Ген rs-ap из raphanus sativus, вектор для трансформации растений и способ получения трансгенного растения

 

Изобретение может быть использовано в селекции растений. Из Raphanus sativus выделен ген rs-ap, включающий область интрона, координирующий пептидный антибиотик. Трансформация растения этим геном обеспечивает придание ему устойчивости к фитопатогенам - грибам и бактериям. 3 с. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к генам растительных пептидных антибиотиков, активных против фитопатогенов, а также к содержащим их векторам и способам получения трансгенных растений и может быть использовано в селекции растений.

В настоящее время для создания растений с повышенной устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды используют природные растительные гены, экспрессирующие, в частности, белки с фитопатогенной активностью.

Известно несколько классов таких белков: хитиназы, β -1,3-глюканазы, рибосоминактивирующие белки, тионины, хитинсвязывающие лектины, перматины и дефензины. Последние по сравнению с другими защитными белками более активны, устойчивы во внешней среде и экологически безопасны. Дефензины являются короткими цистеинсодержащими белками, проявляющими фунгицидные и бактерицидные свойства. Они обнаружены в семенах и вегетативных органах различных растений и, выделенные из растений различных семейств, однотипны по организации и составу (Plant Physiol. 1995, V. 108, p. 1353-1358).

Среди известных на сегодняшний день дефензинов наибольшей активностью обладают дефензины, выделенные из растений редьки (Raphanus sativus) и названные Rs-AFP1 и Rs-AFP2.

Было показано, что растения табака, трансформированные конструкциями, содержащими ДНК, кодирующую белок Rs-AFP2, в условиях эксперимента проявляют устойчивость в отношении Alternaria longipes (Plant cell, 1995, V. 7, p. 573-588).

Введение в геном растений генов дефензинов, в частности выделенных из растений редьки, представляется весьма перспективным для получения растений с повышенной устойчивостью к фитопатогенам.

Известная трансформация растений осуществлялась с использованием последовательности нуклеотидов, полученной на основе кДНК. Для этого из суммарной мРНК семян растений редьки путем обратной транскрипции была получена кДНК, кодирующая белок Rs-AFP1. На ее основе сайт-направленым мутагенезом с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) получали полную кДНК, кодирующую белок RS-AFP2, которую под контролем 35S промотора, энхансера и терминатора вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) клонировали в вектор pBin19Ri. Полученной конструкцией трансформировали модельные растения табака (WO 93/05153, C 12 N 15/29, 1993).

Нужно отметить, что нуклеотидная последовательность кДНК не соответствует таковой природного гена защитного белка, так как в ней отсутствует интрон, наличие которого в кодирующей последовательности гена повышает уровень экспрессии защитного белка и стабильность гена в геноме трансгенных растений (Plant Cell Rep. 1996, V. 15, p. 489-494).

Задачи изобретения - получение гена, кодирующего пептидный антибиотик с уровнем экспрессии, достаточным для повышения устойчивости растений к поражению фитопатогенами, создание векторной конструкции для введения такого гена в геном растения, а также обеспечение более простого способа получения растений, устойчивых к фитопатогенам.

