Противовирусная композиция

 

Использование: медицина и ветеринария. Цель: повышение эффективности композиции и расширение спектра ее применения. Сущность изобретения: композиция синергетического действия содержит панкреатические ферменты дезоксирибонуклеазу и рибонуклеазу, взятые в соотношении 1 : 1, водорастворимую соль магния и фармацевтически пригодный наполнитель. Положительный эффект: композиция отличается повышенной эффективностью и широкой областью применения, ее введение обеспечивает лечение вирусных заболеваний, когда природа вируса не установлена или заболевание вызвано ассоциацией ДНК-И РНК-содержащих вирусов. 2 табл.

Изобретение относится к медицине, ветеринарии, биотехнологии.

Известен ряд композиций, обладающих способностью подавлять размножение вирусов человека, животных, растений. Большинство таких препаратов является антиметаболитами - аналогами нуклеозидов или входящих в их состав азотистых оснований (5-иододезоксиуридин, арабинозидцитозин, ацикловир).

Известны также природные ингибиторы размножения вирусов - интерфероны, антисыворотки, профилактические вакцины.

Основными недостатками этих препаратов являются ограниченность спектра их противовирусного действия и наличие побочных эффектов. Антиметаболиты включаются в состав не только вирусных, но и клеточных нуклеиновых кислот или влияют на их синтез и эффективны только против небольшого числа патогенных вирусов. Интерфероны же слабо подавляют размножение большинства вирусов, а число противовирусных антисывороток и вакцин весьма ограничено.

Перспективными являются противовирусные композиции, содержащие нуклеазы- ферменты, расщепляющие фосфодиэфирные связи между нуклеотидами в вирусных ДНК - дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы) и вирусных РНК - рибонуклеазы (РНК-азы).

Известна, например, противовирусная композиция, содержащая ферменты лизоцим и рибонуклеазы и фармацевтически приемлемый наполнитель.

Недостатком данной композиции является ограниченность ее использования для лечения только наружных кожных заболеваний, вызванных РНК-содержащими вирусами.

Известна композиция для лечения и профилактики вирусных респираторных заболеваний животных, содержащая трипсин, ДНК-азу, сульфат магния и изотонический раствор хлорида натрия.

Больных телят в возрасте 2-4 мес подвергают аэрозольной обработке данной композицией в течение 30 мин двукратно через день. При этом трипсин и ДНК-азу берут из расчета по 25 мг на 1 куб. м камеры; для аэрозольной обработки общий расход ферментов составляет 1 г.

Недостатками известной композиции являются слабая эффективность профилактики вирусных заболеваний, составляющая 22-46% ; большой расход ферментов, составляющих композицию (1 г); необходимость предварительного типирования вирусной инфекции (а это занимает срок 10-14 дней), так как композиция ингибирует только ДНК-содержащие вирусы.

Наиболее близкой к предлагаемой композиции прототипом (4) является композиция для лечения герпетических кератитов и кератоувеитов, содержащая, мас. % : ДНК-азу 0,002 Фармацевтический при- емлемый наполнитель Остальное В качестве наполнителя используют дистиллированную воду, изотонический раствор хлорида натрия или 0,5% -ный раствор новокаина.

Для лечения герпетических кератитов 0,5 мл композиции вводят под конъюктиву пораженного глаза ежедневно в течение 2-4 недель. Одновременно такой же раствор закапывают в конъюктивный мешок по 2-3 капли 3-4 раза в день. Курс лечения 8-14 дней, однако для профилактики рецидивов композицию вводят еще 6-10 дней после стойкого клинического улучшения.

Недостатками прототипа является ограниченность применения композиции для лечения заболеваний, вызываемых только ДНК-содержащими вирусами.

Целью изобретения является повышение противовирусной эффективности композиции и расширение спектра ее применения.

Поставленная цель достигается предлагаемой композицией, содержащей следующие компоненты, мас. % : Дезоксирибонуклеаза 0,1-0,5 Рибонуклеаза 0,1-0,5 Водорастворимая соль магния 0,005-0,04 Наполнитель Остальное Препарат ДНК-аза выпускается в виде лиофильно высушенного порошка белого цвета во флаконах по 25 мг с удельной активностью 5-7 тыс. ед. акт/г хорошо растворим в воде, не растворим в органических растворителях, малотоксичен, не раздражает кожу и слизистые оболочки глаз.

Препарат РНК-азы, упакованный герметично в стеклянный флакон, может храниться без потери активности при 3+5^оС в течение двух лет.

