оС. [³⁵S] -меченные продукты трансляции анализируют электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Гель высушивают, экспонируют и оценивают количественно продукты трансляции сканированием автографов с помощью лазерного денситометра 2202 фирмы LKB. Усиление трансляции достигает 40 раз (см. таблица).

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет обеспечить эффективное усиление трансляции чужеродного (бактериального) гена в эукариотической белоксинтезирующей системе, т. е. предложенный фрагмент генома ХВК является трансляционным усилителем широкого спектра действия. (56) Доклады АН СССР. 1988, т. 300, N 3, с. 711-716.

Формула изобретения

ФРАГМЕНТ РНК X-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ ТРАНСЛЯЦИИ ЧУЖЕРОДНОГО ГЕНА, получен путем химического синтеза и имеет следующую нуклеотидную последовательность: 1 GAAAACUAAA CCAUACACCA CCAACACAAC CAAACCCACC ACGCCCAAUU
51 GUUACACACC CGCUUGAGAA AGCAAGUCUA ACAA.

РИСУНКИ

Рисунок 1