Поставленные задачи решаются тем, что ген rs-ap пептидного антибиотика из R. sativus содержит интрон внутри 22-го кодирующего триплета и представлен последовательностью нуклеотидов SEQ ID N 1 или последовательностью SEQ ID N 1, имеющей в кодирующей части делеции, замещения или инсерции нуклеотидов, при которых кодируемый продукт сохраняет свойства пептидного антибиотика, а также тем, что для трансформации растений используют вектор, содержащий ген rs-ap пептидного антибиотика из R. sativus с последовательностью нуклеотидов SEQ ID N 1 или последовательостью SEQ ID N 1, имеющей в кодирующей части делеции, замещения или инсерции нуклеотидов, соединенный с регуляторными последовательностями, обеспечивающими его экспрессию в клетках растений. Ген rs-ap пептидного антибиотика из R. sativus соединен с регуляторными последовательностями для экспрессии в растении и включен в виде HindIII-фрагмента в составе рекомбинантной плазмидной ДНК pK22rs, содержащей также ДНК векторной плазмиды pH22Kneo с сайтами рестрикции SacI, KpnI, BamHI, XbaI и nptII-ген в качестве генетического маркера. Задача получения трансгенного растения, устойчивого к фитопатогенам, решается тем, что геном растения трансформируют вектором для трансформации растений, включающим ген rs-ap пептидного антибиотика из R. sativus, который содержит интрон внутри 22-го кодирующего триплета и представлен последовательностью нуклеотидов SEQ ID N 1, или последовательостью SEQ ID N 1, имеющей в кодирующей части делеции, замещения или инсерции нуклеотидов, при которых кодируемый продукт сохраняет свойства пептидного антибиотика, причем указанный ген соединен с регуляторными последовательностями, обеспечивающими его экспрессию в клетках растений, при этом вектор может включать ген пептидного антибиотика в виде HindIII-фрагмента в составе рекомбинантной плазмидной ДНК pK22rs, содержащей также ДНК векторной плазмиды pH22Kneo с сайтами рестрикции SacI, KpnI, BamHI, XbaI и nptII-ген в качестве генетического маркера.

На чертеже показан вектор pK22rs для трансформации растений.

Последовательность нуклеотидов SEQ ID N 1 приведена в перечне последовательностей, приложенном к описанию изобретения.

Наличие интрона в последовательности нуклеотидов гена rs-ap пептидного антибиотика из R. sativus способствовало повышению уровня экспрессии в растении токсичного для фитопатогенов белка.

Использование вектора по настоящему изобретению позволяет достаточно простым путем вводить ген rs-ap в геном растений для повышения устойчивости последних к грибным и бактериальным фитопатогенам.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Выделение гена пептидного антибиотика rs-ap.

Выделение rs-ap-гена проводят следующим образом: из листьев растений редьки (R. sativus) выделяют суммарную ДНК по методике с применением STAB-буфера (Дрейпер Дж. и др. Генная инженерия растений. М., Мир, 1991). Затем методом полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров состава 5'-ctaggaattcgtagtgatcatggctaagtttgcttctatc-3' и 5'-tgctctagagttaacaagggaaataacagatacacttg-3' (комплементарных соответственно начальной и концевой части кДНК, кодирующей Rs-AFP2 белок), амплифицируют последовательность нуклеотидов. Реакцию проводят в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мг выделенной ДНК, 10 пкМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCl буфера (pH 8,8 при 25^oC), 15 мМ сульфата аммония, 2,5 мМ хлористого магния, 0,01% Твин-20, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. Taq-полимеразы. Реакцию амплификации проводят под вазелиновым маслом в течение 30 циклов: 94^oC - 1 мин, 50^oC - 2 мин и 72^oC - 2 мин. Продукты амплификации разделяют с помощью электрофореза в геле 1% агарозы, окрашивают раствором бромистого этидия и фрагмент ДНК размером 300-400 н.п. вырезают и выделяют из геля с помощью электроэлюции. ДНК осаждают с помощью двух объемов этанола и растворяют в бидистиллированной воде. Полученную ДНК клонируют по сайтам рестрикции EcoRI и XbaI в плазмиде pGEM3Z и секвенируют по методу Сэнгера для определения ее первичной структуры (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463).

Полученная ДНК обозначена как SEQ ID N 1 и состоит из 432 н.п., включает в себя ген rs-ар, состоящий из 312 н.п. и интрон, состоящий из 91 н.п. Путем направленного сайт-мутагенеза в кодирующей части последовательности нуклеотидов SEQ ID N 1 получены делеции нуклеотидов в области 8-10 и 29-30 триплетов, замещения нуклеотидов в 13, 16, 17, 21, 23, 26, 32, 35, 37, 60, 62, 64, 67, 69, 77-78 триплетах и инсерции нуклеотидов в области 7-8 триплетов.

Пример 2. Конструирование вектора pK22rs.

Для конструирования вектора, обеспечивающего перенос гена rs-ap в растения и такую экспрессию этого гена, которая позволила бы придавать трансгенным растениям устойчивость к фитопатогенам, использовали элементы плазмид pRT104 и pH22Kneo.