Препарат РНК-аза выпускается в виде лиофильно высушенного порошка белого цвета во флаконах по 25 мг с удельной активностью 5-7 тыс. ед. акт/г и имеет физико-химические характеристики, аналогичные ДНК-азе.

Композиция представляет собой бесцветный водный раствор, пригодный для наружного и внутреннего применения.

Наполнителем для данной композиции могут служить стерильная дистиллированная вода, физиологический раствор или 0,5% -ный раствор новокаина.

Водорастворимая соль магния, преимущественно хлористый магний (MgCl₂), необходима для активации ферментативной активности ДНК-азы, так как ионы магния являются активаторами ДНК-азы. Эксперименты показали, что ДНК-аза имеет наибольшую активность при использовании MgCl₂ в концентрации 0,005-0,04% или 0,0025-0,02 М.

Определяющим существенным отличием предлагаемой композиции является содержание в ней смеси ДНК-азы и РНК-азы, взятых в экспериментально подобранной оптимальной концентрации, что позволяет повысить эффективность композиции и расширить сферу ее применения за счет обеспечения возможности одномоментного ингибирования у человека и животных РНК- и ДНК-содержащих вирусов.

ДНК-аза может расщеплять ДНК большинства ДНК-содержащих вирусов, подавлять их репродукцию, тогда как РНК-аза может по этой же причине подавлять репродукцию большинства РНК-содержащих вирусов. При этом ДНК-аза и РНК-аза не подавляют синтез клеточных ДНК и РНК, не нарушают процессы транскрипции и трансляции, не обладают мутагенным, тератогенным и иными токсикологическими эффектами. Отсутствие повреждающего клетки действия ДНК-азы и РНК-азы связано с тем, что как все большие молекулы, эти ферменты проникают в клетки путем эндоцитоза и в эндосомах они изолированы от клеточных структур. Вирусы также проникают в клетки, в большинстве случаев за счет эндоцитоза. Нуклеазные вирусные частицы обнаруживаются в одних эндосомах внутри клетки, где вирусная нуклеиновая кислота освобождается от защитной белковой оболочки и становится доступной действию нуклеаз, нарушающих их целостность и способность к репликации.

Композиция из ДНК-азы и РНК-азы имеет также существенные дополнительные преимущества.

В ряде случаев установленные природы вируса, вызвавшего заболевание, затруднено. Поскольку все вирусы являются только ДНК- или РНК-содержащими, то введение больным композиции из двух этих ферментов может обеспечить успех лечения даже если вирус, вызвавший заболевание, не идентифицирован.

Известны заболевания человека и животных, которые вызваны ассоциацией ДНК- и РНК-содержащих вирусов. Очевидно, что в этих случаях также только одновременное введение ДНК-азы и РНК-азы может оказать лечебное действие.

Экспериментально было установлено, что ДНК-аза и РНК-аза в предлагаемой композиции вступают в синергизм, так как эффект подавления репродукции вирусов выше, чем если на каждый из них действует только ДНК-аза и РНК-аза.

В таблице 1 представлены данные об эффективности композиции как средства подавления размножения ДНК и РНК-содержащих вирусов в культуре клеток куриных эмбрионов.

Предлагаемая композиция может быть применена для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ДНК-содержащими вирусами (герпес зостер, герпетические кератиты, инфекционный мононуклеоз, эденовирусные конъюктивиты и др. ) и РНК-содержащими вирусами (вирусные эрцефалиты, менингиты, энтериты и др. ).

В связи с тем, что в известных патентных и научно-технических источниках сведений об одновременном использовании ДНК-азы и РНК-азы в составе противовирусных композиций не обнаружено, можно сделать вывод, что заявляемое техническое решение отвечает критериям "новизна и изобретательский уровень". Примеры конкретного выполнения.

П р и м е р 1. Куриные фибробласты заражали ДНК-содержащим вирусом осповакцины (ВОВ) или РНК-содержащим вирусом птичьей чумы (ВПЧ) и исследовали влияние на репродукцию этих вирусов ДНК-азы, РНК-азы или композиции из обоих этих ферментов. Клетки куриных фибробластов выращивали на среде, которая содержала гидролизат лактоальбумина и 199 среду (1: 1) и 10% сыворотку телят. Через 2 дня, когда монослой достигал концентрации около 600˙10³ клеток на мл, исходную среду замещали средой без сыворотки телят и во флаконы с клетками добавляли суспензию вируса (0,2 мл) в разведении от 10^-4 до 10^-8 на 60 мин для адсорбции. После этого содержащую вирусы среду отсасывали и замещали свободной от вирусов средой, содержащей ДНК-азу или РНК-азу в концентрации по 0,5 мг/мл или композицию из ДНК-азы и РНК-азы по 0,5 кг/мл каждой. Клетки, зараженные ВОВ или ВПЧ, инкубировали в среде с ферментами на протяжении всего периода репродукции вируса, который составлял 2-3 суток. Концентрацию вируса в среде, которую определяли по окончании этого периода инкубации, выражали в ед. БОБ (бляшкообразующих единиц) (см. табл. 1).

Из данных табл. 1 видно, что ДНК-аза эффективней подавляет репродукцию ДНК-содержащего вируса - ВОВ, а РНК-аза сильнее тормозит репродукцию РНК-содержащего вируса - ВПЧ. Однако композиция, содержащая ДНК-азу и РНК-азу превосходит по эффективности подавления репродукции вирусов ДНК-азу и РНК-азу, применение по отдельности.

П р и м е р 2. Этот пример иллюстрирует эффективность предлагаемой композиции в лечении животных, зараженных ДНК- или РНК-содержащими вирусами. У собак ДНК-содержащие паровирусы вызывают тяжелые энтериты и миокардиты, которые быстро ведут к гибели животных. Гибель животных чаще всего наступает и при заболевании чумкой, вызываемой РНК-содержащими микровирусами.

Наблюдение проводили на собаках, у которых диагноз был поставлен на основании клинических симптомов.

Животным внутримышечно вводили композицию, содержащую, мас. % : ДНК-аза 0,1 РНК-аза 0,1 Магний хлористый 0,005 Изотонический раствор хлористого натрия Остальное два раза в день в течение 3-4 дней по 10 мл.

В контрольных группах вводили только РНК-азу или ДНК-азу по такой же схеме. Введение нуклеаз сочетали с введением бициллина, содержащем 600 тыс. ед. акт. один раз в день в течение 3-4 дней, поскольку вирусная инфекция в большинстве случаев осложняется бактериальной.

В табл. 2 представлены результаты применения данной композиции.

Из данных табл. 2 видно, что только предлагаемая композиция обеспечивает извлечение этих вирусных заболеваний, вызывающих в большинстве случаев гибель животных.

П р и м е р 3. У детей, склонных к респираторным заболеваниям, из специального детского садика ослабленного контингента, проводили наблюдение по профилактике респираторных вирусных заболеваний с помощью композиции, содержащей ДНК-азу и РНК-азу. Респираторные заболевания вызывают ДНК-содержащие вирусы, разные штаммы аденовирусов, и РНК-содержащие вирусы Коксакки, пиновирусы, ЕСНО вирусы, вирусы парагриппа, гриппа и др. Две группы детей в возрасте 4,5-5 лет по 35 в каждой, при примерно равном числе мальчиков и девочек в группе, были под наблюдением.

Обычно каждый из таких детей в течение поздней осени и зимы болел 2-3 раза респираторными вирусными заболеваниями. Дети одной группы получали еженедельно ингаляцию композиции ДНК-азы с РНК-азой. Дети в контрольной группе получали ингаляции таким же раствором, но не содержащем нуклеаз.

На протяжении трех месяцев наблюдения с начала ноября до конца января среди детей контрольной группы имело место две вспышки респираторных заболеваний и некоторые из детей переболели дважды. В результате этого общее число респираторных заболеваний в этой группе достигало 46. Среди детей, получавших аэрозоли композиции ДНК-азы с РНК-азой, имело место только два случая респираторных заболеваний, несмотря на контакты между детьми обеих групп.

Использование предлагаемой композиции позволяет повысить эффективность профилактики и лечения вирусных заболеваний различной природы за счет синергического эффекта; исключить необходимость типирования вирусной инфекции при вспышках вирусных заболеваний; расширить область применения композиции для лечения заболеваний, вызываемых как ДНК-, так и РНК-содержащими вирусами.

Композиция проста в приготовлении и доступна для массового использования, поскольку ДНК-аза и РНК-аза выпускаются промышленностью.

Формула изобретения

ПРОТИВОВИРУСНАЯ КОМПОЗИЦИЯ, содержащая дезоксирибонуклеазу и фармацевтически приемлемый наполнитель, отличающаяся тем, что, с целью повышения эффективности композиции и расширения спектра ее применения, она дополнительно содержит рибонуклеазу и водорастворимую соль магния при следующем содержании компонентов, мас. % : Дезоксирибонуклеаза 0,01 - 0,03 Рибонуклеаза 0,01 - 0,03 Водорастворимая соль магния 0,005 - 0,04
Наполнитель Остальное

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2