Плазмида pRT104 содержит последовательности растительного промотора 35S и терминатора гена VI вируса мозаики цветной капусты, которые определяют эффективную экспрессию гетерологичных генов в растениях (Nucl. Acid Res., 1987, V. 15, P. 5890).

Плазмида pH22Kneo представляет собой бинарный вектор для агробактериальной трансформации растений. Агробактериальная трансформация - наиболее эффективный способ переноса целевых генов в растения для последующей экспрессии. Плазмида pH22Kneo способна к репликации в агробактериях и содержит mobA-oriT систему природной плазмиды pRSF1010, которая позволяет осуществлять VirD2-независимый перенос целевого гена в ядро растительной клетки, что повышает эффективность трансформации растений. Плазмида pH22Kneo несет также уникальные сайты рестрикции BamHI, SacI, KpnI, HindIII, XbaI которые можно использовать для клонирования дополнительных маркерных и целевых генов для придания трансгенным растениям дополнительных полезных признаков. Маркерным геном для селекции pH22Kneo в бактериях и растениях служит ген неомицинфосфотрансферазы nptII (Мол. биол., 1996, т. 30, в. 2, с. 458-464).

С целью создания вектора для переноса гена rs-ap в растения, ДНК плазмиды pGEM3Zrs и ДНК плазмиды pRT104, несущую сайты рестрикции EcoRI и XbaI между последовательностями промотора 35S и терминатора гена VI ВМЦ, гидролизуют рестриктационными эндонуклеазами EcoRI и XbaI при 37^oC в буфере M, содержащем 10 мМ трис-HCl (pH 7,5), 10 мМ хлористого магния, 1 мМ дитиотрейтола, 50 мМ хлорида натрия. Продукты рестрикции разделяют с помощью электрофореза в геле 1% агарозы, окрашивают раствором бромистого этидия и фрагменты ДНК, соответствующие гену rs-ap и линеаризованной плазмиде pRT104, вырезают, выделяют из геля с помощью электроэлюции и смешивают. Полученную смесь рестрикционных фрагментов лигируют с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Лигирование проводят в течение 10-15 мин при комнатной температуре, а затем - при 12^oC в течение 10 ч. Лигированную ДНК используют для трансформации клеток E. coli CA161, характеризуемых наличием генотипа Hfr4, thi1, rel1, lac122, lacz13, supc70, по стандартной методике с использованием хлористого кальция. Трансформированные клетки отбирают на агаризованной среде LB с ампициллином (100 мкг/мл). Плазмидную ДНК из ампициллин-устойчивых колоний выделяют с помощью щелочного лизиса, анализируют с помощью гидролиза рестриктазами EcoRI и XbaI и отбирают конструкцию, содержащую в своем составе кодирующую последовательность гена пептидного антибиотика rs-ap между промотором и терминатором, обозначаемую как pRT104rs. Бактерии, содержащие плазмиду pRT104rs, выращивают на жидкой среде LB, лизируют и выделяют плазмидную ДНК (Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984).

Выделенную плазмиду pRT104rs и бинарный вектор pH22Kneo гидролизуют рестрикционной эндонуклеазой Hindlll при 37^oC в буфере M. Hindlll-фрагмент из плазмиды pRT104rs, включающий в себя последовательности 35S промотора, гена rs-ap и терминатора гена VI ВМЦК, определяют в геле 1% агарозы, вырезают, подвергают электроэлюции, осаждают этанолом и растворяют в бидистиллированной воде.

Гидролизат pH22Kneo и полученный HindIII-фрагмент объединяют с помощью ДНК-лигазы, как описано выше. Лигированной ДНК трансформируют клетки E. coli CA161 с помощью электропорации. Трансформированные клетки выращивают на агаризованной среде LB с канамицином (50 мкг/мл). Устойчивые колонии отбирают из полученных клонов, выделяют плазмидную ДНК и проводят рестрикционный анализ, используя эндонуклеазу HindIII. С помощью электрофореза отбирают плазмиды, которые включают в себя вектор pH22Kneo размером 8510 н.п. и HindIII-фрагмент размером 1030 н.п. Последовательность нуклеотидов гена rs-ap под контролем 35S промотора и терминатора гена VI вируса мозаики цветной капусты в клонированном HindIII-фрагменте определяют с помощью секвенирования по Сэнгеру. Полученную рекомбинантную плазмиду, содержащую ген пептидного антибиотика rs-ap под контролем регуляторных последовательностей из pRT104, а также элементы вектора pH22Kneo обозначают как pK22rs.

При конструировании вектора pK22rs использовали последовательность нуклеотидов SEQ ID N 1, а также последовательность SEQ ID N 1, имеющую в кодирующей части делеции, замещения или инсерции нуклеотидов.

Для трансформации растений использовали вектор, который содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID N 1, а также вектор с последовательностью SEQ ID N 1, имеющей в кодирующей части делеции, замещения или инсерции нуклеотидов.

Пример 3. Трансформация растений с использованием вектора pK22rs и анализ включения гена rs-ap в геном трансформированных растений и его экспрессии в них.

Трансформацию проводят на растениях табака, томатов, картофеля, рапса, капусты, огурцов, моркови, яблони и груши. В качестве объектов трансформации могут быть использованы и другие двудольные растения.

Для этого вектор pK22rs вводят в Agrobacterium tumefaciens, например, в штамм C58C1 pGV3850 методом прямой трансформации (An G., Ebert P.R., Mitra A. , Ha S.B. // Binary vectors. Plant molecular biology manual /Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Verma D.P.S., Eds/ Dodrecht: Kluwer Acad. Publ, 1988. P. 1-1) В результате получен штамм A. tumefaciens LGV3850/pK22rs, с помощью которого инфицировали экспланты (0,5-1,0 см фрагменты листьев, стеблей или семядолей) растений, выращенных в условиях in vitro.

Контролем служили растительные экспланты, не инфицированные с помощью штамма A. tumefaciens LGV3850/pK22rs. Проверку на трансгенность проводят с помощью методов ПЦР и вестерн-блоттинга.

Для трансформации табака и томатов использовали векторы с последовательностью нуклеотидов SEQ ID N 1 и последовательностью SEQ ID N 1, имеющей в кодирующей части делеции, замещения или инсерции нуклеотидов.

Трансформацию растений картофеля, рапса, капусты, огурцов, моркови, яблони, груши проводили с помощью вектора, содержащего последовательность нуклеотидов SEQ ID N 1.

Первичный отбор растений трансформантов проводят по устойчивости к канамицину. Выделение ДНК из отобранных растений проводят, как описано в примере 1. Наличие гена rs-ap в растениях определяют методом ПЦР в течение 30 циклов: 94^oC - 0,30 мин, 52^oC - 1 мин, 72^oC - 1 мин. Предварительно растения выращивают на среде MS без цефотаксима для того, чтобы исключить из анализа не трансгенные растения, дающие положительный результат по ПЦР за счет остаточной контаминации агробактериями.

В связи с тем, что в исследуемых растениях могут присутствовать собственные гены пептидных антибиотиков, гомологичные гену rs-ap, для корректной идентификации трансгенных растений методом ПЦР используют праймеры, комплементарные промоторной области 35S вируса мозаики цветной капусты 5'-ctgccgacagtggtcccaaagatggaccc-3' и концевому участку гена rs-ap 5'-tgctctagagttaacaagggaaataacagatacacttg-3'.

Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в геле 1% агарозы, окрашенном бромистым этидием.

Эффективность трансформации агробактериальным штаммом LGV3850/pK22rs (с последовательностью нуклеотидов SEQ ID N 1) у растений томата составила 5,7%, у табака - 10,9%, у груши - 25,3-35,7%, у рапса - 3,5%. А эффективность трансформации агробактериальным штаммом LGV3850/pK22rs (с последовательностью нуклеотидов SEQ ID N 1, имеющей делеции, замещения или инсерции) у растений томата составила 5,2%, у табака - 9,9%.

Экспрессию гена rs-ap в трансгенных растениях, отобранных по ПЦР, определяют методом вестерн-блоттинга (Promega Protocols and Application Guide. Second edition. Madison, USA, 1991, 262-265) с поликлональными антителами кролика к гибридному Rs-AP-тиоредоксин белку. В четырех из шести линий томата, в двух из шести линий табака, в трех из восьми линий рапса был обнаружен продукт гена rs-ap (последовательность нуклеотидов SEQ ID N 1). И в трех из пяти линий томата, в четырех из шести линий табака был обнаружен продукт гена rs-ap с последовательностью нуклеотидов SEQ ID N 1, имеющей делеции, замещения или инсерции.

Пример 4. Биотесты с белковыми экстрактами из трансгенных растений.

Экстракты белка из трансгенных растений, в которых был обнаружен продукт гена rs-ap, готовят как описано в WO 93/05153, C 12 N 15/29, 1993.

Активность экстракта белка из трансгенных растений, содержащих ген rs-ap, определяли на таких фитопатогенных грибах, как Alternaria solani, Phytophtora infestans, Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae и Fusarium lateritium, вызывающих альтернариоз, фитофтороз, гниль, увядание и фузариоз соответственно.

Биотесты проводят следующим образом.

В лунки микрокюветы наносят по 10 мкл суспензии спор имеющихся фитопатогенных грибов (10⁵ спор/мл), 30 мкл разбавленного в 2 раза картофельного бульона и по 20 мкл неочищенных белковых экстрактов из трансгенных и контрольных (нетрансформированных) растений томатов. Объем доводят до 100 мкл стерильной водой. Содержимое лунок ресуспендируют, отстаивают в течение 30 мин для осаждения спор и измеряют оптическую плотность при λ = 540 нм. Затем микрокюветы инкубируют в течение 48 ч при комнатной температуре на качалке (при 130 об./мин) и повторно измеряют оптическую плотность содержимого лунок при λ = 540 нм. Степень ингибирования роста гриба (IG) определяют по формуле IG = (dAk-dAt)/dAk, где dAk - изменение оптической плотности в "пустой" лунке (без экстракта), dAt - изменение оптической плотности в лунке с экстрактом.

Средние арифметические значения IG для трансгенных линий томата, содержащих ген rs-ap с последовательностью нуклеотидов SEQ ID N 1, варьируют в пределах от 5,1 до 6,6 для A. solani (контроль - 2,0), от 2,3 до 2,5 для P. infestans (контроль - 1,2), от 2,7 до 3,3 для R. solani (контроль - 1,9), от 4,8 до 5,6 для V. dahliae (контроль - 1,2) и от 2,8 до 3,3 для F. lateritium (контроль - 1,2), что свидетельствует о подавлении роста патогенных грибов экстрактом белка, выделенным из трансгенных растений.

Средние арифметические значения IG для трансгенных линий томата, содержащих ген rs-ap с последовательностью нуклеотидов SEQ ID N 1, имеющей делеции, замещения или инсерции, варьируют в пределах от 6,5 до 7,0 для A. solani, от 2,0 до 2,2 для P. infestans, от 4,7 до 5,3 для R. solani, от 3,8 до 5,0 для V. dahliae и от 2,2 до 3,3 для F. lateritium, что свидетельствует о сохранении продуктом данного гена свойств пептидного антибиотика.

Белковые экстракты из трансгенных растений табака с геном rs-ap с последовательностью нуклеотидов SEQ ID N 1, имеющей делеции, замещения или инсерции проверяли на токсичность по отношению к фитопатогенным бактериям. В качестве тест-объекта использовали Xanthomonas campestris - возбудителя сосудистого бактериоза. В качестве контроля использовали белковый экстракт из нетрансформированных растений табака.

По 300 мкл белковых экстрактов из опытных и контрольных растений добавляют в пробирки с культурой клеток X. campestris, выращенную на жидкой среде LB до концентрации, соответствующей оптическому поглощению 0,4 оптических единиц (О. Е.) при λ = 600 нм. Затем бактерии инкубируют при интенсивной аэрации при 25^oC до тех пор, пока плотность контрольной культуры не достигнет 0,8 О.Е. Полученные бактериальные суспензии разбавляют в 10⁵ раз средой LB и высевают по 20 мкл на агаризованную среду LB. Количество жизнеспособных колоний с добавлением экстракта контрольных растений в два раза превышает количество колоний с добавлением экстракта растений, трансформированных геном rs-ap, что свидетельствуют о подавлении роста бактерий продуктом данного гена.

Пример 5. Биотесты на устойчивость к грибным фитопатогенам трансгенных растений, экспрессирующих ген rs-ap.

Опыты проводили на изолированных листьях трансгенных томатов, экспрессирующих продукт гена rs-ap с последовательностью SEQ ID N 1. В качестве тест-культуры использовали фитопатогенные грибы видов Altemaria tenuis и A. solani, вызывающие пятнистость листьев и раннюю гниль соответственно. Молодые листья (3-й сверху) 8-10-недельных растений помещали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, увлажненную раствором кинетина (10 мг/л). По 5 мкл суспензии спор возбудителя, содержащей 10 спор/мл, наносили в 4 точки на лист, после чего чашки с листьями герметично закрывали для создания повышенной влажности и выдерживали в климокамере при температуре 25^oC и 16-часовом световом дне. В качестве контроля использовали листья нетрансформированных растений томатов. Результаты оценивали по количеству и размеру некротических пятен на листьях на 7 сутки после заражения.

Были выявлены устойчивые трансгенные линии томатов, у которых средняя площадь некротизированных участков и их число были в 2 раза меньше, чем у контрольных растений, что говорит об устойчивости трансгенных томатов, экспрессирующих продукт гена rs-ap, к Altemaria solani и Altenaria tenuis.

Для оценки устойчивости трансгенных томатов к фитофторозу и мучнистой росе, двухмесячные растения, экспрессирующие ген rs-ap с последовательностью нуклеотидов SEQ ID N 1, имеющей делеции, замещения или инсерции, выращивают на провокационном фоне в присутствии вирулентной расы T1 Phytophthora infestans и расы 5 Oidium erysiphoides в закрытой теплице. Степень поражения фитофторой определяли по десятибалльной шкале. На 10 день после помещения растений на инфекционный фон трансгенные линии проявляли высокую степень устойчивости (8-9 баллов) по сравнению с контрольными растениями (5 баллов), на 24 день - устойчивость снижалась (у контрольных - 1 балл, у опытных - 3 балла). Устойчивость к мучнистой росе оценивали по пятибалльной шкале. У двух исследованных линий трансгенных томатов симптомы заболевания появлялись на 22-24 день (у контрольных растений - на 10-й день), а процент поражения распределялся следующим образом: 20-33% - неустойчивых растений (0-1 балл), 15-17% - слабоустойчивых растений (2-3 балла) и 50-60% устойчивых растений (4-5 баллов). При этом наблюдаемая задержка инфекционного процесса у трансгенных томатов позволила растениям в условиях высокой инфекционной нагрузки сформировать урожай, в то время как контрольные растения погибли, не успев дать плодов.

Формула изобретения

1. Ген rs-ар пептидного антибиотика из Raphanus sativus, содержащий интрон внутри 22-го кодирующего триплета и представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID 1 или последовательностью SEQ ID 1, имеющей в кодирующей части делеции, замещения или инсерции нуклеотидов, при которых кодируемый продукт сохраняет свойства пептидного антибиотика.

2. Вектор для трансформации растений, содержащий ген по п.1, соединенный с регуляторными последовательностями, обеспечивающими его экспрессию в клетках растения.

3. Вектор по п.2, отличающийся тем, что ген петидного антибиотика, соединенный с регуляторными последовательностями для экспрессии в растении, включен в него в виде HindIII- фрагмента в составе рекомбинантной плазмидной ДНК рК22rs, содержащей также ДНК векторной плазмиды рН22 Кneo с сайтами рестрикции SacI Kpnl, BamНI, XbaI и прtII-ген в качестве генетического маркера.

4. Способ получения трансгенного растения, устойчивого к фитопатогенам, включающий трансформацию генома растения вектором по п.2 или 3.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2